Tìm hiểu các kỹ thuật kiểm soát chất lượng sản phẩm nectar quả hỗn hợp

Sử dụng huyết tương thỏ khô có bán sẵn và hồi nước theo các chỉ dẫn của nhà sản xuất. Nếu không sẵn có huyết tương thỏ khô, thì pha loãng một thể tích của huyết tương thỏ vô trùng tươi với ba thể tích nước vô trùng. Nếu kali xitrat hoặc natri xitrat được sử dụng làm chất chống đông vón huyết tương, thì thêm dung dịch EDTA (axit etylenediaminetetraaxetic) để có được dung dịch 0,1 % EDTA trong huyết tương đã hồi nước hoặc huyết tương đã pha loãng. Huyết tương đã hồi nước hoặc huyết tương đã pha loãng phải được dùng ngay, trừ khi có quy định của nhà sản xuất. Trước khi sử dụng, kiểm tra từ mẻ huyết tương với các chủng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase và staphylococci phản ứng âm tính với coagulase. 3.6.10. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh CHÚ THÍCH: Có thể dùng dụng cụ thủy tinh sử dụng một lần thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu chúng có các đặc tính thích hợp. Sử dụng thiết bị, dụng cụ của phòng thí nghiệm vi sinh vật thông thường Xem TCVN 6404 (ISO 7218) và cụ thể là: Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) và khử trùng ướt (nồi hấp áp lực) Tủ ấm, để duy trì môi trường đã cấy, các đĩa và ống ở trong dải nhiệt độ 35 C ± 1 C hoặc 37 C ± 1 C. Tủ sấy hoặc tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ từ 25 C ± 1 C đến 50 C ± 1 C. Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự, có thể duy trì được nhiệt độ ở 47 C ± 2 C. Ống nghiệm, bình hoặc lọ có nắp vặn, có dung tích thích hợp để khử trùng, bảo quản môi trường cấy và ủ môi trường dạng lỏng; đặc biệt, các ống đựng dung dịch hồng cầu vô trùng, hoặc các lọ đáy tròn có kích thước khoảng 10 mm x 75 mm. Đĩa Petri, vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo. Que cấy thẳng và pipet Pasteur. Pipet chia độ xả hết, có dung tích danh định 1 ml, 2 ml và 10 ml, được chia vạch tương ứng 0,1 ml, 0,1 ml và 0,5 ml. Dụng cụ dàn mẫu, vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo. pH mét, có thể đọc chính xác đến 0,01 đơn vị pH ở 25 C, có thể đo chính xác đến ± 0,1 đơn vị pH. 3.6.11. Lấy mẫu Việc lấy mẫu không quy định trong tiêu chuẩn này. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng về lấy mẫu cho sản phẩm tương ứng, thì các bên có liên quan tự thỏa thuận về vấn đề này. Điều quan trọng là phòng thí nghiệm nhận được đúng mẫu đại diện và không bị hư hỏng hoặc biến đổi trong suốt quá trình bảo quản hoặc vận chuyển. 3.6.12. Chuẩn bị mẫu thử Việc chuẩn bị mẫu thử theo tiêu chuẩn riêng phù hợp với các sản phẩm tương ứng. Nếu chưa có tiêu chuẩn riêng, thì các bên có liên quan tự thỏa thuận về vấn đề này. 3.6.12.1. Cách tiến hành Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng Xem TCVN 65071 (ISO 68871) và tiêu chuẩn riêng phù hợp với sản phẩm liên quan. Cấy Dùng pipet vô trùng chuyển vào hai đĩa thạchmỗi đĩa 0,1 ml mẫu thử nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc 0,1 ml huyền phù ban đầu (độ pha loãng 101) nếu sản phẩm ở dạng khác. Lặp lại trình tự này đối với độ pha loãng 102 và các độ pha loãng thập phân tiếp theo nếu cần. Đối với sản phẩm nhất định, tốt nhất để đếm staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase với số lượng thấp, thì các giới hạn phát hiện có thể tăng lên 10 lần bằng cách cấy 1,0 ml mẫu thử dạng lỏng, hoặc 1,0 ml huyền phù ban đầu nếu các sản phẩm ở dạng khác, lên bề mặt của một đĩa thạnh lớn (140 mm) hoặc lên bề mặt của ba đĩa thạch nhỏ (90 mm). Trong cả hai trường hợp, chuẩn bị mẫu kép bằng cách dùng hai đĩa to hoặc sáu đĩa nhỏ. Sử dụng dụng cụ dàn mẫu dàn chất cấy cẩn thận càng nhanh càng tốt, lên mặt đĩa thạch, cố gắng không chạm vào mép đĩa. Để các đĩa có nắp đậy cho đến khô trong khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng thử nghiệm. Ủ Lật ngược các đĩa đã được chuẩn bị theo 8.2.3 và ủ chúng trong 24 h ± 2 h sau đó ủ lại thêm 24 h ± 2 h trong tủ ấm (6.2) ở 35 C hoặc 37 C 4).

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành gởi lời cảm ơn đến Ban Giám Hiệu nhà trường cùng các thầy

cô trong khoa Công Nghệ Thực Phẩm trường Đại học Công Nghiệp Thực phẩm TP.HCM

đã tạo điều kiện học tập, nghiên cứu, hết lòng giảng dạy và truyền đạt cho em những kiếnthức quý báu trong suốt thời gian em học tập ở trường

Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hải Hòa, người đã hướng dẫn,chỉ bảo cho em và giúp đỡ em trong suốt quá trình thực hiện đồ án

Trong quá trình thực hiện đồ án, do hạn chế về thời gian chuẩn bị và tài liệu thamkhảo nên không thể tránh khỏi hạn chế, thiếu sót rất mong nhận được ý kiến đóng gópcủa cô và người đọc để em học thêm được nhiều kinh nghiệm và sẽ hoàn thành tốt hơnbài báo cáo tốt nghiệp sắp tới

Em xin chân thành cảm ơn!

TP.HCM, ngày 20 tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Lê Châu

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

NHẬN XÉT CỦA HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ

HỘI ĐỒNG ĐÁNH GIÁ

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

QCVN: Quy chuẩn Việt Nam

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

TCN: Tiêu chuẩn ngành

AOAC: Association of Official Agricultural Chemists

LỜI MỞ ĐẦU

Việt Nam là nước nhiệt đới, nhưng trải dài trên nhiều vĩ tuyến nên hình thànhnhiều tiểu vùng khí hậu khác nhau, từ tiểu vùng có gió mùa Đông Bắc đến tiểu vùng cókhí hậu gần ôn đới như Sa Pa, Đà Lạt… và tiểu vùng có khí hậu nhiệt đới ẩm miền Nam.Với điều kiện khí hậu đa dạng như vậy nhưng rau quả Việt Nam vẫn chưa phát triển đúngmức so với những tiềm năng của mình Nguyên nhân là còn thiếu những công trìnhnghiên cứu có hệ thống về giống, kỹ thuật trồng trọt, chăm sóc trước thu hoạch và bảoquản chế biến sau thu hoạch…

Rau quả là một trong những nguồn thực phẩm quý mà thiên nhiên dành cho conngười, nó là một phần không thể thiếu cũng như không thể thay thế trong khẩu phần củachúng ta Thành phần chủ yếu là nước chiếm khoảng (80-90%), hàm lượng lipid thấpnhưng chứa nhiều chất xơ, khoáng, acid hữu cơ, chất thơm, đặc biệt nhất là vitamine A,

C, E…Những thành phần này góp phần làm tăng khả năng chuyển hoá thức ăn trong cơthể, làm cân bằng độ acid-kiềm trong máu và dịch bào, nhờ vậy độ pH trong cơ thể luôn

ổn định Đặc điểm của rau quả là có tính thời vụ và ở dạng tươi dễ hư hỏng, vì vậy nóđược quan tâm nghiên cứu, bảo quản, chế biến nhằm kéo dài thời gian sống, tiện dụnghơn và dễ phân phối, vận chuyển đi xa

Rau quả được chế biến thành nhiều loại sản phẩm khác nhau như sinh tố , nước ép,nectar, … Trong đó có sản phẩm nectar, nectar quả hỗn hợp là sản phẩm trái cây đượcdung phổ biến hiện nay, trong quá trình sản xuất chúng ta cần kiểm soát kỹ các chỉ tiêu visinh vật, kim loại nặng cũng như các độc tố sinh ra trong quá trình bảo quản để sản phẩmđạt chất lượng tốt nhất

Chính vì vậy, em chọn đề tài “Tìm hiểu các kỹ thuật kiểm soát chất lượng sản

phẩm nectar quả hỗn hợp” với mục đích phân tích các chỉ tiêu hóa lý, cảm quan,… để

sản phẩm đạt được chất lượng tốt nhất với hy vọng đưa sản phẩm ngày càng vươn xahơn

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

Là sản phẩm được sản xuất bằng cách pha chế purée quả (dịch quả nghiền) vớinước đường theo những tỉ lệ nhất định Để tăng hương vị, giữ màu sắc tự nhiên cho sảnphẩm thì pha thêm acid citric hoặc acid ascorbic Hàm lượng purée quả dao động trongkhoảng 35-70% tuỳ theo tính chất nguyên liệu và sản phẩm chế biến

Puree quả trong sản xuất nectar là sản phẩm chưa bị lên men nhưng có thể lên menthu được bằng biện pháp thích hợp

Trong rau quả, những chất có giá trị dinh dưỡng cao nhất như đường, acid hữu

cơ, vitamin…đều tập trung ở dịch quả Nhờ có đầy đủ và cân đối các chất ấy nên cóhương vị rất thơm ngon

Đường, acid citric, vitamin C

1.1.1 Quy trình sản xuất nectar rau quả

1.1.2 Tình hình phát triển rau quả ở Việt Nam

Việt Nam có điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng khá thuận lợi cho việc trồng trọt cácloại rau, hoa, quả (RHQ) để phục vụ cho nhu cầu tiêu dung trong nước và xuất khẩu hiệndiện tích trồng rau, hoa quả cả nước chiếm khoảng 780 nghìn ha, đạt giá trị 650 nghìn tỷđồng, chiếm 9% GDP của ngành nông nghiệp kim ngạch xuất khẩu có xu hướng tăngnhưng còn chậm Năm 2005 đạt 230 triệu USD và năm 2009 đạt 431 triệu USD Trongnước xuất hiện một số mô hình phát triển sản xuất và xuất khẩu RHQ đạt hiệu quả kinh tếcao, giá trị sản xuất trên 1 ha từ 400 – 500 triệu đồng/năm (cá biệt nhiều trang trại đạthơn 1 tỷ đồng), cũng có những doanh nghiệp xuất được hàng chục triệu USD/năm

Như vậy, ngành sản xuất RHQ xuất khẩu có thể mang lại thu nhập cao và là mộttiềm năng rất lớn của nền sản xuất nông nghiệp Việt Nam

Những vấn đề hạn chế xuất khẩu có tính chiến lược của ngành hàng rau, hoa đượcxác định là: thiếu hệ thống tiếp thị hợp tác, thiếu cơ sở hạ tầng hỗ trợ (kho vận lạnh, khobãi xử lý hoa, giao thông nội vùng) Thiếu những người sản xuất có năng lực xuất khẩu,chất lượng hoa thấp, không đồng đều Ngoài ra, giống là yếu tố đặc biệt quan trọng liênquan đến xuất khẩu vì hiện các giống rau, hoa đang được sản xuất chủ yếu là giống nhậpnội nên kinh danh xuất khẩu rau, hoa có những trở ngại nhất định và gặp nhiều khó khănkhi Việt Nam chính thức hội nhập WTO và tham gia UPOV (Công ước Quốc tế về Bảo

hộ Giống cây trồng mới) Phần lớn các giống rau lai F1 phải nhập khẩu từ nước ngoài,giá thành hạt giống cao và chất lượng giống bấp bênh gây ảnh hưởng tới sản xuất Mỗinăm Việt Nam phải chi tới 200 triệu USD nhập khẩu các loại hạt giống phục vụ ngànhtrồng trọt

CHƯƠNG 2 TIÊU CHUẨN CHO NGUYÊN LIỆU

Để sản phẩm đạt được chất lượng tốt thì ban soạn thảo Quy chuẩn kỹ thuật quốcgia về vệ sinh an toàn thực phẩm đối với đồ uống biên soạn QCVN 6-2:2010/BYT quyđịnh các chỉ tiêu an toàn thực phẩm và các yêu cầu quản lý đối với đồ uống không cồn,bao gồm nước rau quả, nectar rau quả và đồ uống pha chế sẵn không cồn và TCVN

6299 : 1997 do Ban Kỹ thuật Tiêu chuẩn TCVN/TC/F10 Rau quả và sản phẩm rau quảbiên soạn, Tổng cục Tiêu chuẩn - Đo lường - Chất lượng đề nghị và được Bộ Khoa họcCông nghệ và Môi trường ban hành để hướng dẫn cho sản phẩm nectar rau quả

- Nguyên liệu dùng để chế biến nectar cần có hàm lượng cao các chất khô hoàtan, các chất đường, acid hữu cơ, tannin, các chất thơm, chất màu, dịch quả cómàu sắc và hương vị hấp dẫn Các chỉ tiêu quan trọng nhất, đặc trưng chophẩm chất dịch quả là khối lượng riêng, hàm lượng chất khô và độ acid Quảđưa vào chế biến cần tươi tốt, có độ chin thích hợp Nếu quả chưa chín thìmàng tế bào cứng, dịch bào ít nên nhiều phế liệu, cho dịch quả có hàm lượngđường thấp, hàm lượng acid cao, màu sắc, hương vị kém hấp dẫn

- Nguyên liệu dùng để chế biến thường là loại quả khó tách dịch bào bằng

phương pháp ép như: chuối, mơ, mận ổi, mãng cầu… Người ta còn chế biến

nectar từ một số loại rau, củ như cà chua, cà rốt,… hoặc sản xuất nectar từ hỗnhợp nhiều loại quả

2.2.1 Giới hạn kim loại nặng trong sản phẩm

- Bảng 2.1 Giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong sản phẩm

- Hàm lượng etanola không được vượt quá 3 g/kg.

2.2.3 Giới hạn các chất phụ gia được phép sử dụng

- Bảng 2.2 Giới hạn các chất phụ gia trong sản phẩm

( Theo TCVN 6299 : 1997 )

2.2.4 Giới hạn vi sinh vật có trong sản phẩm

- Bảng 2.3 Giới hạn vi sinh vật trong sản phẩm

Tổng số vi sinh vật hiếu khí, CFU/ml sản

Coliform, CFU/ml 10

(Theo QCVN 6-2:2010/BYT )

2.2.5 Yêu cầu nước sử dụng để chế biến

Nước sử dụng để chế biến đồ uống không cồn phải đáp ứng các yêu cầu theoQCVN 01:2009/BYT về chất lượng nước ăn uống được ban hành kèm theo Thông tư số04/2009/TT-BYT ngày 17/6/2009 của Bộ trưởng Bộ Y tế

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CÁC CHỈ TIÊU CỦA NGUYÊN

LIỆU 3.1 XÁC ĐỊNH CHÌ, CADIMI, KẼM, ĐỒNG VÀ SẮT THEO TCVN 8126:2009

3.1.1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định kẽm đồng và sắt trong thực phẩmbằng phương pháp quang phổ hấp thụ ngọn lửa ( FAAS) và xác định hàm lượngcadimi và chì trong thực phẩm bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tửdùng lò graphit ( GFAAS), sau khi đã phân hủy bằng vi sóng

Tiêu chuẩn này không áp dụng cho các loại thực phẩm có hàm lượng chất béo lớnhơn hoặc bằng 40 % và không áp dụng cho sữa bột

3.1.2 Nguyên tắc

Các sản phẩm được phân hủy bằng axit nitric và hydro peroxit dưới áp suất caotrong lò vi sóng Dung dịch thủy phân được pha loãng bằng nước Chì và cadimiđược xác định bằng GFAAS Kẽm, đồng và sắt được xác định bằng FAAS

3.1.3 Thuốc thử

Chỉ sử dụng các thuốc thử loại tinh khiết phân tích và sử dụng nước cất hoặc nước

đã loại ion, có điện trở ≥ 18 MΩ.cm

3.1.4 Cách tiến hành

3.1.4.1 Phân hủy

Dùng cân phân tích, cân từ 0,2 đến 0,5 gam mẫu dạng khô, chính xác đến 0,1 mgcho vào bình phân hủy Teflon

Thêm 5 ml axit nitric và 2 ml hydro peroxit vào bình phân hủy Đậy nắp, đặt bìnhvào giá đỡ rồi đưa vào lò vi sóng rồi đóng cửa lò Đặt chương trình của lò theo các thông

số trong Bảng sau và bắt đầu phân hủy

Các thông số chương trình đối với lò vi sóng

Lấy các bình phân hủy ra khỏi lò vi sóng và để nguội hoàn toàn trước khi mởchúng Mở bình phân hủy, tráng nắp đậy và thành bình bên trong Chuyển dung dịch nàysang bình định mức 25 ml và pha loãng đến vạch bằng nước đã loại ion Sau đó, chuyểndung dịch sang bình chất dẻo Xử lý mẫu trắng giống mẫu thử Đối với mỗi mẻ cần thựchiện một phép thử trắng

3.1.4.2 Pha loãng

Nếu dung dịch thử cần được pha loãng tiếp (do nồng độ kim loại cao) thì phaloãng với axit nitric 3M, để duy trì cùng một nồng độ axit thấp trước khi xác định kimloại bằng máy đo quang phổ hấp thụ nguyên tử

Nồng độ axit cao sẽ không thích hợp về môi trường và làm suy giảm tín hiệu phântích Giảm nồng độ axit bằng cách pha loãng một nửa dung dịch thử với axit nitric 0,1 M

và một nửa dung dịch chuẩn với axit nitric 3 M Khi đó dung dịch thử và dung dịchchuẩn sẽ có cùng một nồng độ axit Nồng độ axit thích hợp rất quan trọng khi sử dụngđường hiệu chuẩn

3.1.4.3 Đo quang phổ hấp thụ nguyên tử

Sử dụng kỹ thuật đo FAAS hoặc kỹ thuật đo GFAAS để xác định hàm lượng kimloại cần tìm Nên sử dụng kỹ thuật FAAS khi có thể, vì kỹ thuật này ít bị nhiễu bởi cácchất gây nhiễu hơn so với kỹ thuật GFAAS Chương trình nhiệt độ hỗn hợp khí, bướcsóng và các thông số thiết bị khác thích hợp nhất đối với mỗi loại kim loại thì xem sổ tayđược cung cấp cùng thiết bị Luôn sử dụng hiệu chỉnh nền

Các phép đo phải nằm trong dải tuyến tính khi sử dụng phương pháp thêm chuẩn.Đường chuẩn này gồm ít nhất là ba điểm, trong đó có ít nhất 2 điểm chuẩn Nồng độ củachất chuẩn cao nhất cần phải gấp 3 lần đến 5 lần nồng độ dung dịch thử Nồng độ củachất chuẩn thấp hơn nên ở khoảng một nửa nồng đồ chất chuẩn cao nhất Phương phápthêm chuẩn được đơn giản hóa là sử dụng đường chuẩn phù hợp với chất nền, có thể ápdụng cho các sản phẩm có cùng chất nền: Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được trộn

và được sử dụng để tạo đường bổ sung chuẩn Đường này được tạo song song từ gốc tọa

độ và được sử dụng như đường chuẩn cho các phép thử và có cùng một tỷ lệ pha loãng.Như vậy đường chuẩn phù hợp với chất nền và dung dịch thử sẽ có cùng nồng độ chấtnền Trong các thiết bị hiện đại nhất, chức năng này được cài sẵn trong phần mềm

Nồng độ của kẽm, đồng và sắt thường ở mức thích hợp để xác định bằng FAAS.Khi sử dụng đường hiệu chuẩn thì các dung dịch chuẩn và dung dịch thử phải có cùngnồng độ axit.

Vì sắt có thể bị ảnh hưởng nhiều bởi chất nền, do đó nên sử dụng phương phápthêm chuẩn hoặc các chuẩn phù hợp với chất nền Khi cho thấy có nhiễu mạnh thì có thểthay thế bằng ngọn lửa oxi hóa axetylen nitơ oxit

3.1.4.5 Kỹ thuật GFAAS

Kỹ thuật này thường được dùng để xác định chì và cadimi trong thực phẩm Sửdụng các cuvet nhiệt phân có đế Vì phương pháp này tạo ra dải pha loãng phân tích khárộng, nên phương pháp này có thể dùng để xác định đồng

Nên sử dụng phương pháp thêm chuẩn hoặc các chuẩn phù hợp với chất nền, trừkhi không cần thiết (nghĩa là không có sự khác nhau đáng kể giữa độ dốc của đường hiệuchuẩn của dung dịch chuẩn làm việc tinh khiết và đường bổ sung chuẩn của mẫu thử).Khi sử dụng phương pháp thêm chuẩn thì các phép đo phải nằm trong dải tuyến tính

Đặt chương trình cho bộ lấy mẫu tự động để phân phối một thể tích mà có thể cho

độ hấp thụ càng lớn càng tốt nằm trong dải tuyến tính và tạo ra độ hấp thụ nền không lớnhơn 0,5 đơn vị Việc bơm nhiều có thể tăng độ hấp thụ ở nồng độ rất thấp Đánh giá mỗichất nền mới bằng cách dùng đồ thị sử dụng tro hóa và nguyên tử hóa nhằm tối ưu hóacác thông số của lò graphit

3.1.5 Tính và biểu thị kết quả

Tính nồng độ của kim loại trong mẫu thử, C, biểu thị bằng miligam trên kilôgam

(mg/kg), theo công thức (1):

(1)trong đó:

a là nồng độ trong dung dịch thử, tính bằng miligam trên lit (mg/l);

b là nồng độ trung bình trong dung dịch trắng, tính bằng miligam trên lit (mg/l);

d f là hệ số pha loãng;

m là khối lượng của mẫu thử, tính bằng gam (g).

Nếu giá trị (a - b) thấp hơn giới hạn phát hiện (DL) thì (a-b) được thay bằng DL đểtính giới hạn phát hiện trong mẫu thử

Nếu dung dịch thử đã được pha loãng, thì phải tính cả hệ số pha loãng (d f)

Nếu phần mẫu thử được làm khô và tính kết quả dựa trên khối lượng tươi thì nồng

độ của kim loại trong mẫu thử, CFW, biểu thị bằng (mg/kg), tính được theo công thức (2):

W f là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng gam (g);

W d là khối lượng của phần mẫu thử sau khi sấy, tính bằng gam (g)

Khi tiến hành phép thử lặp lại thì lấy kết quả trung bình đến 3 chữ số có nghĩa

3.2 XÁC ĐỊNH DƯ LƯỢNG N-METYLCARBAMAT BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO CÓ LÀM SẠCH BẰNG CHIẾT PHA RẮN

3.2.1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định dư lượng thuốc bảo vệ thực vật metylcarbamat trong ngũ cốc, rau và quả bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

N-3.2.2 Nguyên tắc

Mẫu được đồng hóa với axeton, diclometan và dầu nhẹ và mẫu đã đồng hóa được

ly tâm tạo ra hai lớp nổi phía trên Lớp nước phía trên được cho bay hơi đến khô Dịchchiết này cũng có thể được làm sạch bằng chiết pha rắn (SPE) sử dụng cột nhồi bằngsilica được gắn aminopropyl Trong dung dịch chiết, M-metylcarbamat được xác địnhbằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) pha đảo có thủy phân sau cột Metylamin tạothành được cho phản ứng với o-phthaldialdehyd và 2-mercaptoetanol và các dẫn xuấtđược phát hiện bằng detector huỳnh quang

3.2.3 Cách tiến hành

3.2.3.1 Yêu cầu chung

Chuẩn bị mẫu trắng thuốc thử và các mẫu trắng chất nền và thực hiện các phép thửthu hồi thích hợp với các giới hạn dư lượng tối đa

3.2.3.2 Cách chiết

Đồng hóa 15 g (m) thử với 30 ml axeton 30 s trong ống ly tâm Thêm 30 ml

diclometan và 30 ml dầu nhẹ và đồng hóa tiếp trong 30 s Ly tâm ống 5 min ở tốc độ

4000 min-1 Gạn lớp phía trên (hữu cơ) cho vào bình nón

Chuyển từng phần 2 ml lớp này sang ống nghiệm và thêm 50 dung dịch hãm.Cho bay hơi nhẹ dung môi đến gần khô

3.2.3.3 Chiết pha rắn

Hút 1 ml diclometan cho qua cột SPE được gắn với thiết bị rửa giải thích hợp, rồigạn bỏ dịch rửa giải Hòa tan phần cặn thu được trong 8.2 bằng 1 ml diclometan Chodung dịch này vào ống SPE, dùng 0,5 ml diclometan để tráng và bắt đầu thu lấy dịch rửagiải cho vào ống nghiệm Tiếp tục rửa giải bằng 1 ml hỗn hợp rửa giải SPE, thu lấy dịchrửa giải này vào cùng ống nghiệm và cho bay hơi nhẹ dung môi đến gần khô

3.2.4 Đo HPLC

Hòa tan cặn thu được trong trong 1 ml dung dịch chuẩn nội trên thiết bị siêu âm

Lọc dung dịch qua màng lọc và bơm 100 lên hệ thống HPLC có cột bảo vệ như ví dụ trong và cột phân tích ví dụ trong

Áp dụng ví dụ như chương trình gradient ba yếu tố sau đây, ở tốc độ dòng 0,75 ml/ min:

75% pha động A và 25 % pha động B trong 5 min, sau đó áp dụng tuyến tính từ 0

% pha động C đến 100 % pha động C trong 20 min, cuối cùng 100 % pha động C trong 5 min

Cho dịch rửa giải từ cột phân tích HPLC qua cột phản ứng như trong có chứa cột thủy phân sau cột như trong Duy trì cột phản ứng ở 120 oC

Để rửa giải cột thủy phân, thêm thuốc thử OPA với tốc độ 0,1 ml/min qua chi tiết chữ T thể tích chết thấp

Cho hỗn hợp đi qua detector huỳnh quang Các bước sóng kích thích và phát xạ được cài đặt tương ứng 340 nm và 455 nm

3.2.5 Tính kết quả

Để nhận biết N-metylcarbamat có mặt, so sánh thời gian lưu của các pic thu được đối với các dung dịch mẫu thử thu được bằng cách trộn và pha loãng dung dịch gốc thuốcbảo vệ thực vật thích hợp.

Để định lượng N-metylcarbamat đã nhận dạng, sử dụng các dung dịch chuẩn của

hợp chất này có các nồng độ thích hợp, ví dụ: 0,005 đến 0,05 µg/ml Trong sắc ký

đồ, đo chiều cao pic (hoặc diện tích pic) thu được đối với hợp chất và trimethacarb chuẩn

và tính thương số của hai giá trị này Đối với đường chuẩn, đánh dấu các lượng của hợp chất có chứa trong 1 ml của từng dung dịch chuẩn trên trục hoành và các thương số thu được trên trục tung

Đối với pic thu được của hợp chất đã nhận dạng từ dung dịch mẫu thử, tính

thương số như được đề cập ở trên và đọc khối lượng trong dung dịch mẫu thử từ đường

chuẩn Tính phần khối lượng, w, bằng miligam trên kilogam mẫu thử, theo công thức (1):

(1)

- Trong đó:

X là khối lượng của hợp chất đọc được từ đường chuẩn, tính bằng microgam ( );

m là khối lượng phần mẫu thử, tính bằng gam (g)

Phép thử khẳng định

- Cần tiến hành các phép thử khẳng định việc nhận dạng và định lượng các dư lượng thuốc bảo vệ thực vật quan sát được, đặc biệt là trong các trường hợp cho thấy vượt quá các mức giới hạn dư lượng tối đa (MRL)

- Phương pháp cặp đôi sắc ký khí khối phổ (GC-MS) là phương pháp điển hình để khẳng định việc nhận dạng và định lượng N-metylcarbamat Đối với các hợp chất này mà không phân tích được bằng sắc ký khí, thì các kỹ thuật sử dụng sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) hoặc sắc ký lỏng detector chuỗi diot quang (LC-DAD) là thích hợp

3.3 XÁC ĐỊNH PATULIN THEO TCVN 8161: 2009

3.3.1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp xác định hàm lượng patulin trong nước táo vàpuree táo bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp này đã được khảonghiệm để xác định patulin qua phân tích các mẫu bị nhiễm tự nhiên và các mẫu đã được

bổ sung lượng biết trước trong nước táo trong ở các mức từ 26 µg/l đến 128 µg/l, trongnước táo đục ở các mức từ 26 µg/l đến 106 µg/l và trong puree táo ở các mức từ 23 µg/kgđến 121 µg/kg

3.3.2 Nguyên tắc

Nước táo đục và puree táo được xử lý bằng enzym pectinaza Patulin được chiết rakhỏi nước táo hoặc puree đã được xử lý enzym bằng dung dịch etyl axetat Dịch chiếtbằng dung môi được làm sạch bằng chiết pha lỏng-lỏng với dung dịch natri cacbonat.Dịch chiết bằng etyl axetat được làm khô bằng natri sulfat khan Sau khi cho bay hơi etylaxetat, patulin được định lượng bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector tử ngoại(UV)

3.3.3 Cách tiến hành

3.3.3.1 Chuẩn bị mẫu thử

Nước táo trong

- Không cần chuẩn bị mẫu

Nước táo đục

- Chuyển 20 ml ± 0,1 ml nước táo đục sang ống ly tâm (5.7) và thêm 150 µl dungdịch enzym (4.10) Vặn chặt nắp và lắc kỹ bình Để qua đêm ở nhiệt độ phònghoặc để 2 h ở 40 0C, sau đó cho ly tâm 5 min ở gia tốc 4500 g.

Puree táo

- Cân 10 g mẫu thử puree, chính xác đến 0,1 g cho vào ống ly tâm (5.7), thêm 150

µl dung dịch enzym (4.10) và 10 ml nước Vặn chặt nắp và lắc bình bằng máy

đồng hóa tùy thuộc vào mẫu, để trộn kỹ Để qua đêm ở nhiệt độ phòng hoặc để 2 h

ở 400C, sau đó cho ly tâm 5 min ở gia tốc 4500 g.

Chiết patulin

- Dùng pipet lấy 10 ml nước táo trong hoặc nước táo đục đã chuẩn bị trong 3.1.2cho vào phễu chiết 100 ml Đối với puree táo thì dùng pipet lấy 10 ml mẫu đãchuẩn bị trong 3.1.3, tương đương với 5 g puree, cho vào phễu chiết 100 ml Thêm

20 ml etyl axetat và lắc trong 1 min Để yên cho tách lớp rồi tách riêng hai pha nàyvào hai bình nón riêng rẽ Chuyển phần nước vào lại phễu chiết và chiết lại lần haibằng 20 ml etyl axetat Lại để yên cho tách lớp rồi chuyển lớp nước phía dưới vàomột bình nón rỗng và lớp phía trên vào bình nón có chứa sẵn lớp etyl axetat từ lầnchiết thứ nhất Lặp tại quy trình chiết này lần ba, nhưng sau khi tách lớp thì tháo

bỏ lớp nước phía dưới Gộp ba phần dịch chiết etyl axetat này vào phễu chiết.Tráng bình nón được dùng để đựng các dịch chiết etyl axetat bằng 5 ml etyl axetatmới và gộp nước rửa này vào dịch chiết etyl axetat trong phễu chiết

Loại bỏ các hợp chất acid gây nhiễu

- Cho 4 ml dung dịch natri cacbonat vào phễu chiết đựng dịch chiết etyl axetat vàlắc trong 30 s Đợi cho tách lớp rồi tháo lớp nước phía dưới chảy sang bình nón.Rót lớp phía trên sang bình cầu đáy tròn qua phễu chiết và giấy lọc có chứakhoảng 15 g natri sulfat khan Chuyển phần nước trở lại phễu chiết rồi tráng bìnhnón bằng khoảng 10 ml etyl axetat, cho nước tráng vào phễu chiết và lắc 30 s Đểyên cho tách lớp, tháo bỏ lớp nước phía dưới và cho lớp phía trên chảy qua natrisulfat sang bình cầu đáy tròn Tráng phễu chiết bằng 15 ml etyl axetat và cho quanatri sulfat vào bình cầu đáy tròn

- Thực hiện bước này trong vòng 3 min

chuẩn bị dung dịch mẫu thử

- Cho bay hơi dung dịch thu được đến thể tích nhỏ (< 1 ml) trong chân không, sửdụng nồi cách thủy ở 40 0C Chuyển lượng còn lại sau khi bay hơi sang một lọthủy tinh Tránh phía trong bình cầu đáy tròn bằng etyl axetat để đảm bảo rằngchuyển được tất cả patulin sang lọ Cho bay hơi dung dịch đến khô bằng dòng nitơtrên tấm gia nhiệt hoặc trên nồi cách thủy ở 400C Hòa tan lại cặn bằng cách dùngpipet lấy 1 ml (V1) nước (500 µl với mẫu puree) cho vào lọ Dùng máy trộn Vortex

để hòa tan hoàn toàn mẫu Chuyển dung dịch mẫu thử sang lọ nhỏ của HPLC Lọcqua bộ lọc xyranh dùng một lần, nếu cần.

3.3.4 Quy trình thêm chuẩn

3.3.4.1 Nước táo trong

- Dùng pipet lấy 10 ml nước táo trong không chứa patulin cho vào phễu chiết 100

ml Dùng pipet lấy 50 µl dung dịch chuẩn hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 µl patulin tuyệt đối cho vào nước táo trong không chứa patulin Đậy bình

và lắc kỹ để trộn Tiến hành như trong 3.2 đến 3.4

3.3.4.2 Nước táo đục

- Dùng pipet lấy 10 ml nước táo đục cho vào ống ly tâm Dùng pipet lấy 50 µl dung dịch chuẩn hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 µg patulin tuyệt đối cho vào nước táo đục không chứa patulin Đậy bình và lắc kỹ để trộn Tiến hành như trong 3.1.2

3.3.4.3 Puree táo

- Cân 10 g puree táo không chứa patulin, chính xác đến 0,1 g, cho vào ống ly tâm Dùng pipet lấy 50 µl dung dịch chuẩn hoặc một lượng dịch lỏng tương đương với 0,5 µg putulin tuyệt đối cho vào puree táo không chứa patulin Sau khi thêm, lắc

kỹ để trộn dung dịch Tiến hành như trong 3.1.3

3.3.5 Xác định bằng HPLC

3.3.5.1 Đường chuẩn

Yêu cầu chung

- Dựng đường chuẩn trong ngày phân tích

Dung dịch hiệu chỉnh patulin dùng cho HPLC

- Chuẩn bị 5 dung dịch chuẩn HPLC trong các bình định mức 2 ml riêng biệt theo Bảng 1 Dùng pipet để chuyển dung dịch chuẩn patulin để hiệu chuẩn (4.14) Pha loãng từng dung dịch chuẩn đến 2 ml bằng nước có pH 4 (4.5).

Bảng 1 - Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

Dung dịch chuẩn Nước (4.5)

(µl)

Dung dịch chuẩn làm việc patulin

(µl)

Nồng độ khối lượng (µg/ml)

- Tốc độ dòng của pha động (cột): 1,0 ml/min;

- Bước sóng của detector UV: 276 nm;

- Thể tích bơm: 50 µl

3.3.6 Tính kết quả

Đọc từ đường chuẩn khối lượng patulin trong dung dịch mẫu thử đã bơm lên cộtHPLC, bằng nanogam Tính phần khối lượng patulin, wPAT, bằng nanogam trên mililit(hoặc gam đối với puree) theo công thức (2):

(2)Trong đó:

ma là khối lượng patulin trong dung dịch thử được bơm lên cột, tính bằngnanogam (ng);

V2 là thể tích phần dung dịch thử (3.4) được bơm lên cột, tính bằng mililit (ml);

V1 là thể tích dung dịch mẫu thử (3.4), (V1 = 1,0 ml đối với nước táo, V1 = 0,5mlđối với puree) tính bằng mililit (ml);

Ms là thể tích mẫu được chiết, tính bằng mililit đối với nước táo (ms = 10 ml) hoặcgam đối với puree (ms = 5 g)

Kết quả cuối cùng có thể được biểu thị bằng microgam trên lit (hoặc kilogam đối vớipuree) và tương đương với nanogam trên mililit (hoặc gam)

3.4 ĐỊNH LƯỢNG COLIFORM THEO TCVN 6848 : 2007

3.4.1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này đưa ra các hướng dẫn chung về định lượng coliform Tiêu chuẩn này có thể áp dụng cho:

• thực phẩm và thức ăn chăn nuôi

• các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và chế biến thực phẩm

bằng kỹ thuật đếm khuẩn lạc trên môi trường đặc sau khi ủ ở 30 °C hoặc 37 °C

CHÚ THÍCH: Nhiệt độ này cần được thỏa thuận giữa các bên có liên quan Trong

trường hợp đối với sữa và sản phẩm sữa, thì nhiệt độ ủ là 30 °C

Kỹ thuật này được khuyến cáo sử dụng khi số lượng khuẩn lạc cần tìm dự kiến lớn hơn

100 trên mililit hoặc trên gam mẫu thử

3.4.2 Coliform

Vi khuẩn ở nhiệt độ quy định (nghĩa là ở 30 °C hoặc 37 °C như thỏa thuận) hìnhthành các khuẩn lạc đặc trưng trong thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể và trongphép thử khẳng định có lên men lactoza có sinh khí dưới các điều kiện thử quy định trongtiêu chuẩn này

3.4.3 Nguyên tắc

Chuẩn bị hai môi trường đặc chọn lọc, và lấy một lượng mẫu thử theo quy địnhnếu là sản phẩm ban đầu là chất lỏng, hoặc lấy một lượng huyền phù ban đầu theo quyđịnh nếu các sản phẩm ở dạng khác

Chuẩn bị các cặp đĩa môi trường chọn lọc khác trong cùng một điều kiện, dùng các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thử hoặc của huyền phù ban đầu

Ủ các đĩa này ở 30 °C hoặc 37 °C (như thỏa thuận) trong 24 h

Đếm các khuẩn lạc đặc trưng và nếu cần, số khuẩn lạc được khẳng định bằng lên men lactoza.

Số coliform có trong 1 mililit hoặc trong 1 gam mẫu thử được tính từ số khuẩn lạc đặc trưng thu được trên các đĩa được chọn

3.4.4 Môi trường đặc chọn lọc: Thạch lactoza mật đỏ trung tính tím tinh thể (VRBL)

Tiến hành như sau để giữ được tính chọn lọc và đặc trưng của môi trường

Trộn kỹ các thành phần hoặc môi trường hoàn chỉnh khô trong nước và để yên vài phút Chỉnh pH sao cho sau khi đun sôi pH bằng 7,4 ± 0,2 ở 25 °C Đun đến sôi và thỉnh thoảng khuấy cho tan hết

Giữ sôi trong 2 phút Làm nguội ngay môi trường trong nồi cách thủy (6.5) ở nhiệt độ 44

°C đến 47 °C

Để tránh làm quá nhiệt, không đun môi trường quá lâu cũng như không đun lại Do đó, không khử trùng trong nồi áp lực và cần kiểm tra độ vô trùng của môi trường tại thời điểm sử dụng (xem 9.2.2).

Sử dụng môi trường trong vòng 4 h sau khi chuẩn bị

3.4.5 Môi trường khẳng định: Canh thang mật lactoza lục sáng

Chuyển 10 ml môi trường vào từng ống nghiệm (6.7) chứa các ống Durham (6.8) Khử trùng 15 phút trong nồi hấp áp lực (6.1) ở 121 °C Các ống Durham không được chứa bọt khí sau khi khử trùng

3.4.6 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Sử dụng các thiết bị thông thường của phòng thử nghiệm vi và cụ thể sau:

Thiết bị để thanh trùng khô (tủ sấy) hoặc để thanh trùng ướt (nồi hấp áp lực)Xem TCVN 6404 (ISO 7218)

Tủ ấm, có thể hoạt động ở 30 °C ± 1 °C hoặc 37 °C ± 1°C

Đĩa Petri, bằng thủy tinh hoặc bằng chất dẻo có đường kính từ 90 mm đến 100 mm.

Pipet xả hết, có dung tích danh định 1 ml

Nồi cách thủy, hoặc thiết bị tương tự có khả năng hoạt động từ 44 °C đến 47 °C hoặc ở 100 °C

Thiết bị đếm khuẩn lạc, gồm một nguồn chiếu sáng và dụng cụ đếm cơ học hoặc điện tử

Ống nghiệm, kích thước khoảng 16 mm x 160 mm

Ống Durham, có kích thước phù hợp với ống nghiệm (6.7)

Bình hoặc chai, để đun sôi và bảo quản môi trường cấy

3.4.9 Cách tiến hành

3.4.9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dịch pha loãng

Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng đầu tiên) và các dungdịch pha loãng tiếp theo TCVN 6507 (ISO 6887) (phần có liên quan), TCVN 6263 (ISO8261) hoặc tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra

3.4.9.2 Cấy và ủ ấm mẫu

Chuẩn bị hai đĩa đối với sản phẩm dạng lỏng và/hoặc đối với mỗi bộ pha loãng đãchọn Dùng pipet vô trùng (6.4) cho vào tâm của mỗi đĩa 1 ml của mẫu thử nếu là sảnphẩm lỏng hoặc của các dung dịch pha loãng thích hợp Sử dụng một pipet vô trùng chomỗi dung dịch pha loãng.

Rót khoảng 15 ml môi trường VRBL (5.3) ở 44 °C đến 47 °C vào mỗi đĩa Petri.Thời gian tính từ khi kết thúc khâu chuẩn bị huyền phù ban đầu (hoặc dung dịch phaloãng 1/10 nếu là sản phẩm lỏng) đến thời điểm rót môi trường vào đĩa không vượt quá

Sau khi đông đặc hoàn toàn, rót khoảng 4 ml môi trường VRBL (5.3) ở 44 °C đến

47 °C lên bề mặt của môi trường cấy Để cho đông lại như mô tả ở trên

Lật ngược các đĩa đã cấy và để vào tủ ấm (6.2) ở 30 °C hoặc 37 °C (như thỏathuận) trong 24 h ± 2 h

3.4.9.3 Đếm các khuẩn lạc

Sau thời gian ủ quy định (xem 9.2.4), nếu có thể, chọn các đĩa Petri có từ 10 khuẩnlạc trở lên đến 150 khuẩn lạc Dùng thiết bị đếm khuẩn lạc (6.6) để đếm các khuẩn lạcmàu đỏ ánh tía có đường kính 0,5 mm hoặc lớn hơn (đôi khi có vùng mật tủa hơi đỏ baoquanh) Các khuẩn lạc này được coi là các coliform điển hình và không cần phải thửkhẳng định tiếp

Đối với các chi tiết về kỹ thuật đếm khuẩn lạc, xem TCVN 6404 (ISO 7218).Cũng đếm và khẳng định các khuẩn lạc điển hình (ví dụ kích cỡ nhỏ hơn), và tất

cả các khuẩn lạc có nguồn gốc từ các sản phẩm sữa và có chứa đường không phải là

lactoza, ngay sau khi ủ theo 9.4 Việc chuyển hóa đường không phải là đường lactoza cóthể làm cho khuẩn lạc có hình dạng nhìn tương tự như coliform điển hình.

CHÚ THÍCH: Vẻ bề ngoài của vùng mật tủa hơi đỏ bao quanh các khuẩn lạc phụ thuộcvào loại coliform và chất lượng của môi trường

3.5 ĐỊNH LƯỢNG NẤM MEN VÀ NẤM MỐC THEO TCVN

8275-1:2009

3.5.1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng nấm men và nấm mốc sốngtrong các sản phẩm thực phẩm hoặc trong thức ăn chăn nuôi có hoạt độ nước lớn hơn0,95 [trứng, thịt, sản phẩm sữa (trừ sữa bột), rau, quả, các loại pate tươi ] bằng kỹ thuậtđếm khuẩn lạc ở 250C ± 10C ([1], [2])

Tiêu chuẩn này không cho phép định lượng các bào tử nấm mốc Việc nhận biếtcũng như việc kiểm tra các hệ nấm của thực phẩm về độc tố không nằm trong phạm vicủa tiêu chuẩn này Phương pháp qui định trong tiêu chuẩn này không thích hợp để định

lượng các loại nấm chịu nhiệt như Byssochlamys fulva hoặc Byssochlamys nivea, có trong

rau và quả đóng hộp hoặc đóng chai

3.5.2 Nguyên tắc

Chuẩn bị các đĩa nuôi cấy bề mặt, sử dụng môi trường nuôi cấy chọn lọc qui định.Tùy chọn vào số lượng khuẩn lạc dự kiến, sử dụng lượng xác định của mẫu (nếu sảnphẩm dạng lỏng) hoặc huyền phù ban đầu (nếu sản phẩm ở dạng khác), hoặc các dungdịch pha loãng thập phân của mẫu/huyền phù

Có thể chuẩn bị các đĩa bổ sung trong cùng điều kiện, sử dụng các dung dịch thậpphân của mẫu thử hoặc các huyền phù ban đầu

Ủ các đĩa đã cấy trong điều kiện hiếu khí ở 250C ± 10C trong 5 ngày Các đĩa thạch

có thể được để trong ánh sáng khuếch tán từ 1 ngày đến 2 ngày, nếu cần

Đếm các khuẩn lạc/các chồi, khẳng định việc nhận dạng các khuẩn lạc nghi ngờbằng kính phóng đại hoặc kính hiển vi (để phân biệt các khuẩn lạc của nấm men với cáckhuẩn lạc của vi khuẩn), nếu cần

Số lượng nấm men và nấm mốc trong một gam hoặc một mililit mẫu được tính từ

số lượng khuẩn lạc/chồi/mầm thu được trên các đĩa đã chọn ở các mức pha loãng tạo racác khuẩn lạc có thể đếm được Nấm men và nấm mốc được đếm riêng, nếu cần

3.5.3 Dịch pha loãng và môi trường nuôi cấy

Về thực hành trong phòng thử nghiệm hiện hành, xem TCVN 6507 (ISO 6887) vàTCVN 6263 (ISO 8261)

3.5.4.2 Chuẩn bị canh thang nước pepton 0,1% (nồng độ khối lượng)

Hòa tan các thành phần trên trong nước, đun nóng nếu cần

Chỉnh pH sao cho sau khi khử trùng pH là 7,0 ± 0,2 ở 250C, nếu cần

3.5.5 Môi trường nuôi cấy

3.5.5.1 Thạch dichloran-rose bengal chloramphenicol (DRBC) [3],[4]

• Thành phần

Sản phẩm thủy phân mô động vật hoặc thực vật bằng enzyme 5,0 g

Chloramphenicol 0,1 g

Tùy vào sức đông của thạch

3.5.6 Thiết bị và dụng cụ thủy tinh

Có thể dùng dụng cụ sử dụng một lần để thay thế cho các dụng cụ thủy tinh sử dụng nhiều lần nếu nó có các đặc tính kỹ thuật phù hợp

Sử dụng các thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường [xem TCVN

6404 (ISO 7218)] và cụ thể như sau:

• Tủ ấm, có thể duy trì nhiệt độ 250C ± 10C

• Pipet xả hết, vô trùng, dung dịch danh nghĩa 1 ml, được chia vạch 0,1 ml

• Nồi cách thủy, hoặc dụng cụ tương tự, có khả năng duy trì nhiệt độ ở 440C đến470C

• Máy đo pH, có độ chính xác 0,1 đơn vị pH ở 250C

• Chai, bình và ống nghiệm, để đun sôi và bảo quản môi trường nuôi cấy và phaloãng dung dịch

• Đĩa Petri vô trùng, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo, đường kính từ 90 mm đến 100mm

• Kính hiển vi, để phân biệt nấm men với các tế bào vi khuẩn (có trường sáng, độkhuếch đại từ 250 lần đến 1 000 lần)

• Que dàn mẫu, bằng thủy tinh hoặc chất dẻo (đường kính nhỏ hơn 2 mm và dài 80mm) Đường kính không được vượt quá 2 mm để giảm thiểu lượng mẫu dính vàoque khi kết thúc dàn mẫu

• Kính khuếch đại hai thị kính, để phân biệt các khuẩn lạc/tế bào nấm men và nấmmốc (khuếch đại từ 6,5 lần đến 50 lần)

3.5.7 Lấy mẫu

Điều quan trọng là phòng thử nghiệm phải nhận được đúng mẫu đại diện và không

bị hư hỏng hoặc giảm chất lượng trong suốt quá trình vận chuyển hoặc bảo quản Mẫuphòng thử nghiệm không được làm đông lạnh

Việc lấy mẫu không qui định trong tiêu chuẩn này Nên lấy mẫu theo tiêu chu ẩn

cụ thể liên quan đến sản phẩm Nếu không có tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩmthì các bên có liên quan sẽ thỏa thuận về vấn đề này

3.5.9.1 Phần mẫu thử, huyền phù ban đầu và dung dịch pha loãng

Chuẩn bị phần mẫu thử, huyền phù ban đầu (dung dịch pha loãng ban đầu) và cácdung dịch pha loãng theo TCVN 6507 (tất cả các phần), TCVN 6404 (ISO 7218), TCVN

6263 (ISO 8261) và tiêu chuẩn cụ thể liên quan đến sản phẩm

Khuyến cáo sử dụng canh thang nước pepton 0,1% (5.1.3) làm dịch pha loãng, trừviệc chuẩn bị mẫu thử cụ thể Tốt nhất nên dùng bộ kiểu nhu động để trộn mẫu hoặc dùngmáy lắc

Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để pipet (6.2) ở tư thế nằm ngang(không để đứng) khi được làm đầy bằng một thể tích của huyền phù hoặc dung dịch phaloãng thích hợp

Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng để tránh các phần tử có chứa

vi sinh vật lắng xuống

3.5.9.2 Cấy và ủ

Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1 ml mẫu thử dạng lỏng hoặc 0,1 ml huyền phù ban

Dùng pipet vô trùng mới để chuyển 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân thứ nhất(10-1) (sản phẩm dạng lỏng) hoặc 0,1 ml dung dịch pha loãng thập phân 10-2 (sản phẩm ởdạng khác) cho vào đĩa thạch DRBC thứ hai.

Để thuận tiện cho việc định lượng các lượng nhỏ nấm men và nấm mốc, lấy các lượngđến 0,3 ml dung dịch pha loãng 10-1 của mẫu hoặc mẫu thử dạng lỏng, dàn đều trên bađĩa

Lặp lại các thao tác này với các dung dịch pha loãng tiếp theo, sử dụng pipet vôtrùng mới cho mỗi dung dịch pha loãng

Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đếnkhi dịch lỏng hấp thụ hết vào môi trường

Có thể sử dụng kỹ thuật cấy bằng phương pháp đổ đĩa, nhưng trong trường hợpnày sự tương đương của các kết quả phải được đánh giá bằng cách so sánh với kết quảđược cấy trên bề mặt đĩa và có thể không phân biệt sự khác nhau của nấm men và nấmmốc Phương pháp cấy bề mặt có thể cho kết quả định lượng cao hơn Kỹ thuật dàn đĩatạo điều kiện cho các tế bào tiếp xúc tối đa với oxi của không khí và tránh mọi nguy cơmất hoạt tính do nhiệt của các chồi nấm Các kết quả có thể phụ thuộc vào từng loại nấm

Ủ các đĩa đã chuẩn bị trong môi trường hiếu khí, nắp hướng lên trên, tư thế thẳngđứng trong tủ ấm ở 250C ± 10C trong 5 ngày Để yên các đĩa thạch trong ánh sáng khuếchtán từ 1 ngày đến 2 ngày, nếu cần

Nên ủ các đĩa trong túi chất dẻo ở để không làm nhiễm bẩn tủ ấm trong trườnghợp nấm mốc lan ra ngoài đĩa

CHÚ THÍCH 1 Các phương pháp định lượng nấm men và đặc biệt là nấm mốc là không chính xác, vì chúng là một hỗn hợp của hệ sợi nấm và các bào tử vô tính và hữu tính Số lượng đơn vị hình thành khuẩn lạc phụ thuộc vào mức độ phân đoạn của sợi nấm và tỷ lệ các bào tử có thể mọc trên môi trường đổ đĩa.

CHÚ THÍCH 2: Thường xuất hiện sự không tuyến tính của các số đếm từ các đĩa dung dịch pha loãng; nghĩa là các dung dịch pha loãng 10 lần của mẫu thường không cho các kết quả nhỏ hơn 10 lần về số đếm khuẩn lạc thu được trên các môi trường đổ đĩa Điều này là do sự phân đoạn của hệ sợi nấm và việc tách các cụm bào tử trong quá trình pha loãng làm ức chế cạnh tranh khi các lượng lớn khuẩn lạc có mặt trên các đĩa

CẢNH BÁO - Các bào tử nấm mốc phân bố trong không khí rất mạnh, nên cần thao tác với các đĩa Petri cẩn thận để tránh làm phát triển các khuẩn lạc vệ tinh mà

có thể cho ước tính kết quả quá cao.

Tiến hành kiểm tra bằng kính khuếch đại hai thị kính (6.9) hoặc bằng kính hiển vi (6.7)

để phân biệt giữa các tế bào nấm men hoặc nấm mốc và vi khuẩn từ các khuẩn lạc, nếucần

Đếm các khuẩn lạc nấm men và các khuẩn lạc/chồi nấm mốc riêng rẽ, nếu cần

Để nhận biết nấm men và nấm mốc, chọn các vùng phát triển nấm và lấy ra để kiểm trabằng kính hiển vi hoặc cấy trên môi trường phân lập hoặc nhận dạng thích hợp

3.5.11.Biểu thị kết quả và giới hạn tin cậy

Ghi lại các khuẩn lạc nấm men và các khuẩn lạc/chồi nấm mốc riêng rẽ, nếu cần

3.6. ĐỊNH LƯỢNG STAPHYLOCOCCI THEO TCVN 4830-1:2005

3.6.1 Phạm vi áp dụng

Tiêu chuẩn này quy định phương pháp định lượng staphylococci có phản ứngdương tính với coagulase trên đĩa thạch có mặt trong các sản phẩm dùng cho con ngườihoặc thức ăn chăn nuôi, bằng cách đếm số khuẩn lạc thu được trên môi trường đặc (môitrường Baird-Parker) sau khi ủ trong điều kiện hiếu khí ở 35 °C đến 37 °C

3.6.2.2 Định lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase (enumeration of the coagulase-positive staphylococci)

- việc xác định số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase tìmthấy được trong một mililit hoặc trong một gam mẫu khi tiến hành thử nghiệmtheo phương pháp quy định trong tiêu chuẩn này

3.6.3 Nguyên tắc

Cấy lên bề mặt của môi trường cấy đặc chọn lọc, sử dụng hai đĩa, dùng một lượngmẫu thử quy định nếu sản phẩm ở dạng lỏng, hoặc với một lượng huyền phù ban đầu quyđịnh nếu sản phẩm ở dạng khác

Trong cùng một điều kiện, cấy các dung dịch pha loãng thập phân của mẫu thửhoặc của huyền phù ban đầu, dùng hai đĩa cho mỗi độ pha loãng

Ủ các đĩa trong điều kiện hiếu khí ở 35 °C hoặc 37 °C 1) và kiểm tra sau 24h và48h.

Tính số lượng staphylococci có phản ứng dương tính với coagulase trong mộtmililit, hoặc trong một gam mẫu từ số lượng khuẩn lạc điển hình và/ hoặc không điểnhình trên các đĩa ở các bộ phận pha loãng đã chọn sao cho kết quả có ý nghĩa và đượckhẳng định bằng kết quả thử coagulase dương tính

3.6.4 Dịch pha loãng và môi trường cấy

3.6.4.1 Yêu cầu chung

Đối với thực hành trong phòng thí nghiệm, xem TCVN 6404 (ISO 7218)

3.6.4.2 Dịch pha loãng

Xem TCVN 6507 (ISO 6887-1) và tiêu chuẩn riêng liên quan đến sản phẩm cần kiểm tra

3.6.4.3 Môi trường thạch Baird-Parker 2)

CHÚ THÍCH: Có thể sử dụng môi trường bán sẵn, trong trường hợp này phải theo đúng các chỉ dẫn của nhà sản xuất

• Thành phần

Pepton từ caseinCao nấm men Cao thịt

Natri pyruvatL-GlyxinLiti cloruaThạch

10,0 g1,0 g5,0 g10,0 g 12,0 g5,0 g

12 g đến 22 g 1)