BO KHOA HOC & CONG NGHE
VIEN CONG NGHE SINH HOC
BAO CAO TONG KET KHOA HOC VA KY THUAT
Du án:
"HOAN THIEN VA TRIEN KHAI CONG NGHE SAN XUAT CHE PHAM
SINH HOC PHUC VU XU LY MOI TRUONG NUOI TRONG THUY SAN"
TS Võ Thị Thứ
Hà Nội, 3/2006 Bản thảo viết xong 3/2006
Tài liệu này chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện Dự án cấp Nhà nước,
mã số: KC-04-DA08
598A
Trang 2DANH SACH CAC TAC GIA THAM GIA DU AN
SAN XUAT THU NGHIEM CAP NHA NUGC (Danh sách những cá nhân đã đĩng gĩp chủ yếu cho đự án)
1 Tên dự án: “Hồn thiện và triển khai cơng nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục
vụ xử lý mơi trường nuơi trồng thuỷ sản”
2 Thuộc chương trình: Khoa học và Cơng nghệ cấp Nhà nước: “Nghiên cứu Khoa học và phát triển cơng nghệ sinh học, giai đoạn 2001-2005”, mã số: KC-04 3 Thời gian thực hiện: 2 năm từ 01/01/2004 đến 31/42/2005
4 Cơ quan chủ tr" Viện Cơng nghệ sinh học 5 Bộ chủ quản: Bộ Khoa học và Cơng nghệ 6 Danh sách các tác giả tham gia dự án
TT | Ho va tén, học hàm, học vi Cơ quan cơng tác Chữ ký
ï ]T§ Võ Thị Thứ Viện Cơng nghệ Sinh học | 7/2 „ ⁄
2 | TS Trân Văn Sỹ Viện Cơng nghệ Sinh học ABE 3 | CN Pham Thi Minh Ha Vién Cong nghé Sinh hoc = 4 | CN Dao Thi Thanh Xuan Vién Cong nghé Sinh hoc \ưx 0_—
53 | KS Trương Ba Hùng Viện Cơng nghệ Sinh học (P.17 8a mm
6 | KS Lê Thị Thu Hiển Viên Cơng nghệ Sinh học ÿhulưựn —
7 | KS Lê Danh Toại Viện Cơng nghệ Sinh học Ub 8 | KS Lé Tran Vinh Vién Cong nghé Sinh hoc durA—
9 | KS Nguyén Tréng Son Vién Cong nghé Sinh hoc _ Aide — | 10 | KS Trần Minh Đức Viện Cơng nghệ Sinh học AM —_
11 | KS Nguyễn Kim Mạnh Cơng ty TẮCN HaCo CAM H8
Trang 3TRÍCH LƯỢC NHỮNG ĐIỂM CHÍNH CỦA THUYET MINH DU AN
Trang 4THUYET MINH DU AN
SAN XUAT THU NGHIEM CAP NHA NUGC
I THONG TIN CHUNG VE DU AN
1
ta
p9
Tên dự án: Hồn thiện và triển khai cơng nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ xử lý mơi trường nuơi trồng thủy sản
Thuộc chương trình khoa học và cơng nghệ cấp nhà nước KC - 04 "Nghiên cứu khoa học và phát triển Cơng nghệ Sinh học"
Mã số: KC - 04 - DA08
Cấp quản lý: Bộ Khoa học và Cơng nghệ
Thời gian thực hiện: 24 tháng, từ tháng 1/2004 đến tháng 12/2005
Kinh phí thực hiện : 5060 triệu đồng
Trong đĩ từ ngân sách sự nghiệp khoa học: 2160 triệu đồng
Thu hồi:
Kinh phí đề nghị thu hồi: 1290 triệu đồng (60% kinh phí hỗ trợ từ ngân sách) Thời gian để nghị thu hồi (sau thời gian thực hiện)
Đợt 1: 12 tháng (tháng12/2006) Dot 2: 18 tháng (tháng 6/2007) Tổ chức đăng ký chủ trì thực hiện dự án:
Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam Địa chỉ: 18A Hồng Quốc Việt, Câu Giấy, Hà Nội
Cá nhân đăng ký chủ nhiệm dự án: Võ Thị Thứ
Học vị: Tiến sĩ
Địa chỉ: 15A Hồng Quốc Việt, Cầu Giấy, Hà Nội
Điện thoại cơ quan: 7564333 (1119) NR: 8460405
Email: Vo_thithu@yahoo.com DD: 0904221553
Trang 51 Mục tiêu của Dự án
" Sản xuất CP vi sinh cải thiện mơi trường và hạn chế dịch bệnh cho tơm, cá với qui mơ 30 tấn/năm
" Mỏïrộng phạm vi ứng dụng chế phẩm ra nhiều địa phương
2 Nội dung của Dự án
- Hồn thiện cơng nghệ sản xuất giống ổn định: Chọn giống cĩ hoạt tính sinh học ổn định (sinh enzym amylase, protease; đối kháng với vi sinh vật gây bệnh tơm cá, an tồn với động vật nuơi), Hồn thiện qui trình nhân giống cấp I, cấp II (ổn định các thơng số kỹ thuật như: mơi trường, nhiệt độ, tỷ lệ giống, thời gian )
- Hồn thiện cơng nghệ lên men sản xuất chế phẩm: ổn định các thơng số kỹ thuật: mơi trường, nhiệt độ, pH, % tiếp giống, điều kiện lên men, thời gian lên men
- Hồn thiện cơng nghệ thu hồi, tạo chế phẩm và bảo quản chế phẩm: thu hồi sinh khối và tạo chế phẩm Biochie: giảm thiểu ơ nhiễm mơi trường nước nuơi; BioF: giảm thiểu dịch bệnh, tăng khả năng hấp thụ thức ăn, tăng trưởng nhanh
- Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và qui trình kiểm nghiệm chế phẩm : Xác định
đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, bào tử; đạc điểm sinh hĩa (catalase,
lên men đường sinh axit, lên men sữa sinh axit ), số lượng vi khuẩn/gam (ml) phải dat 10°
- Xây dựng mơ hình ứng dụng chế phẩm và triển khai áp dụng cơng nghệ: Ứng dụng chế phẩm tại 3 địa phương với qui mơ 1-5 ha/mơ hình, chuyển giao qui trình cơng nghệ sản xuất cho cơ sở
Trang 6- Qui trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm BioF: 3 tấn/ năm
- _ Quy trình kiểm nghiệm Biochie, Biof
- _ Mơ hình ứng dụng với qui m6 1-1,5 ha: 3 mơ hình
-_ Sản xuất chế phẩm Biochie, BioF tiêu chuẩn đạt 10° CFU/ gam (m]), số lượng: 60.000 kg (lit) Ill TONG VON ĐẦU TƯ (Bang 1) TT | Nguồn | Tổng Trong đĩ yốn cộng (triệu Vốn cố định Vốn lưu động đồng)
Thiết | Hồn | Xây | Lương | Nguyên | Khấu | Cơng
bị | thiện | dựng | thuê | vật liệu hao tác phí,
Trang 7
TT | Tênsản phẩm | Đơn Mức chất lượng Ghi chú
và chỉ tiêu chất | vị đo | Cần đạt Mẫu tương tự
lượng chủ yếu Trong Thế giới
nước
1 |BiochieB Kg 10" CFU 10" CFU
2 | Biochie D lit 10" CFU 10"! CFU
3 | BioF B Kg | 10° CFU 10"! CFU
4 | BioF D lit 10"! CFU 10°! CFU
Trang 8LOI CAM ON
Chúng tơi xin chân thành cảm ơn Bộ Khoa học và Cơng nghệ, Ban Chủ nhiệm chương trình KC-04 đã hướng dẫn, quản lý và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho Dự án hồn thành tốt các nội dung đã ký hợp đồng với Bộ Khoa học và Cơng nghệ, Ban Chủ nhiệm chương trình
Chúng tơi xin trân trọng cảm ơn Lãnh đạo Viện Cơng nghệ sinh học, Viện
Khoa hoc và Cơng nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tơi tận tình vẻ
sử dụng trang thiết bị, về chỉ tiêu, thanh quyết tốn tài chính và những thủ tục cần
thiết trong quá trình thực hiện dự án
Chúng tơi xin được cảm ơn sự tin tưởng và hợp tác của các cơng ty: Cơng ty Cổ
phần thức ăn chăn nuơi Haco, Nam Định; Cơng ty Cơng nghiệp tàu thuỷ Quảng Bình, Cơng ty TNHH Phúc Hà, Cơng ty TNHH Việt Tiến, Cơng ty kinh doanh tổng hợp Quảng Bình trong việc đưa sản phẩm của dự án ra thị trường
Trang 9Ba BOD BOD, BT CFU CoD cP DO DLM DC DD La LM MT MTBC MTCC NG NTTS Ag VSV CAC CHU VIET TAT : Bacillus
: Nhu cầu oxy sinh hố
: Nhu cầu oxy sinh hố sau 5 ngày
: Bào tử
: Đơn vị tạo khuẩn lạc
: Nhu cầu oxy hố học : Chế phẩm : Oxy hồ tan : Dịch lên men : Đối chứng : Đặc điểm : Khuẩn lạc : Lactobacillus : Lên men : Mơi trường
: Mơi trường nước bap cai
Trang 10LOIMG DAU SH tre Tre 1
I:P0)919))/649)0)07 7 ,),.,,.),HDHHHH ẰẲ 3
1.1 Tình hình phát triển nghề nuơi trồng thủy sẵn ở nước ta 2ccessiceecrre 3
1.1.1 Hiện trạng mơi trường và dịch bệnh trong hoạt động nuơi trồng thuỷ sẳn 4 1.12 Hiện trạng sử dụng chế phẩm sinh học trong mơi trường nuơi trắng thủy sản 5 1.2 Ché phd simh hoc (probiotics) .cscssssssssssssossessssesseesesssssescscsssssssessesnsssseseusenssessessessseseseessesseees 6
1.2.1 Cơ sở khoa học của việc sử dụng vi khuẩn trong sản xuất chế phẩm probiotic 7 1.2.2 Những nhĩm vì sinh vật thường được sử dụng trong sẵn xuất chế phẩm sinh học § 1.2.2.1 Vi khudn Bacillus và quá trình phân giải các hợp chất hữu cơ dưới tác dụng của hệ
©nzym prOledse, aI'I(AS€, C€ÌÏỤ49€ c co Street rerkrrerrrerrr 10
1.2.2.2 Vị khuẩn Lactobacillus và tác dụng phịng ngừa bệnh co 11 1223 C ác yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phái triển của vì khuẩh -cceccceceee 13
1.3 Đặc điểm nước nuơi tơm, cá và những chỉ số cơ bản đánh giá nước nuơi 14
143.1 Đặc điểm nước nuơi fƠïH cá à cccccvevctrrrtrrtiiiererrrrrrrririirirrrrrrrrrrrriee 14
1.3.2 Những chỉ số cơ bản đánh gid nu6c nui tOm C6 15
1.3.3 Yêu cầu VỀ THƯỚC MUG OMA CE osccescssssssssssssssssssssessessssnsssessesnssnsssennenneeneoneanneonnnnennienennennansennecnneenseett 17
1.4 Các bệnh thường xảy ra cho tơm khi ao nuơi bị nhiễm bẩn 18 PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CÚU s 2 21 2.1 Đối tượng nghiên cứu và lập luận về việc chọn đối tượng nghiên cứu BÀI
2.2 Phương pháp nghiên cứu và lập luận về phương pháp nghiên cứu 2
2.2.1 Phương pháp nghiÌÊn CỨU .ecceHHe HH HH de 22
Trang 112.2.1.3 Nghiên cứu một số yếu tố Gnh hung dén qua trinh 1EN MN vevsecccsccsssesssssvsvsssseesssssesessssssseess 23 2.2.1.4 Thu héi sinh khơi, tạo chế phẩm Biochie, BioF' và bảo quản chế phiẩm 24
2.2.1.5 Phương pháp định tính VK nghiÊH CÍM ccecei Hee 25
2.2.1.6 Phương pháp xác định độ tinh khiết của chế phẩm eeceereecerriiriiicecrre 26 3.2.1.7 Phương pháp định ÏƯỢNG, «Hee 26 2.2.1.8 Xây dựng mơ hình ứng dụng sản phẩm
2.2.2 Lập luận về phương pháp nghiÊn CÍN .ecccccereiHeirriarrre 27
PHAN IIL KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 2 2222222221e 29
3.1 Hồn thiện cơng nghệ sản xuất giống ổn GiMW .eeseecsscsssssssssscsessssssecssssssseneisrsssssssecesenesetves 30
3.1.1 Chọn chủng cĩ hoạt tình sinh học ổn định, an tồn với động vật nuơi 30
341 1 Thử an ÍỒNH SH TH HH TH HH TH TT LL T.1A010-1111011.T1110711021.L 30
3.1.1.2 Đối kháng với vi khudin gay Dent 16M, CG srssessssssssssesssesessensessossssesssssensssesesssutssssssssnseseseesssvasssee 31 3.1.1.3 Hoat tinh phn hi} Witt CO ssicssseceeinmnneiieenenennnsneinnananeninnnmtnenenene 32
L8 (co Tran n ƠỎ 33
3.1.2 Hồn thiện qui trình nhân giống 34
3.1.2.1 Hồn thiện qui trình nhân giống BacilÏus «eecceceeeiHereiirie 34
3.1.2.2 Hồn thiện qui trình nhân giống [actobdqcilÏus -ccxeceeerrrrirrrrrriirrree 35
3.2 Hồn thiện cơng nghệ lên men sản xuất chế phẩm
“nan 37
3.2.2 Lén men Bacillus, Lactobacillus trén mOi truOng XOP seseescosonessssssessseccnnesssseseeseeseeneeceeassanaseess 40
3.2.2.1 Lên men Lactobacillus trên mơi trường xốp " ,ƠỎ 40
3.2.2.2 Lên men Bacillus trên mơi IFHỊNg XỐN) «« Hee 42 3.3 Hồn thiện kỹ thuật thu hỏi sinh khối, tạo chế phẩm và bảo quản chế phẩm 46
Trang 123.3.2 Hồn thiện kỹ thuật tạo chế phưổm eo 48 3.3.2.1 Tạo chế phẩm BiOF cssssssssesssssssssssssssssssssssvsssssssesevssussssssonssserssessesesssussuassaanssasensseseeseunasssssesesnies 48 3.3.2.2 Ta0 ChE Phd 7 .nn ƠỎ 50 3.3.3 Hồn thiện kỹ thuật bảo quản chế phÁằ occceccecrrrrrriiiiiirrrrrrie 52
3.4 Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và quy trình kiếm nghiệm chế phẩm 53
3.4.1 Tiêu chuẩn cơ sở va qui trình kiểm nghiệm chế phẩm Biochie c.eecee 53
3.4.2 Tiêu chuẩn cơ sở và quả trình kiểm nghiệm chế phẩm BioF cecsieee 57 3.5 Xây dựng mơ hình ứng dụng chế phẩm và triển khai áp dựng cơng nghệ 59
3.5.1 Xây dựng mơ hình ứng dụng chế phẩm tại địa phương ceeeeriiieiiie 59
3.5.2 Triển khai áp dụng cơng nghệ
3.6 Xay dựng qui trình sản xuất chế phẩm . -5SSSssireerrirrirrriree 64 3.6.1 Qui trình sản xuấi chế phẩm Biochie (30 tấn! năm) ii 64
3.6.2 Qui trinh sin xudt chế phẩm BioF (3 tấn! năn, ii 69
3.7 Sản xuất chế phẩm, doanh thu sản phẩm và giá thành sản phẩm 72
3.8 Đào tạo cán bộ, cơng nhânn HH me 0e 74
PHẦẨN IV KẾT QUẢ NỔI BẬT 2 2 2tt11,221 111.2117.771 ce 7?
PHẦN V KẾT LUẬN -2 21 47.11.0.11.212.121 -.-.1.1020007 20 xe 79
.\0ni9áy:/) 64 (Ta .Ơ 81
Trang 13DANH MUC CAC BANG TT Tén bang Trang
Bảng 1.1 [ Các lồi vi khuẩn sử dụng để xử lý mơi trường 10
Bảng 1.2 | Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của tơm cá 15
Bang 1.3 Một số chỉ tiêu của nước nuơi trồng thuỷ sản 17
Bang 1.4 | Cac thong số mơi trường nuơi thích hợp cho tơm sú thâm canh 18 Bang 3.1 | Kết quả thử độc tính cấp của chế phẩm Biochie 30 Bang 3.2 | Kết quả thử độc tính cấp của chế phẩm BioF 31 Bang 3.3 | Kiém tra kha nang đối kháng với vi khuẩn gây bệnh tơm cá 31 Bảng 34 _ | Khả năng sinh enzym phân huỷ hữu cơ của vi khuẩn 32 Bang 3.5 | Thành phân mơi trường nhân giống Baciilzs thích hợp 34
Bang 3.6 | Nbiét do nhan gidng Bacillus thich hop 35
Bang3.7 | Tye giéng thich hop 35
Bang 3.8 | Thanh phan m6i tudng nhan giong Lactobacillus thich hop 36 Bang 3.9 | Nhiét do nhan giong Lactobacillus thich hop 36
Bang 3.10 ] pH mơi trường nhân giống Ƒ acfobaciiius thích hop 36 Bảng3.1L | Tỷ lệ giéng Lactobacillus thich hop 37 Bảng3.12 | Xác định độ thơng khí trong binh lén men Bacillus, Lactobacillus 38 Bảng 3.13 Lama chọn thành phần mơi trường lên men Bac7is thích hợp 39
Bảng 3.14 | Thoi gian lén men Bacillus va Lactobacillus thích hợp 39
Bang 3.15 | Tý lệ giống thíchhợp 40
Bảng 3.16 | Nguồn cacbon thích hợp đối với lên men /zcfobacilis trên mơi 4I trường xốp
Bảng 3.17 | Thời gian lên men thích hợp 4I
Bảng 2.18 | Kiểm tra sựổn định của lên men /acfobacillus trên mơi trường xốp 42
Bảng 3.19 | Thành phân lên men Ưzciis trên mơi trường xốp 4
Bang 3.20 Í Ảnh hưởng nguồn cacbon dén qué trinh lén men Bacillus én mơi 43
trường xốp :
Bang 3.21 | Nhiệt độ lên men Baciius trên mơi trường xốp thích hợp 44
Bang 3.22 | Tỷ lệ giống thích hop 44
Bảng3.23 | Thdi gian lén men Bacillus trén mơi trường xốp thích hợp 45 Bang 3.24 | Sưốn định của các mẻ lên men Bacillus trên mơi trường xốp 45 Bang 3.25 | Kết quả thu hồi sinh khốt bằng ly tâm 46
Trang 14Bang 3.26
Kết qua thu hồi sinh khối bằng phương pháp tủa với bentonit 47 Bang 3.27 | Kết quảthu hồi bằng phương pháp trợ lọc với điatomit 47
Bang 3.28 | Ổn định kỹ thuat say d6i voi Lactobacillus 48
Bang 3.29 | Thành phân cơng thức tạo chế phẩm BioF đạng bột 49
Bảng 3.30 | Thành phần cơng thức tạo chế phẩm BioF dạng dịch 49 Bảng 3.3! | Nhiệt độ sấy thích hợp đối với chế phim lén men Bacillus 51
Bảng 3.32 | Thành phần cơng thức tạo chế phẩm Biochie dạng bột 51
Bảng 3.33 | Thành phần cơng thức tạo chế phẩm Biochie dạng dịch 51
Bảng 334 | Bao quan ché phim Biochie dạng dịch 52
Bang 3.35 | Bảo quản chế phẩm Biochie dạng bột 52
Bảng3.36 | Bảo quản chế phẩm BioF dạng bột 53
Bảng 3.37 | Bảo quản chếphẩm BioF dạng dịch 53
Bang 3.38 | Tĩm tất các tiêu chuẩn của chế phẩm Biochie 54
Bang 3.39 | Tiêu chuẩn định tính của chế phẩm Biochie 54
Bang 3.40 | Tĩm tắt các tiêu chuẩn của chế phẩm BioF 57
Bang 3.41 | Tiêu chuẩn định tính của chế phẩm BioF 57 Bang 3.42 | Tác dụng của chế phẩm đối với việc cải thiện mơi trường nuơi 60 Bang 3.43 | Tác dụng của chế phẩm đối với sự tăng trưởng của tơm 60 Bảng 3.44 | Đánh giá tác dụng của chế phẩm qua tính tốn hiệu quả kinh tế 60
Bang 3.45 | Tác dụng của CP Biochie, BioF đối với mơ hình nuơi tơm càng xanh 61
thâm canh tại xã Đơng Mỹ, Thanh Trì
Bảng 346 | Tác dụng của CP Biochie, BioF đối với tơm sú tại xã Ham Ninh, 61
Quang Ninh, Quang Binh
Bang 3.47 | Kết quả phân tích chỉ số mơi trường của ao cá 62
Bang 3.48 | Đánh giá sự phát triển của cá 63
Bang 3.49 | Đánh giá hiệu quả kinh tế 63
Bảng3.50 | Số lượng từng loại chế phẩm sản xuất được tại Cơng ty CN 63
Tàu thuỷ, QB
Bang 3.51 | Số lượng sản phẩm Biochie, BioF sản xuất được 72
Bảng 3.52 | Doanh thu bán sản phẩm 73
Bảng 3.53 | Giá thành sản phẩm trung bình cho 1.000 lit Biochie dang lỏng 73 Bảng 3.54 | Giá thành sản phẩm trung bình cho 1.000 kg Biochie dạng bột 74 Bang 3.55 | Danh sách kỹ sư, cử nhân được đào tao trong dự án KC-04-DA08 75 Bảng 356 | Danh sách cán bộ kỹ thuật của doanh nghiệp được đào tạo trong dựán | 76 KC-04-DA08
Trang 15DANH MUC CAC HINH TT Tén hinh Trang
Hình 3.1 | Khả năng sinh protease cua B lichenifomis G1, B subtilis D2, B megateriumPA | 32
Hinh 3.2 | Kha nang chiu man của các chủng vi khuẩn 33
Hình 3.3 | Quy trình kiểm nghiệm chế phẩm Biochie 56
Hình 3.4 | Quy trình kiểm nghiệm chế phẩm BioF 58
Hinh 3.5 | Qui trinh san xuat ché phdm Biochie 65
Hình 3.6 | Mơ hình hệ thống lên men Bacillus 67
Hình 3.7 | Qui trình sản xuất chế phẩm BioF 70
DANH MỤC CÁC QUY TRÌNH
TT Tên qui trình Trang
1 Quy trình kiểm nghiệm chế phẩm Biochie 56
2 Quy trinh kiém nghiém ché phdm BioF 58
3 Qui trình sản xuất chế phẩm Biochie (30 tấn/ năm) 65 4 Qui trình sản xuất chế phẩm BioF (3 tấn/ năm) 70
Trang 16
LOI MG DAU
Ngành nuơi trồng thuỷ sản đang thu hút nhiều người tham gia và cũng đã đĩng
gĩp đáng kể vào sự tăng trưởng kinh tế Tuy nhiên, NTTS cũng đang phải đối mặt với thực trạng hết sức khĩ khăn hiện nay là suy giảm mơi trường và dịch bệnh, gây thiệt
hại kinh tế cho nhiều người Phần lớn các đầm tơm bị thất bại là do mơi trường bị
nhiễm bẩn Thực trạng ơ nhiễm hữu cơ của ao đầm là phổ biến Nguyên nhân là do chúng ta đưa vào ao nuơi một lượng thức ăn tổng hợp mà trong đĩ chỉ cĩ 17% lượng thức ăn được đồng hố thành sinh khối tơm, cịn lại là khơng ăn được đo bị hồ tan trong nước boặc bài tiết ra ngồi mơi trường [5] Lượng thức ăn thừa cùng với uế thải hữu cơ và phế thải do lột xác để duy trì hoạt động sống của tơm cùng với xác của
động vật thuỷ sinh phù du là những yếu tố làm cho ao nuơi bị nhiễm hữu cơ Ngồi sự ð nhiễm hữu cơ, mơi trường nuơi cũng thường bị nhiễm kháng sinh, hố chất sử dụng để xử lý và phịng chống bệnh Khi ao đầm bị nhiễm bẩn là cơ hội cho những nhĩm
VSV cĩ hại phát triển mạnh mẽ, khơng kiểm sốt được và hậu quả là vật nuơi bị bệnh Cĩ khi bệnh phát thành dịch do lây lan Qua khảo sát cho thấy cĩ hơn 50% số cơ sở nuơi tơm trong cả nước bị bệnh [10] Đặc biệt nhĩm bệnh cơ hội do V?brïo gây ra như
bệnh phát sáng, bệnh đen mang, bệnh ăn mịn vỏ kitin, bệnh mịn đuơi, cụt râu chỉ phát sinh khi nước nuơi bị nhiễm bẩn Thực trạng vấn đề ơ nhiễm mơi trường nuơi ở
nước ta là rất nghiêm trọng Một số địa phương cĩ phong trào nuơi tơm thâm canh sớm như Khánh Hồ, Phú Yên thời gian qua đã khơng cịn khả năng nuơi nữa Bởi vậy, việc xử lý mơi trường trong quá trình nuơi nhằm cải thiện mơi trường nước và
phịng ngừa dịch bệnh là cấp thiết
Trước đây, hố chất, kháng sinh thường được sử dụng để xử lý mơi trường nuơi
và phịng ngừa bệnh Tuy nhiên, ngồi những tác dụng mong muốn, kháng sinh và hố chất gây ra nhiều ảnh hưởng đến mơi trường và con người Trước hết, chúng tồn
lưu trong mơi trường thủy sinh, ảnh hưởng đến sự cân bằng của hệ VSV trong ao
Nghiêm trọng hơn là dư lượng kháng sinh trong vật nuơi vi phạm vấn đề vệ sinh an
Trang 17Phát triển NTTS bên vững đang là xu thế phát triển kinh tế đúng đắn của nước
ta hiện nay nhằm tạo ra sản phẩm sạch và sản xuất khơng làm ảnh hưởng đến mơi
trường Vì vậy, chọn giải pháp thích hợp để xử lý mơi trường nuơi là rất quan trọng
Phương pháp sử dụng chế phẩm sinh học cĩ chứa các VSV mang những đặc tính hữu ích (phân huỷ hữu cơ, đối kháng với VK gây bệnh ) để xử lý mơi trường, tăng khả
năng phịng bệnh của vật nuơi đã được những nước cĩ sản lượng thủy sản xuất khẩu
cao trên thế giới áp dụng (Trung Quốc, Malayxia, Ấn Độ, Thái Lan ) Việt Nam
cũng là nước cĩ sản lượng xuất khẩu thuỷ sản khá cao, vì vậy nhu cầu về chế phẩm
sinh học và thuốc thú y thuỷ sản rất lớn Tuy nhiên, phần lớn các đơn vị tham gia sản xuất, kinh doanh chế phẩm sinh học, thuốc thú y thuỷ sản đều nhập cơng nghệ hoặc
chế phẩm từ nước ngồi Do giá bán của nhiều chế phẩm khá cao, cách sử dụng phức tạp (thường phải hoạt bố trước khi sử dụng) nên gây tâm lý ngại sử dụng cho người dân Mặt khác, cũng cần phải quan tâm đến vấn đề an tồn sinh học vì khơng kiểm sốt được VSV nhập ngoại và những tác hại sẽ xẩy ra
Để đáp ứng nhu cầu thực tiễn, chúng tơi đã tiến hành thực hiện dự án “Hồn thiện và triển khai cơng nghệ sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ xử lý mơi trường nuơi trồng thuỷ sản” Dự án đã thực hiện những nội dung sau:
- _ Chọn giống phục vụ cho việc sản xuất chế phẩm
- _ Hồn thiện kỹ thuật nhân giống các cấp
- Hồn thiện quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm xử lý mơi trường NTTS Biochie (30 tấn/ năm)
- Hoan thiện quy trình cơng nghệ sản xuất chế phẩm phịng ngừa bệnh BioF
(3 tấn/ năm)
- _ Xây dựng quy trình kiểm nghiệm chế phẩm Biochie, BioF - _ Xây dựng mơ hình ứng dụng chế phẩm tại địa phương - _ Sản xuất thử nghiệm
Trang 18PHAN I: TONG QUAN
1.1 Tình hình phát triển nghề nuơi trồng thủy sản ở nước ta
Trong những năm qua, nuơi trồng thuỷ sản được phát triển mạnh, gĩp phần tích cực vào việc phát triển kinh tế, xã hội Nuơi cá nước ngọt, baba, ếch cũng cĩ tốc độ tăng nhanh tạo cơng ăn việc làm và tăng thu nhập cho một bộ phận khơng nhỏ ở nơng thơn Theo Lê Thành Lựu [4], đến năm 2010, sản lượng nuơi trồng thuỷ sản sẽ đạt trên 2 triệu tấn, đĩng gĩp tới 57% trong tổng sản lượng thuỷ sản, tạo việc làm và thu nhập cho khoảng 2 triệu người
Trong lĩnh vực nuơi trồng thuỷ sản, con tơm là đối tượng thu hút nhiều người tham gia Tơm cũng là mặt hàng xuất khẩu chiếm thị phần đáng kế trong kim ngạch
xuất khẩu thủy sản của nước ta Hàng năm, riêng tơm đã thu được hàng tỷ USD Tơm sú và nghề nuơi tơm sú đã từng mang lại lợi nhuận cao, gĩp phần khơng nhỏ trong việc phát triển kinh tế của nhiều vùng Cơng nghệ nuơi tơm sú cũng từng bước được
hồn thiện từ nuơi quảng canh ở những vùng cĩ nhiều diện tích đến bán thâm canh và
thâm canh với mật độ cao (40-50 con/ m?) Trong thời gian qua, nuơi tơm bán thâm canh và thâm canh phát triển khá nhanh, tạo cơ hội du nhập cơng nghệ nuơi tiên tiến của các nước trong khu vực và trên thế giới vào Việt Nam, nhanh chĩng thay thế cho nuơi quảng canh lạc hậu, kém hiệu quả và phá huỷ mơi trường tự nhiên [10]
Một số cơ sở nuơi tơm thâm canh cũng bắt đầu đánh giá được vai trị quan trọng của việc quản lý mơi trường nuơi nên đã chú ý đầu tư cơ sở hạ tầng đúng yêu cầu kỹ thuật Xây dựng đầm, ao nuơi, hệ thống cấp thốt nước tương xứng với yêu cầu Tuy vậy, phần lớn cơ sở nuơi chưa nhận thức được tầm quan trọng của việc bảo
vệ mơi trường nhằm đảm bảo cho nghề nuơi phát triển bên vững
Mặc dù vậy, nuơi tơm thâm canh, đặc biệt là nuơi tơm sú chịu nhiều rủi ro về
Trang 19thiệt hại nếu sản phẩm cịn dư lượng kháng sinh Bởi vậy, rất nhiều cơ sở nuơi tơm bị lỗ nặng
Để phần nào giảm bớt rủi ro cho người nuơi, Nhà nước cũng bắt đầu đầu tư để
đưa ra qui trình, giải pháp cơng nghệ nuơi tiên tiến Cĩ thể kể đến giải pháp kỹ thuật nuơi tơm sú, cá tra, cá basa đảm bảo an tồn vệ sinh thực phẩm của Bùi Quang Té va
cs [8], trong đĩ, nhĩm tác giả đưa ra giải pháp quản lý mơi trường nuơi và quản lý sức khoẻ tơm cá bằng sử dụng nhĩm hố được và chế phẩm sinh học an tồn Điều đặc biệt là 2 trong số 10 chế phẩm sinh học được chọn để sử dụng là sản phẩm của
du An KC-04-DA08 [8]
1.1.1 Hiện trạng mơi trường và dịch bệnh trong hoạt động nuơi trồng thuỷ sản Sự phát triển nhanh chĩng của hoạt động nuơi trồng thủy sản kéo theo tình
trạng ơ nhiễm nặng nề, làm lây lan và bùng phát dịch bệnh Trong điều kiện nuơi tơm
hiện nay, mơi trường ao nuơi rất phú dưỡng Nguyên nhân là do chúng ta đưa vào ao
nuơi lượng thức ăn tổng hợp rất lớn mà chỉ cĩ phần rất nhỏ (17%) lượng thức ăn được
đồng hố thành sinh khối tơm, cịn lại là khơng ăn được do bị hồ tan trong nước hoặc bài tiết ra ngồi mơi trường Lượng thức ăn thừa, uế thải hữu cơ và phế thải do lột xác để duy trì hoạt động sống của tơm cùng với xác động vật thuỷ sinh phù du là những
yếu tố làm cho ao nuơi nhiễm bẩn Cĩ thể nĩi đa số các đâm tơm hiện tại bị thất bại là do mơi trường bị nhiễm bần [1] Sự nhiễm bẩn của ao đầm ngồi ơ nhiễm hữu cơ cịn
nhiễm bẩn do dùng hố chất, kháng sinh trong quá trình nuơi Khi tơm cĩ hiện tượng kém ăn vì thay đổi thời tiết hay lột xác thì dân thường cho hố chất, kháng sinh vào ao nuơi Hay việc sử dụng hố chất khử trùng ao bên cạnh tác dụng mong muốn, các hố chất gây ra những tác hại đối với mơi trường như việc tơn lưu hố chất trong mơi trường thuỷ sinh, làm giảm số lượng vi sinh vật cĩ lợi trong ao (vi khuẩn phân huỷ hữu cơ, vi khuẩn đối kháng với vi sinh vật gây bệnh), làm cho quá trình phân hủy hữu cơ bị đình trệ và hậu quả là mơi trường bị phú dưỡng, kích thích sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh, tăng cơ hội bệnh Hay như việc sử dụng hố chất, kháng sinh trong
Trang 20với dư lượng thuốc hoặc xuất hiện hệ vi khuẩn đường ruột kháng lại các chất kháng khuẩn
Người ta cho rằng, duy trì mơi trường trong sạch là yếu tố cơ bản quyết định sự thành bại của nghề nuơi tơm [1] Tuy nhiên, khơng phải ai tham gia nuơi tơm cũng nhận thức được điều đĩ Nhiều cơ sở chưa cĩ hệ thống cấp thốt nước đúng kỹ thuật Nước trước khi cấp vào đầm, ao và sau khi nuơi, xả ra mơi trường chưa cĩ biện pháp xử lý Các ao hồ được bố trí dày đặc thiếu qui hoạch nên đơi khi nước xả của đầm này là nguồn nước cấp của đầm khác và đĩ là cơ hội để các mầm bệnh lây lan, trở thành dịch Sự thiệt hại do dịch bệnh dẫn đến lỗ nặng trong nuơi tơm xảy ra hàng năm và khắp nơi trong cả nước Theo Lê Xuân Sinh và cs [7], ở đồng bằng sơng Cửu Long, năm 2004 cĩ đến 50% tổng số hộ nuơi bị lỗ nặng Ở khu vực miền Trung, tơm bị
bệnh cịn nhiều hơn, đến 65% số cơ sở nuơi bị bệnh Cĩ nhiều năm, nhiều cơ sở mất
tồn bộ sản lượng Ở miền Bắc, hơn 50% số cơ sở nuơi tơm bị bệnh và gây thiệt hại khơng nhỏ [10] Nhĩm bệnh đốm trắng, đỏ thân, đen mang thường xuất hiện hơn cả Tiếp đĩ là bệnh nấm, ký sinh trùng, bệnh do vi khuẩn như phát sáng Một số bệnh do Vibrio gây ra như bệnh đen mang, bệnh phát sáng, bệnh mịn đuơi, cụt râu chỉ mang tính chất cơ hội khi nước bị ơ nhiễm, đặc biệt ơ nhiễm hữu cơ hoặc khi tơm cá bị stress đo thay đổi nhiệt độ, pH, mật độ thả quá dày, sự thay đổi về độ mặn của nước [ 4, 5, 9] thì nguy cơ bị bệnh là điều khơng tránh khỏi
1.1.2 Hiện trạng sử dụng chế phẩm sinh học trong nuơi trơng thủy sản
Để giảm thiểu những bất lợi của hố chất trong nuơi trồng thủy sản, cần phải
hạn chế việc sử dụng Điều đĩ cĩ nghĩa là phải thường xuyên đối mặt với hàng loạt
van dé 6 nhiễm mơi trường và dịch bệnh Vì vậy, trong những năm gần đây, nghiên
cứu để tìm ra các yếu tố sinh học như probiotics, enzymes gĩp phần cải tạo mơi trường, tăng sức để kháng cho các đối tượng nuơi được tiến hành mạnh mẽ [4] Tuy vây, việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuơi trồng thủy sản hiện nay cũng là vấn để cần bàn Bởi vì hầu hết các sản phẩm hiện nay đang lưu hành trên thị trường là sản phẩm nhập ngoại Theo cơng bố của Sinh và cs [7], thì hiện cĩ 123 loại chế phẩm sinh
Trang 21yếu do các cơng ty cung cấp, phân phối, đại lý cho nước ngồi hay sử dụng cơng nghệ
của nước ngồi để sản xuất và phân phối tại Việt Nam Bởi vậy, dù cho nhiều cơng ty
tham gia chuyển giao tiến bộ khoa học kỹ thuật đến với người nuơi thì trước hết vì
mục đích thương mại để cĩ thể thu càng nhiều lợi nhuận càng tốt chứ khơng phảt vì quyền lợi của người sử dụng Chưa kể đến tác dụng của chế phẩm ra sao bởi vì những
chế phẩm nhập ngoại hay chủng nước ngồi đưa vào Việt Nam cĩ phù hợp với điều kiện của Việt Nam hay khơng thì việc đưa lượng đáng kể chủng vi sinh vật vào Việt
Nam cũng là mối nguy hiểm tiểm tàng, xét về khía cạnh an tồn sinh học
Việc gia tăng mức độ thâm canh và diện tích nuơi trồng dẫn đến mơi trường
càng cĩ chiều hướng xấu đi và nhu cầu về chế phẩm sinh học càng cao Nhất là trong
tình hình thị trường Mỹ và Châu Âu thơng báo cấm nhiều loại kháng sinh sử dụng trong nuơi trồng thủy sản
' Đối với hình thức nuơi tơm bán thâm canh hay nuơi thâm canh, việc sử dụng chế phẩm sinh học được nhìn nhận như biện pháp tích cực nhất Bởi vì chế phẩm sinh học cĩ tác dụng giảm độc trong ao, chủ yếu là NH; và H;S; giảm mùi hơi; cải thiện
màu nước; ổn định pH và cân bằng hệ sinh thái trong ao Chế phẩm sinh học cũng cĩ
tác dụng phịng bệnh, giảm thiểu hiện tượng gây bệnh cho tơm Ngồi ra, việc áp dụng chế phẩm sinh học trong nuơi trồng thủy sản cịn giúp đối tượng nuơi hấp thụ thức ăn tốt hơn, giảm hệ số tiêu thụ thức ăn, tăng năng suất thu hoạch từ 20-30% [22, 24] Bên cạnh đĩ, việc sử dụng chế phẩm sinh học trong nuơi trồng thủy sản sẽ hạn chế sử dụng hố chất và kháng sinh, yếu tố gây ra hậu quả của việc nuơi trồng thủy
sản kém bền vững Thực tế cho thấy, những cơ sở sử dụng chế phẩm sinh học đã đạt
năng suất tơm khá cao, giảm thiểu nguy cơ mắc bệnh
1⁄2 Chế phẩm sinh học (probiotics)
Thuật ngữ probiotic được Lilly và Stiwell để xuất năm 1965 để mơ tả những
chất sinh ra từ vi sinh vật cĩ tác dụng tăng trưởng vi sinh vật hoặc sinh vật khác Năm 1959, R Fuller định nghĩa rõ hơn Probiotics hay vi sinh vat probiotic 1a nhiing vi
sinh vật sống, bổ sung vào thức an cĩ tác dụng cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột và cĩ
Trang 22hơn Probiotic bao gồm vi sinh vật sống cĩ tác dụng hữu ích cho động vat và người khi sử dụng Tác dụng hữu ích bao gồm tác dụng làm cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột hay sinh chất đối kháng làm giảm số lượng cá thể, hay tăng lượng kháng thể kích thích hệ thống miễn dịch hoặc là cung cấp những enzym trong quá trình trao đổi chất của vi khuẩn [23]
Nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật probiotic mới được quan tâm nhiều trong vịng 20 năm trở lại đây, mặc đù tác dụng của chúng đã được nhận thấy từ lâu Elie là
người đầu tiên để nghị sử dụng vi khuẩn Lactic (L debmeckii, L bulgaricus) để kéo đài tuổi thọ cho người
Ngày nay, probiotic được sử dụng khá hiệu quả để phịng và trị bệnh cho người và gia súc Tuy nhiên, việc sử dụng chế phẩm probiotic trong nuơi trồng thủy sản mới chỉ bất đầu trong vịng 10 năm gần đây Chế phẩm cĩ thành phần chính là những vi sinh vật sống cĩ tác dụng tích cực đối với việc cải thiện mơi trường ao nhờ khả năng sinh enzim phân huỷ hữu cơ hay cĩ tác dụng phịng ngừa bệnh đường ruột, tăng khả năng tiêu hố và hấp thụ thức ăn khi trộn chế phẩm vào thức ăn [24]
Quá trình làm sạch mơi trường dựa trên hoạt động sống của nhĩm vi sinh vat, chủ yếu nhĩm vi khuẩn hoại sinh Baci1!us, thường xuất hiện trong nước bị nhiễm bẩn Trong quá trình hoạt động sống, các chất hữu cơ gây nhiễm bẩn được khống hố và
trở thành các chất vơ cơ, các chất khí đơn giản và nước Người ta cho rằng, vi sinh vật
cĩ khả năng phân huỷ được tất cả các hợp chất hữu cơ tồn tại trong thiên nhiên và
nhiều hợp chất hữu cơ tổng hợp nhân tạo Tuy nhiên, mức độ phân huỷ và thời gian
phân huỷ phụ thuộc trước hết vào cấu tạo của chất hữu cơ và một số chất khống làm nguồn dinh dưỡng và tạo ra năng lượng Nhờ đĩ mà chúng sinh trưởng, phát triển đồng thời làm sạch nước, loại bỏ các chất hữu cơ
12.1 Cơ sở khoa học của việc sử dụng vì khuẩn trong sản xuất chế phẩm
probiotic
Đặc điểm quan trọng của vi khuẩn là sinh trưởng nhanh Tuy nhiên, tốc độ sinh
Trang 23hiếu khí và nhiều yếu tố khác Trong điều kiện thuận lợi, tế bào cĩ thể phân chia sau
20-30 phút Như vậy, sau 24 giờ cĩ tới 48-72 vịng tăng đơi số lượng và từ l tế bào cĩ
thể đạt được khối lượng hàng ngàn tấn Tuy nhiên, trong thực tế khơng thể cĩ điều
kiện lý tưởng để tăng sinh khối như vậy Trong điều kiện nuơi cấy bình thường, vi
khuẩn cần cĩ thời gian để làm quen với mơi trường mà chưa thể sinh trưởng ngay Ở
giai đoạn này, thường được gọi pha lag Khi đã qua giai đoạn làm quen, thì vi khuẩn
bắt đầu sinh sản bằng cách nhân đơi theo cấp số nhân Ở giai đoạn này, sinh khối tăng
mạnh, các chất dinh dưỡng trong mơi trường được sử dụng mạnh Khi mơi trường đã cạn kiệt dinh dưỡng, sự tăng trưởng dừng lại và cuối cùng tế bào già đi và chết Tuỳ
theo từng lồi vi khuẩn và điều kiện nuơi cấy mà cĩ thể thu hồi lượng sinh khối tối đa
trong khoảng thời gian thích hợp
Một trong những đặc điểm thuận lợi cơ bản khi sử dụng vi khuẩn để sản xuất
chế phẩm sinh học là tốc độ sinh trưởng nhanh Cĩ thể nuơi cấy vi khuẩn trên cơ chất
rẻ tiền và sinh ra lượng lớn sinh khối một cách ổn định Mặt khác, vi sinh vật cũng là
nguồn cung cấp những enzym cần thiết, thực hiện quá trình sinh học trong những điều
kiện đơn giản, khơng địi hỏi phương pháp phức tạp Những vi sinh vật sử dụng trong sản xuất chế phẩm sinh học phải được lựa chọn trên cơ sở bảo tồn những đặc tính sinh học theo thời gian, khơng cĩ nguy cơ biến đổi về di truyền học
Việc sử dụng vi sinh vật để sản xuất chế phẩm probiotic hồn tồn cĩ cơ sở
khoa học và đáp ứng với nhu cầu thực tiễn bởi vi sinh vật probiotic cĩ những ưu điểm
cơ bản Trước hết là diện tích nuơi cấy nhỏ, tốc độ sinh trưởng nhanh, cĩ thể thu được
lượng sinh khối lớn trong vịng 20-30 giờ Mặt khác; các enzym sinh ra cĩ hoạt lực
cao, nguồn nguyên liệu sử dụng dễ kiếm, phong phú và rẻ tiền Cĩ thể thay đổi một
cách dễ đàng mơi trường nuơi cấy để đạt hiệu quả như mong muốn Đặc biệt, việc sản
xuất khơng phụ thuộc vào sự thay đổi của thời tiết vì điện tích nhỏ nên cĩ thể khơng
chế được nhiệt độ cần thiết
1.2.2 Những nhĩm vì sinh vật thường được sử dụng trong sản xuất chế
Trang 24Chế phẩm sinh học sử dụng trong nuơi trồng thủy sản được sản xuất từ một,
vài hay nhiều nhĩm vi sinh vật, chủ yếu bao gồm các nhĩm vi sinh vat sau:
Trước hết, phải kể đến nhĩm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh: chủ yếu làm sạch mơi trường nhờ khả năng sinh enzym phân huỷ hữu cơ: protease phân huỷ protein,
amylase phan huy tinh bot, cellulase phan hủy cellulose Ngồi chức năng phân huỷ các hợp chất hữu cơ làm sạch mơi trường thì chúng cịn cĩ tác dụng kiểm sốt sự phát triển quá mức vi sinh vật gây bệnh do cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng giữ cho
mơi trường luơn ở trạng thái cân bằng sinh học Nhĩm vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh
bao gồm một số lồi thudc chi Bacillus (Bảng 1.1)
Nhĩm vi khuẩn đĩng vai trị tích cực trong việc kiểm sốt vi sinh vật gây bệnh trong mơi trường nhờ sinh chất đối kháng là nhĩm vi khuẩn Lactic Nhĩm này bao gồm một số loai thudc chi Lactobacillus va mot số trường hợp cịn sử dụng ca Strepiococus Ngồi vai trị kiểm sốt vĩ sinh vật gây bệnh trong mơi trường thì chúng cũng cĩ tác dụng làm giảm mùi hơi của ngư trường Quan trọng hơn cả, sử dụng nhĩm vi khuẩn này cĩ tác dụng hạn chế việc sử dụng kháng sinh, đảm bảo tiêu chuẩn
vệ sinh an tồn thực phẩm cho sản phẩm thủy sản Một số trường hợp, người ta sử dụng nhĩm vi khuẩn này để sản xuất chế phẩm phịng trị một số bệnh do vi khuẩn gây ra Nhĩm vi khuẩn này khi sử dụng để bổ sung vào thức ăn tơm cá, ngồi mục đích
làm cân bằng khu hệ vi sinh vật đường ruột, ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật cĩ
hại, tăng khả năng phịng ngừa một số bệnh đường ruột thì chúng cịn cĩ tác dụng
tăng khả năng tiêu hố và hấp thụ thức ăn, giảm hệ số tiêu thụ thức ăn giúp cho vật nuơi phát triển khỏe mạnh, tăng trưởng nhanh [24]
Nhĩm vi khuẩn khác cũng cĩ vai trị quan trọng trong xử lý mơi trường nuơi trồng thủy sản là nhĩm vi khuẩn tự dưỡng thuộc chỉ Nitrosomonas, Nitrobacter cé tác dụng chuyển hố Nitơ hữu cơ thành Nitơ phân tử, giảm độc cho mơi trường Một
số lồi vi khuẩn được sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học và chức năng của chúng
Trang 25Bảng 1.1 Các lồi vi khuẩn sử dụng để xử lý mơi trường Các lồi vi khuẩn Chức năng Nitrosomonas sp Vi khuẩn tự dưỡng, phân huỷ amon thành nitrit Nitrobacter sp Vị khuẩn tự dưỡng, phân huỷ nitrit thành nitrat Bacillus lichenifomis Bacillus subtilis Bacillus megaterium Bacillus laterospporus Bacillus thuringiensis Lactobacillus acidophilus Lactobacillus lactic Lactobacillus helveticus
Streptococus sp Vi khuẩn kị khí khơng bắt buộc, phân huỷ hữu cơ, cạnh tranh sinh học, giảm sự phát trién cha Vibrio va vi khuan,
nguyên sinh động vật
1.2.2.1 Vi khudn Bacillus và quá trình phán giải các hợp chất hữu cơ dưới
tác dụng của hệ enzym protease, amylase, cellulase
Vị khuẩn BaciJ„s là những vi khuẩn Gram +, hình que, cĩ bào tử, sinh trưởng dưới điều kiện hiếu khí hoặc kị khí khơng bắt buộc, thuộc chỉ Bacillaceae Đặc điểm quan trong cia Bacillus là khả năng tạo bào tử trong những điều kiện bất lợi như cạn
kiệt nguồn dinh dưỡng hay điều kiện bất lợi về nhiệt độ cao, tia bức xạ, hố chất Bào tử Bacillus cĩ thể tồn tại được vài trăm năm Khi gặp điều kiện thuận lợi cĩ thể
nay mâm, phát triển thành tế bào đinh dưỡng Baciii„s tơn tại khắp nơi trong tự nhiên
Tính dễ sống, dễ tổn tại cũng là lợi thế để sử dụng Ư8aci!!s sản xuất chế phẩm sinh
học Trong quá trình hình thành bào tt, Bacillus thudng san sinh những chất cĩ hoạt tính sinh học, ứng dụng trong nhiều lĩnh vực Một trong những đặc tính là sinh enzym phân huy hitu co nhu protease, amylase, cellulase
Trang 26Protease là enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptid (CO-NH) trong phân tử
protein và các chất tương tự Sản phẩm thuỷ phân là các axit amin, sản phẩm trung
gian là các peptit cĩ mạch dài ngắn khác nhau Trong quá trình đĩ cịn sản sinh peptone, san phdm thuy phân khơng hồn tồn của protein Quá trình phân hủy khơng
hồn tồn các hợp chất hữu cơ (protein) cũng sinh ra các khí độc như H;S, NH¿, gây
độc với tơm cá
Enyme œ-amylase cĩ tác dụng thủy phân tính bột Quá trình xảy ra trải qua giai đoạn dextrin hố, khi đĩ chỉ một số liên kết trong phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng dextrin và giai đoạn đường hố Trong giai đoạn này, các dextrin
vừa được tạo thành bị phân huỷ tiếp thành dextrin cĩ phân tử thấp hơn như maltose,
isomaltose, glucose
Enyme cellulase xúc tác sự phân hủy cellulose thành sản phẩm trung gian là
cellubiose và sản phẩm cuối cùng là glucose
Các sản phẩm cuối cùng của sự phân huỷ hữu cơ nhờ hệ enzyme profease, amylase, cellulase là các acid amin và glucose Đĩ là nguồn thức ăn cho nhiều loại vi sinh vật cĩ ích, giúp cho chúng phát triển mạnh và làm cải thiện chất lượng nước 1.2.2.2 Vị khuẩn Lactobacillus và tác dụng phịng ngừa bệnh
Ngay từ năm 1901, Metchinikoff đã cho rằng: vi khuẩn Lactic cư trú trong đường ruột cĩ thể ngăn ngừa bệnh nhiễm khuẩn đường ruột của người Tuy nhiên, những hiểu biết và tác dụng của vi khuẩn Lactic được để cập nhiều nhất trong những thập niên gần đây [15]; L acidophilus được cơi là thành phần quan trọng của khu hệ vi khuẩn Latc đường ruột [21] Tác động hữu ích như giảm sự bài tiết cholesterol và estrogen, ức chế hoạt động của chất gây ung thư đường ruột và giảm ảnh hưởng phụ do điều trị kháng sinh cũng được biết đến [21] Một trong những đặc điểm quan trọng
cha L acidophilus sit dung dé điều trị bệnh là khả năng bám dính tế bào vào niêm
mac rudt va vi vay L acidophilus cé thé tén tai và cư trú trong đường ruột, bảo vệ
Trang 27Khu hệ vi sinh vật đường ruột của người cũng như động vật luơn giữ ở trạng
thái cân bằng tự nhiên Tuy nhiên, nhiều yếu tố cĩ thể ảnh hưởng đến sự cân bằng đĩ Nhất là đối với con tơm, nhiều yếu tố cĩ thể ảnh hưởng đến sự cân bằng của khu hệ vi
sinh vật đường ruột như sự thay đổi về nhiệt độ, pH, mưa nắng, hạn hán Các yếu tố
này đều cĩ thể dẫn đến sự mất cân bằng của khu hệ vi sinh vật đường ruột Một
nguyên nhân nữa hay dẫn đến sự rối loạn khu hệ vi sinh vật đường ruột là do sử dụng kháng sinh, hố chất Mỗi khi tơm cá cĩ hiện tượng khác lạ, kém ăn mà đơi khi chỉ do
sự thay đổi thơng thường của cá thể, người ta thường sử dụng kháng sinh, hĩa chất và kết quả là tơm cá phát triển cịi cọc, dễ mắc bệnh đường ruột như bệnh phân trắng
Bên cạnh đĩ, người ta cịn cho rằng khi sử dụng vi khuẩn Lactic trộn vào thức
ăn của tơm, sẽ giúp cho tơm tăng trưởng nhanh vì vi khuẩn Lactic cĩ tác dụng tăng khả năng tiêu hố và hấp thụ thức ăn [25]
- Vi khuẩn Lactic cĩ khả năng tạo axit lactic, chất kháng khuẩn kiểm sốt một số vi sinh vật gây bệnh: Vibzio, Pseudomonas, E.col, Aeromonas Tuy nhiên, các lồi vi khuẩn Izactic khác nhau và vì vậy chúng cũng khác nhau về khả năng chịu axit L acidophilus cĩ thể chịu được trong mơi trường axit (pH 2-3) Đa số vi khuẩn Lactic chỉ phát triển được trong mơi trường giàu nguồn Nitơ, Cacbon, khống chất, một số
cĩ nhu cầu về axit amin và vitamin Do vậy, mơi trường nuơi cấy vi khuẩn Lactic khá
phức tạp Nguồn Cacbon thích hợp đối với vi khuẩn Lactic thường là đường disaccharit và monosaccharit Nhưng các lồi khác nhau thì sử dụng nguồn Cacbon khác nhau Một số lồi khơng sử dụng sucrose như nguồn cacbon và một số lồi khác
khơng sử dụng lactose như nguồn cacbon
Bên cạnh nhĩm vi khuẩn Lactic được xác định cĩ khả năng phịng ngừa và chữa bệnh Một số vi khuẩn khác như Bacillus, Saccharomyces hay cả lồi vi khuẩn Vibrio alginolyticus cũng cĩ khả năng đĩ [14]
Sinrat Rengpirat và cs [24], cũng đã chứng minh được hiệu quả rất tốt của việc b6 sung ching Bacillus S 11 vao thitc an cia lồi tơm hùm đen, chủng vi khuẩn này kháng lại lồi vi khuẩn gây bénh: Vibrio harvegi va Vibrio parahaeemolyticus Khi
bổ sung vào thức ăn tơm hùm đen, nhận thấy tỷ lệ sống sĩt của tơm cao hơn rất nhiều
Trang 28khi trong mơi trường cĩ vi khuẩn V¿brio Trọng lượng tơm cũng tăng lên nhiều so với mẫu đối chứng Nước trong mẫu thí nghiệm ổn định và đạt chỉ tiêu cho phép về oxi
hoa tan, pH, NH,, NH,, NO;
1.2.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của vì khuẩn
Mỗi loại vi khuẩn đều cĩ nhu cầu về thành phần dinh dưỡng khác nhau Nguồn
dinh dưỡng đối với vi khuẩn thơng thường là nguồn Cacbon, Nitơ và khống Ngồi
một số vi khuẩn cĩ khả năng tự tổng hợp các chất cần thiết từ nguồn Cacbon vơ cơ,
nước, muối khống (vi khuẩn tự dưỡng) thì đa số vi sinh vật địi hỏi cung cấp nguồn Cacbon, Nitơ đưới dạng hợp chất hữu cơ hay vơ cơ Vi sinh vật khơng cĩ khả năng hấp thụ trực tiếp các protein cao phân tử Chỉ cĩ các polypeptit chứa khơng quá 5 gốc
axit amin mới cĩ thể di chuyển trực tiếp qua màng tế bào chất của vi sinh vật Nhiều vi sinh vật sản sinh protease xúc tác việc thuỷ phân protein thành các hợp chất phân tử
thấp để cĩ khả năng xâm nhập vào tế bào Ngồi nguồn N, C thường được cung cấp vào mơi trường nuơi cấy như pep(on, cao thịt, cao men, vi sinh vật cũng cần nguồn
muối khống cho quá trình sinh trưởng và phát triển Những nguyên tố đa lượng cần
thiết cho vi khuẩn như K, P, Ca, Mg và những nguyên tố mà vi sinh vật sử dụng với lượng rất nhỏ (nguyên tố vi lượng) như Zn, Mn, Ni, Cu Các nguyên tố đa lượng và vi lượng cho vi sinh vật cung cấp dưới dạng muối khống Tuy từng lồi vi khuẩn mà chúng cĩ nhu cầu về nguồn muối khống cung cấp Một số lồi vi sinh vật ngồi thành phần cacbon, nitơ, khống cịn cĩ nhu cầu cung cấp vitamin như BI, B2, B5
-Nhu cầu dinh dưỡng Baciiius rất đơn giản, chỉ cần 1 nguồn Cacbon, l nguồn Nitơ và
1 nguồn muối khống Ngược lại vi khuẩn Lactic cĩ nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, ngồi nguồn cacbon, nitơ, khống đa lượng, vi lượng đơi khi cịn cần các vitamin cho
sự sinh trưởng và phát triển
Sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật khơng những chỉ phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy mà cịn chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố khác như: nhiệt độ, độ ẩm, pH, nồng độ oxi hồ tan .Một trong những đặc điểm quan trọng của Bacilius lơi cuốn sự chú ý trong lĩnh vực cơng nghệ sinh học đĩ
Trang 2960°C hoặc cao hon (Bacillus chiu nhiét), cing cé loai Bacillus wa lanh thì cĩ thể phát
triển ở nhiệt độ 0-15°C Thơng thường Baciiius phát triển tốt ở nhiệt độ 28-370C,
nhưng nhìn chung khi nuơi cấy, lên men Bacillus, khong can phải khống chế nhiệt độ
gắt gao như những lồi khác
pH cũng là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển
của vi khuẩn bởi khi pH thay đổi, làm cho diện tích màng tế bào chất thay đổi vì thế
ảnh hưởng đến sự hấp thụ thức ăn và cũng làm thay đổi nhiều phản ứng sinh hố xảy ra trong tế bào pH tối thích cho vi khuẩn là 6,5-7,5 pH thích hợp đối với Bacillus thường trung tính (pH=7); đối với vi khuẩn Lactic, pH thấp hơn (6-6,5)
Tuỳ theo từng loại vi sinh vật ưa khí hay ky khí mà nhu cầu về nồng độ oxi hồ
tan cao hay thấp Đối với vi khuẩn Baciiius (vi khuẩn hiếu khí hoặc ky khí khơng bắt buộc), khi lượng oxi hồ tan thấp, chúng khơng thể sinh trưởng và phát triển được
Tuy nhién, d6i v6i loai vi khudn Lactobacillus (lồi kị khí khơng bất buộc) thì lượng
oxi nhiều sẽ ức chế sự phát triển của chúng
1.3 Đặc điểm nước nuơi tơm, cá và những chỉ số cơ bản đánh giá nước nuơi 1.3.1 Đặc điểm nước nuơi tơm cá
Đặc điểm chung của nước nuơi tơm cá là hàm lượng hữu cơ cao nhưng tuỳ theo từng địa phương và tuỳ theo từng thời kỳ trong quá trình nuơi mà chất lượng nước nuơi bị biến đổi Trong thời gian đầu, khi mới thả tơm, nước chưa bị nhiễm hữu cơ vì
vậy tơm tăng trưởng tốt Từ tháng thứ 2, tơm lớn hơn, cho ăn nhiều hơn cũng đồng
nghĩa với lượng uế thải bài tiết nhiều hơn và lượng thức ăn thừa do tơm khơng sử dụng hết, tích tụ dần làm chất lượng nước bị suy giảm Sự suy giảm chất lượng nước tỷ lệ thuận với thời gian Lúc này, nếu khơng cĩ biện pháp xử lý hữu cơ thích hợp thì sự phát triển của tơm bị chậm lại, thậm chí cịn gây ra dịch bệnh, tơm chết hàng loạt gây
tổn thất cho người nuơi
Ngồi nguyên nhân ơ nhiễm hữu cơ trong nước nuơi tơm do thức ăn thừa, do
bài tiết, do lột xác trong hoạt động sống cịn nguyên nhân ơ nhiễm phi hữu cơ do sử dụng hố chất, kháng sinh để xử lý mơi trường và trị bệnh Đứng trước thực trạng mơi
Trang 30trường bị ơ nhiễm nặng, dịch bệnh luơn rình rập, người dân sẵn sàng sử dụng hố chất và kháng sinh Chính vì vậy, sự ơ nhiễm lại càng trầm trọng hơn Sự ơ nhiễm hữu cơ và ơ nhiễm phi hữu cơ là nguyên nhân dẫn đến thất bại cho nghề nuơi, một số địa
phương đã khơng thể tiếp tục nuơi tơm được nữa
1.3.2 Những chỉ số cơ bẩn đánh giá nước nuơi tơm, cá
Nhiệt độ là điều kiện để các quá trình sinh học, lý học, hố học diễn ra trong nước Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình tự làm sạch nước Ngồi ra, nhiệt độ cịn ảnh hưởng đến việc bắt mồi của tơm Nhiệt độ thích nghi cho tơm: 18-30°C, thích hợp: 23-
30C
Độ pH cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của tơm vì nĩ ảnh hưởng đến tính độc của NH;, H,S trong mơi trường Tính độc của NH¿, H;S phụ thuộc vào dạng tồn tại của chúng trong mơi trường Khi pH cao, NH; tồn tại ở dạng khí nhiều (nồng độ NH; cao) va H,S tén tại ở dạng khí ít Ngược lại, khi pH thấp, H;S tồn
tại ở dạng khí nhiều và NH¿ tồn tại ở đạng khí ít NH¿, H;S ở dạng khí độc hơn ở dạng
ion vA pH=7,5-8,5 thi NH,, H;S tơn tại ở dang it độc nhất Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của tơm được thể hiện ở bảng 1.2
Bảng 1.2: Anh hưởng của pH đến sự sinh trưởng và phát triển của tơm cá
Đặc điểm mơi trường Ảnh hưởng đối với tơm cá
Mơi trường axit mạnh (pH=4) Điểm chết đối với tơm cá
Mơi trường axit yếu (pH=5-6) Tơm cá khơng sinh sản hoặc khĩ sinh sản
Mơi trường trung tính (pH=7) Tơm cá phát triển tốt Mơi trường kiềm yếu (pH=8) Tơm cá phát triển tốt
Mơi trường kiểm (pH=9-10) Tơm cá chậm lớn
Mơi trường kiểm mạnh (pH>10) Điểm chết đối với tơm cá
Trang 31Độ mặn của mơi trường tơm nuơi phụ thuộc vào từng loại tơm Đối với tơm càng xanh, từ tơm bột đến tơm trưởng thành đều nuơi ở nước ngọt, ấu trùng tơm nuơi trong mơi trường cĩ độ muối: 14% Đối với tơm sú, độ mặn thích hợp từ L5-35%o
Nồng độ oxi hồ tan cũng rất cần cho vi sinh vật hiếu khí hoạt động và tơm nuơi phát triển Lượng oxi hồ tan trong nước phụ thuộc vào nhiều yếu tố như mức độ ơ nhiễm của nước, hoạt động của vi sinh vật trong thế giới thuỷ sinh, quá trình sinh học, hĩa học xảy ra trong nước, Oxi hồ tan được tơm cá sử dụng trong quá trình hơ hấp Mặt khác, oxi hồ tan tham gia vào quá trình phân huỷ thức ăn thừa, chất thải, xác động vật trong nước Khi mơi trường bị ơ nhiễm nặng thì oxy được sử dụng nhiều cho quá trình sinh hĩa dẫn đến hiện tượng thiếu oxy trong nước Trong trường hợp
này tơm cá hay bị nổi đầu Nước đủ tiêu chuẩn để nuơi tơm cĩ hàm lượng oxy hồ
tan: 5-8 mg/ lit
_ Nhu cầu oxy sinh học (BOD) cũng là chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước BOD
là lượng oxy cần thiết để oxi hố các chất hữu cơ cĩ trong nước bằng vi sinh vật hoại
sinh hiếu khí Quá trình này được gọi quá trình oxy hố sinh học BOD thường được dùng để đánh giá mức độ nhiễm hữu cơ của nước nuơi BOD càng cao thì mức độ ơ
nhiễm càng lớn, BOD thích hợp cho nước muơi tơm cá: 5-10mg/ lít
Nhu cầu oxy hố học (COD) cũng được dùng để đánh giá độ nhiễm bẩn của nước nhưng khơng cĩ sự tham gia của vi sinh vật COD là lượng oxy cần thiết cho quá
trình oxy hố tồn bộ các chất hữu cơ cĩ trong nước thành CO; và H;O bằng một chất oxy hố mạnh COD thích hợp: < 20mg/ lít
Trong ao nuơi, các chỉ số BOD, COD càng giảm càng tốt vì chứng tỏ nước ít ơ nhiễm hữu cơ, khơng cần tiêu hao lượng oxy hồ tan trong nước để oxy hố các chất
bẩn Vì vậy, khi BOD, COD giảm thì lượng oxy hồ tan trong nước tăng làm tăng chất lượng nước nuơi
Hàm lượng Nitơ trong nước cũng được xem là chất chỉ thị tình trạng ơ nhiễm
nước Vì các dạng tồn tại của Nitơ trong nước là các khâu trong chuỗi phân huỷ các
Trang 32hitu co (N-CH); amoniac (NH;); Nitrit (NO,°) và Nitơ tự do Nếu nước chứa hầu hết các hợp chất Nitơ hữu cơ, amoniac hoặc NHẠOH, chứng tỏ nước mới bị ơ nhiễm NHạ trong nước cĩ thể gây ngộ độc cho tơm cá Nếu trong nước cĩ hàm lượng NO, cao, chứng tỏ nước bị ơ nhiễm trong thời gian dài Nếu nước chứa hàm lượng Nitơ chủ yếu
ở dạng Nitrat (NO;) chứng tỏ quá trình phân hủy đã kết thúc Hàm lượng nitrat cao
cũng cĩ thể gây ngộ độc cho vật nuơi Mặt khác, khi hàm lượng Nitơ trong nước cao là nước rất phú dưỡng và tạo cơ hội cho tảo phát triển mạnh, gây tình trạng thiếu oxi
trong nước làm tơm cá bị chết
Hàm lượng phospho cũng ảnh hưởng đến chất lượng nước vì phospho là nguồn dinh dưỡng cho thực vật dưới nước Khi hàm lượng phospho trong nước quá cao sé làm cho các lồi tảo, các lồi thực vật phát triển mạnh, gây tắc thuỷ vực và sau khi tảo
chết, bị thối rữa gây ơ nhiễm thứ cấp dẫn đến thiếu oxi và ảnh hưởng đến tơm cá 1.3.3 Yêu cầu về nước nuơi tơm cá
Tơm thường sống ở vùng nước biển cĩ độ mặn khơng cao hoặc vùng nước lợ
bãi bồi, cửa sơng Vì vậy, nuơi tơm thâm canh và bán thâm canh thường ở các đầm ao được cấp nước từ biển và trộn với nước ngọt để đáp ứng yêu cầu của tơm Một số chỉ
tiêu của nước nuơi trồng thủy sản được trình bày ở bảng 1.3 và bảng 1.4
Trang 33
PO; meg/ lit 0,5
COD mg O,,/ lit 10-20
BOD, mg O,/ lit 5-10 HS mg/ lít 0,03 Bảng 1.4: Các thơng số mơi trường nuơi thích hợp cho tơm sú thâm canh [2] Thơng số Giới hạn tối ưu Ghỉ chú pH 7,5-8,5 Dao động hàng ngày <0,5 Độ mặn 15-30%o Đao động hàng ngày <5% Oxy hồ tan 5-6 mg/ lit Khơng dưới 4 mg/lít
Độ kiểm 80-130 mg CaCO// lít | Phụ thuộc vào dao dộng của pH
Độ trong 30-40 cm Đo bằng đĩa secxo
HS < 0,03 mg/ lít Độc hơn khi pH giảm thấp
NH; <0,1mg/ lít Độc hơn khi pH và nhiệt độ lên cao
1.4 Các bệnh thường xảy ra cho tơm khi ao nuơi bị nhiễm bẩn
Khi ao bị nhiễm bẩn, một số lồi vi khuẩn từ bên ngồi xâm nhập vào trong vỏ
tơm, gây bệnh cho tơm Bệnh thường gặp nhất trong trường hợp này là bệnh hoại tử do vỏ bị tổn thương vì nhiễm khuẩn hay khơng cứng được Nhiều lồi vi khuẩn cĩ thể ăn mịn lớp kin của vỏ, gây ra lở loét hay tạo ra các vết nhỏ làm cho vỏ bị nhãn nheo Ngồi vi khuẩn thì một số sinh vật khác cũng cĩ thể xâm nhập qua vỏ như nấm hay động vật nguyên sinh Nấm cĩ thể xâm nhập mang và vỏ, tạo nên những khối đen
trên bề mặt của tơm Động vật nguyên sinh xâm nhập qua vỏ khơng nhiều mà chỉ gây tổn thất cho mang, tạo ra những đốm đen nhỏ Cĩ nhiều trường hợp, gây hiện tượng
đen hố nghiêm trọng trên mang, người ta thường gọi là bệnh đen mang Bệnh đen mang thường do nhiễm khuẩn Vibr/o, nhiễm nấm Fusarium, dong vat nguyén sinh
Trang 34Đơi khi cũng do nhiễm hố chất như kim loại nặng, hàm lugng nitrat cao hay nước cĩ tính axit [9, 16]
Nhĩm vi khuẩn Vibrio là nhĩm vi khuẩn gây bệnh cơ hội [26] Chúng tồn tại
trong mơi trường nước nuơi như một thành phần của quần thể vi sinh vật tự nhiên trong ao nuơi Khi gặp điều kiện mơi trường bất lợi, chúng trở thành vi khuẩn cĩ khả năng gây bệnh Khi bị nhiễm vi khuẩn này, tơm thay đổi tập tính như bơi ven bờ hay gần mặt nước, lờ đờ, bỏ ăn, đổi màu đỗ hoặc xanh Nếu mơi trường tiếp tục xấu đi,
hay số lượng vi khuẩn gây bệnh phát triển mạnh, tơm sẽ chết nhiều trong một thời gian ngắn hoặc bệnh sẽ chuyển thành dạng nhiễm khuẩn mãn tính Để ngăn ngừa
bệnh này thì phải chú ý đến việc cải thiện mơi trường ao nuơi
Ngồi bénh den mang, Vibrio ciing gay ra m6t s6 bệnh khác như bệnh phân trắng, bệnh phát sáng Các bệnh này cũng làm cho tơm chết hàng loạt
Một số lồi Virut cũng là tác nhân gây bệnh nghiêm trọng cho tơm Các bệnh - truyền nhiễm do virut như WSSV (White Spot Syndrome Virut) hay YHD (Yellow Head Disease) là những bệnh điển hình gây thiệt hại nghiêm trọng [3] Bệnh đốm
trắng là một trong những bệnh gây nguy hiểm nhất đối với tơm nuơi Bệnh cĩ thể gây hậu quả nghiêm trọng, chết 100% tơm nuơi Bệnh đầu vàng cũng nguy hiểm cho tơm
nuơi, đặc biệt là giai đoạn 20 và 50-70 ngày tuổi, cũng gây thiệt hại nặng nề
Tuy nhiên, cĩ nhiều dẫn chứng lại cho thấy tơm cĩ dấu hiệu bệnh đầu vàng và đốm trắng nhưng lại khơng bị nhiễm Virut Khi cĩ Virut trong ao nuơi và mơi trường
xấu đi thì tơm bị chết hàng loạt và chết rất nhanh
Bệnh MBV (monodon Baculovirus) khá phổ biến ở tơm sú nuơi Tuy nhiên, chỉ tơm ở giai đoạn ấu trùng mới cĩ tỷ lệ chết cao khi nhiễm Virut này Đối với tơm trưởng thành, khơng gây thiệt hại nghiêm trọng Nhiều dẫn chứng cho rằng MBV cĩ
thể cảm nhiễm ở hầu hết các giai đoạn trong vịng đời của tơm sú và một số lồi cùng họ nhưng giai đoạn mẫn cảm nhất là giai đoạn larvae và postlarvae
Trang 35xấu, nồng độ các khí độc cao, gây stress cho tơm, gây cho tơm mẫn cảm với mầm bệnh
Vì vậy, vấn đề xử lý mơi trường nuơi chính là vấn đề cốt lõi để hạn chế bệnh
Trang 36PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VA PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu và lập luận về việc chọn đối tượng nghiên cứu
Với mục đích tạo ra sản phẩm sử dụng cĩ hiệu quả để xử lý mơi trường nuơi
trồng thuỷ sản và phịng ngừa bệnh cho đối tượng nuơi thuỷ sản, chúng tơi đã chọn được 4 chủng vi khuẩn từ tập đồn giống do chúng tơi phân lập và sưu tầm để nghiên cttu [12] Dé 1a nhing ching vi khudn thudc chi Bacillus va chi Lactobacillus [12] Những chủng vi khuẩn dị dưỡng hoại sinh thuộc chỉ Bacillus cĩ vai trị phân huỷ hữu cơ nhờ kha năng sinh enzym protease phan huy protein, amylase phan huy tinh bot, cellulase phan huy cellulose Những chất hữu cơ tồn lưu trong mơi trường nước nuơi là do việc đưa quá nhiều thức ăn tổng hợp cũng như thức ăn tươi sống, do bài tiết hoặc do lột xác trong quá trình sống, do xác động vật thuỷ sinh, thực vật thủy sinh chết,
thối rữa Những chất hữu cơ này nếu khơng được phân hủy triệt để gây nên ơ nhiễm
nước nuơi, nguyên nhân quan trọng gây thất bại cho nghề nuơi tơm [13]
Ngồi khả năng phân hủy hữu cơ làm sạch mơi trường, Bzciius cũng được
-_ chọn làm đối tượng nghiên cứu bởi chúng cịn sinh ra một số chất kháng khuẩn, kiểm sốt sự phát triển quá mức của vi sinh vật gây bệnh, đặc biệt nhĩm vi khuẩn cơ hội do
cơ chế cạnh tranh nguồn dinh dưỡng, giữ cho khu hệ vi sinh vật trong ao nuơi luơn ở
trạng thái cân bằng
Các chủng Ưaciius được chọn thuộc loai B licheniformis, B subtilis, B megaterium Cac chủng đều mang những đặc điểm cơ bản, cần thiết cho việc sử dụng để sản xuất chế phẩm xử lý mơi trường nuơi trồng thủy sản: sinh enzym phân huỷ hữu cơ, chịu mặn và đặc biệt đảm bảo an tồn cho người và vật nuơi [11,12]
Đối tượng khác được lựa chọn trong nghiên cứu là nhĩm vi khuẩn Latic Nhĩm vi khuẩn này rất quen thuộc đối với đời sống người và động vật Vi khuẩn Lactic rất
phổ biến trong các sản phẩm thực phẩm như dưa chua, nem chua, mắm chua, sữa
chua, rau quả ủ chua Trong hoạt động sống, vi khuẩn Lactic chuyển hố đường thành axit lactic Chúng cịn cĩ thể sinh bacteriocin, mét hop chat cĩ hoạt tính kháng
sinh và phổ ức chế các vi khuẩn khác khá rộng, đặc biệt đối với nhĩm vi khuẩn Vibrio
gây một số bệnh nghiêm trọng cho tơm như bệnh phát sáng, bệnh đen mang, bệnh phân trắng, bệnh mịn đuơi, cụt râu Loại chất kháng sinh này khơng gây ra tính
Trang 37dụng trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản theo quy định SỐ 07/2005/QD-BTS ngay 24 thang 2 nam 2005
Axit lactic và bacterioxin cĩ khả năng ức chế các vi khuẩn gây bệnh phát triển
quá mức trong mơi trường nuơi Do đĩ, chúng đĩng vai trị kiểm sốt vi sinh vật gây
bệnh trong mơi trường, giữ khu hệ vi sinh vật mơi trường nuơi ở trạng thái cân bằng Vi khuẩn Lactic được chọn để kiểm sốt vi sinh vật trong mơi trường thuộc lồi L
acidophilus Chúng là những trực khuẩn ky khí boặc ky khí tuỳ tiện cĩ khả năng lên men lactic điển hình, cĩ khả năng lên men sữa sinh axit lactic Đáng chú ý là loại vi
khuẩn này ức chế mạnh sự phát triển của lồi Vibrio gây bệnh tơm
(V.parahaemolyticus, V fuonisi) L acidophilus cing c6 kha năng chịu mặn nên cĩ
thể tồn tại trong mơi trường nước nuơi
Việc ứng dung L acidophilus trong nuơi trồng thủy sản ngồi tác dụng kiểm sốt vi sinh vật gây bệnh, ổn định mơi trường nước, chúng cịn được sử dụng để sản xuất chế phẩm phịng trị bệnh đường ruột cho người và vật nuơi Sự tồn tại của vi khuẩn này trong đường ruột tạo ra những thay đổi vẻ khu hệ vi sinh vật đường ruột
theo hướng cân bằng cĩ lợi, trong đĩ các vị sinh vật cĩ lợi tăng lên đáng kể, các vi sinh vật cĩ khả năng gây bệnh (E.col, Aeromonas, Salmonella) giảm đáng kể [20]
Khả năng tăng cường miền dịch, điều chỉnh ngưỡng sai lệch bất lợi ở hệ vi sinh vật đường ruột do bệnh nhiễm khuẩn, virut, đị ứng thức ăn; tăng cường khả nãng tiêu hố và hấp thụ thức ăn cũng là cơ sở để lựa chọn /, acidophilus sử dụng sản xuất chế phẩm sinh học phục vụ nuơi trồng thuỷ sản
2.2 Phương pháp nghiên cứu và lập luận về phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.1 Phương pháp chọn những chủng vi khuẩn sử dụng để sản xuất chế phẩm sinh học - Khả năng chịu mặn: mơi trường sử dụng để kiểm tra khả năng chịu mặn là mơi trường LB đối với VK Baciius và MRS đối với Lactobacilus, cĩ bố sung NaC] với
nồng độ: 1%, 3%, 5%, 7%, 10% Đánh giá sự phát triển của vi khuẩn sau 4§giờ thơng
qua chỉ số mật độ quang (OD)
- Kha năng đối kháng: Kiểm tra với Vibrio parahaemolyticus (Vp), Vibrio fuonisi
Trang 38kiểm tra cấy chấm điểm vào đĩa thạch đã bổ sung Vp, Vf Quan sát vịng kháng khuẩn
sau 24-48 giờ
- Khả năng sinh protease: Kiểm tra trên mơi trường NA (Bacillus) va MRS
(Lactobacilius) cĩ bỗ sung 10% sữa đã được tách béo và thanh trùng Cấy chủng và
quan sát vịng thuỷ phân xung quanh khuẩn lạc
- Kha nang sinh amylase: Cấy chủng Bacilius trên mơi trường NA cĩ bổ sung tỉnh bột và Lzctobacillus tren mơi trường MRS bổ sung tỉnh bột Sau khi vi khuẩn phát triển, nhỏ dung dịch Lugol, quan sát vịng phân huỷ tỉnh bột xung quanh khuẩn lạc
- Kiểm tra độ an tồn của các chủng nghiên cứu: Thử độc tính cấp trên chuột nhắt trắng được tiến hành trên 50 con chia làm 5 nhĩm, nhĩm đối chứng dùng nước cất và 4 nhĩm thử mẫu với liều khác nhau Các mức liều cao uống 2-3 lần/ngày, cách
nhau 3 giờ Theo dõi chuột 5 ngày sau khi cho uống
2.2.1.2 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân giống
- Ảnh hưởng của thành phản mơi trường: Nuơi cấy Bacillus, Lactobacillus trên - mơi trường cĩ bổ sung thành phần khác nhau Khả năng sinh trưởng và phát triển
được theo dõi qua xác định pH mơi trường sau khi nuơi cấy, ODazo„„, CEU/ m1
- Ảnh hưởng của tỷ lệ giống: Bồ sung giống với tỷ lệ 5%, 7,5%, 10%, theo dõi sự
sinh trưởng và phát triển qua xác định ODg90am, PH, CFU/ ml
- Ảnh hưởng của pH mơi trường: Điều chỉnh pH MT đạt 5,5; 6; 6,5 đối với vi khuẩn
kactobacillus Xác định pH mơi trường sau khi nuơi cấy, OD;;zoaạ, CFU/ ml
- Ảnh hưởng thời gian nhân giống: Khả năng sinh trưởng va phát triển cha Bacillus,
Lactobacillus sau 16, 20, 24, 36, 48 giờ được theo đõi qua xác định pH, ODazg,
CFU/ ml
2.2.1.3 Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men
- Lén men chim Bacillus thực hiện trong 5 bình inox với tổng thể tích 100 lít, được lắp đặt trong hệ thống lên men tự thiết kế; Lên men chìm Lactobacillus vao binh inox, thể tích 20 lít
Trang 39- Thành phần mơi trường lén men chim Bacillus thich hop được lựa chọn trên cơ sở mơi trường nhân giống Bacillus, cĩ thay đổi một số thành phần phù hợp, dễ kiếm và
rẻ tiền Xác dinh CFU/ml dich Jén men
- Thời gian lên men chim Bacillus, Lactobacillus thích hợp được nghiên cứu qua theo
dõi pH, ODa;p„„, CFU/ ml dich LM
- Xác định thành phần lén men Lactobacillus trén méi trudng xốp thích hợp bằng
cách lên men trên cơ chất là nguồn cácbon (đường sucrose, lactose, glucose, maltose,
mannitol); chất mang: bột đậu tương, bột gạo, bột sắn, bột cám với tỷ lệ khác nhau
Xác định CFU/ gam chế phẩm lên men
- Xác định thành phần lên men 8acửius trên mơi trường xốp trên nguồn cơ chất bao
gồm: bột đậu tương, bột gạo, bột cám Xác định CFU/ gam chế phẩm lên men
- Tỷ lệ giống thích hợp để lên men Bazcilus trên mơi trường xốp được nghiên cứu:
20%, 25%, 30%, 35% Xác định CEFU/ gam chế phẩm lên men
- Nhiệt độ lên men Bacillus, Lactobacilius trên mơi trường xốp thích hợp được
_ nghiên cứu: 280C, 30C, 34°C, 37°C Xác định CFU/ gam chế phẩm lên men
- Xác dinh thoi gian lén men Bacillus, Lactobacillus trén m6i trudng xốp thích hợp bằng cách lên men 1, 2, 3, 4, 5, 6, 8 ngày, xác định CFU/gam CP lên men
- Độ ổn định của chế phẩm lên men Bacillus, Lactobacillus trên mơi trường xốp được xác định bằng cách lên men liên tục 6 mẻ trong vịng 1 tuần với số lượng 15-40 kg/
mẻ Kiểm tra CFU của từng mẽ LM
2.2.1.4 Thu hồi sinh khối, tạo chế phẩm Biochie, BioFvà bảo quản chế phẩm
- Thu hồi sinh khối tế bào Bacilws, Lactobacillus: bằng phương pháp ly tâm lạnh
§.000 v/ phút trong 5 phút; sử dụng bentonit với tỷ lệ 2,5%, 12%, 25%; sử dụng
điatomit với tỷ lệ 2,5%, 12%, 25%; để lắng -4°C, 24-48 giờ
- Tạo chế phẩm BioF dạng bột: Sấy khơ chế phẩm lén men Lactobacillus bang say nhiệt 40°C, 45°C, 50°C hoặc sấy hút chân khơng 40°C, 45°C, 50°C hay đơng khơ lạnh ở nhiệt độ -50°C Nghiền thành bột, kiểm tra độ tỉnh khiết, chất lượng (CEFU/gam chế phẩm : 10?) và đĩng vào túi tráng kẽm, hàn kín
- Tạo chế phẩm BioF dạng lỏng: Dịch lên men L2ctobaciius đã được thu hồi, bổ sung chất bảo quản thích hợp Kiểm tra độ tỉnh khiết, chất lượng (CFU/ml chế phẩm :
10”) và đĩng vào can, nút kín
Trang 40- Tạo chế phẩm Biochie dang bot: ché ph4dm Ién men Bacillus da dugc s&y kho voi
nhiệt độ: 50, 60, 65, 70C, nghiền, bổ sung chế phẩm lên men Lactobacillus ciing
được sấy khơ, nghiên nhỏ Kiểm tra độ tỉnh khiết, chất lượng (CFU/ gam chế phẩm:
10°)
- Tạo chế phẩm Biochie dạng lồng: địch lên men Baciilus đã được thư hồi, bổ sung Lactobacillus cũng được thu hồi và cho thêm chất bảo quản Kiểm tra độ tỉnh khiết, chất lượng (CFU/ ml chế phẩm: 10°)
- Thành lập cơng thức bảo quản chế phẩm Biochie dạng lỏng gồm các thành
phan: Bacillus, Lactobacillus va mot trong số cdc chat bao quan sau: sucrose, lactose,
Na;S;O¿ Theo dõi độ ổn định của chế phẩm sau 1, 3, 6, 8, 10, 12 tháng
- Thành lập cơng thức bảo quản chế phẩm Biochie dạng bột gồm: Bacillus, LactobaciHlus và một trong số thành phần sau: bột, sucrose, lactose, Na;CO; Theo dõi
độ ổn định của chế phẩm sau I, 3, 6, 9, 12 tháng
- Thành lập cơng thức bảo quản chế phẩm BioE dạng lỏng với các thành phần:
sucrose, sucrose + NaOH; lactose, Na,S,O, + lactose Theo dõi độ ổn định của chế
phẩm sau I, 3, 6, 9 tháng
- Thành lập cơng thức bảo quản chế phẩm BioF dạng bột với các thành phần:
sucrose, bột, lactose, Na,S,O, + lactose Theo d6i d6 6n dinh ca ché phẩm sau I, 2, 5, 8, 10, 12 thang ,
2.2.1.5 Phương pháp định tính VK nghiên cứu
Định tinh VK Bacillus va Lactobacillus dua trén nghién cttu dac diém hình
thái khuẩn lạc, hình thái tế bào, bào tử, đặc điểm sinh hĩa [12, 18, 19, 21]
- Xác định đặc điểm khuẩn lạc : Quan sát đặc điểm khudn lac cia B licheniformis, B subilis, B megaterium trên mơi trường NA; L acidophihus trên mơi trường MRS
bổ sung agar Cấy các vi khuẩn trên mơi trường thích hợp, nuơi 24-48 giờ Chọn những hộp lồng cĩ khuẩn lạc mọc riêng rẽ để quan sát
- Xác định hình thái tế bào, bào tử: Cĩ thể sử dụng mơi trường lỏng hay mơi trường cĩ thạch để quan sát đặc điểm hình thái tế bào, bào tử Vi khuẩn sau khi được nuơi
cấy trên mơi trường thích hợp, làm tiêu bản, nhuộm Gram hay nhuộm Carbofuchsine
Quan sát hình dạng tế bào, cách sắp xếp, bào tử trên kính hiển vi quang học cĩ độ