KỸ THUẬT PHÂN TỬ TRONG DI TRUYỀN HỌC

 Trình bày nguyên lý kỹ thuật sinh học phân tử bản: kỹ thuật PCR, điện di ADN, Southern blot, xác định trình tự ADN  Phân tích ưu điểm, nhược điểm, ứng dụng y học kỹ thuật  Là phản ứng kéo dài mồi nhờ ADN polymerase nhằm tổng hợp in vitro đoạn ADN đặc trưng  Khuôn mẫu đoạn ADN định biết chưa biết trình tự  Các đoạn ADN hình thành lại sử dụng làm khuôn mẫu cho phản ứng theo phương thức phản ứng chuỗi  Biến tính: 93-95oC Tách ADN thành sợi đơn  Gắn mồi: 50-70oC Gắn mồi với trình tự bổ sung  Kéo dài mồi: 72oC Tổng hợp sợi ADN  Mồi: đoạn oligonucletide 18-30 Nu, gồm mồi xuôi mồi ngược  Enzyme ADN polymerase: Taq polymerase (VK Thermus aquaticus)  dNTPs: deoxynucleotide triphosphate dATP, dCTP, dTTP, dGTP  Đệm phản ứng: quan trọng MgCl2  ADN khuôn mẫu  Trộn thành phần với thể tích 25-50 µ l  Đặt ống PCR vào máy luân nhiệt, cài chương trình luân nhiệt thích hợp  Điện di sản phẩm PCR gel agarose  Nhuộm ethidium bromide  Đọc kết đèn cực tím  Có vị trí nhận biết đặc hiệu ADN Là trình tự ADN lặp lại đảo ngược 4-8 nu  Enzym cắt thông dụng: EcoRI Vị trí nhận biết đặc hiệu là: GAATTC CTTAAG  Đột biến thêm nucleotide mà có kích thước 50-100 bp  Đột biến thay nucleotide làm vị trí cắt tạo vị trí cắt enzym cắt hạn chế Đột biến GAG → GTG codon  Làm vị trí cắt MstII (CCTNAGG) CCTGAGG → CCTGTGG   Mất nhiều thời gian, nhiều công đoạn phức tạp  Phụ thuộc vào kỹ thuật tạo dòng (bằng pp tế bào PCR) để tạo probe  Cần nhiều ADN từ bệnh phẩm (5-10 µg) → cần nhiều máu để tách chiết ADN  Không thực từ ADN thô  Phương pháp hóa học: Maxam Gilbert  Phương pháp dideoxy (pp kết thúc chuỗi) Frederick Sanger  Dùng dideoxynucleotide thay phần deoxynucleotide trình tổng hợp mạch ADN bổ sung Đánh dấu phóng xạ, điện di sản phẩm gel polyacrylamide, quan sát mắt thường band tên phim phóng xạ tự chụp Đánh dấu huỳnh quang, điện di gel polyacrylamid, ghi nhận tín hiệu máy kỹ thuật số Đánh dấu huỳnh quang, điện di mao quản