Tìm hiểu ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật

Tìm hiểu ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật

Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô LỜI MỞ ĐẦU Vi sinh vật có khắp nơi xung quanh nước, không khí, thực phẩm diện thể Đặc biệt thức ăn nước uống đường để vi sinh vật xâm nhập gây bệnh cho người Với tình hình an toàn vệ sinh diễn phức tạp Song song đó, vấn đề sức khỏe vấn đề mang tính thời nóng hổi Chính mà không người đặt câu hỏi: “Liệu thời đại thị trường cạnh tranh khóc liệt doanh nghiệp có thực trọng đến sức khỏe người tiêu dùng không hay lợi nhuận đặt lên hàng đầu?” Hiện nay, ngộ độc thực phẩm trở thành mối quan tâm toàn xã hội Các vụ ngộ độc thực phẩm có nhiều nguyên nhân do: hóa chất, chất thực phẩm chứa sẵn số chất độc,… Nhưng quan trọng hết từ vi sinh vật, vi khuẩn nguyên nhân gây ngộ độc Nhằm mục đích tìm hiểu nguồn gốc phát sinh tác hại mà vi khuẩn gây biện pháp phòng ngừa chữa trị Đặc biệt tìm hiểu phương pháp phân tích để nhận biết phát chúng, đồng thời xem biện pháp hữu hiệu để kiểm tra độ an toàn thực phẩm SVTH Hậu_11SHLT Page Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Chương TÌM HIỂU CHUNG VỀ NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 1.1.Tình hình ngộ độc thực phẩm nước giới 1.1.1 Tình hình ngộ độc thực phẩm giới Từ năm 1973 đến năm 1987, theo thống kê Cơ quan Kiểm soát bệnh tật (Centers for Disease Contrl : CDC) Atlanta (Hoa Kỳ), ước tính có khoảng 500 trận dịch bệnh thức ăn gây nên, ảnh hưởng cho khoảng trung bình 16.000 người năm Tuy nhiên số chưa đánh giá cách đầy đủ, chưa phản ánh thật tầm quan trọng vấn đề Tỉ lệ mắc bệnh hàng năm không rõ, theo thống kê quan y tế Hoa kỳ, riêng Hoa Kỳ, ước tính có khoảng chừng 6.500.000 đến 81.000.000 lượt bệnh năm Ở Á châu, nhiều trận dịch ngộ độc thức ăn gần ghi nhận Nhật điều làm cho nhiều quốc gia khác phải lo ngại[1] Từ tháng đến tháng năm 2010, biến cố ngộ độc vi khuẩn E coli nhiễm từ cải Romaine lettuce xảy Michigan, New York, Tennessee Pennsylvania Hoa Kỳ Thủ phạm chủng E coli mới, E.coli 0145 Đây chủng loại thấy nên nhà khoa học quan tâm đến E coli 0145 gây bệnh tương tự E coli 0157:H7 Biến cố làm cho vài chục người ngã bệnh Vào trung tuần tháng 5, 2011, Châu Âu chấn động dịch bệnh ngộ độc thực phẩm E.coli 0104, chủng làm hủy hoại xuất huyết niêm mạc ruột Enterohemorrhagic E.coli EHEC Đây loại thấy từ xưa Người ta nghi nguồn lây nhiễm từ dưa leo hữu organic sản xuất từ vùng Almeria Malaga, thuộc Tây Ban Nha nhập vào quốc gia Châu Âu Tính đến 30/5/2011, Đức quốc gia bị nặng với gần 400 nguời bệnh có 14 tử vong Đan Mạch có 11 tử vong Ngoài ra, dịch bệnh thấy xuất Thụy Điển, Anh Quốc, Hà Lan[2]… SVTH Hậu_11SHLT Page Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Vi khuẩn nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm nhiều Tại nước Anh, 2000 ca bị ngộ độc thực phẩm riêng lẻ vi khuẩn Campylobacter jejuni chiếm 77,3%, Salmonella 20,9%, Escherichia coli Escherichia coli O157:H7 1,4%, vi khuẩn lại gây 0,1% số ca[16] Triệu chứng ngộ độc thực phẩm vi khuẩn thường xuất sau 12–72 sau ăn thức ăn bị nhiễm khuẩn[3] Hoa Kỳ: theo số liệu FoodNet từ năm 1996 đến 1998, CDCP ước tính hàng năm có 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm (26 nghìn ca 10 vạn dân), đó: 325 nghìn nhập viện (111/10 vạn dân); nghìn chết (1,7/10 vạn dân) Tổn thất gây sụt giảm suất chi phí điều trị năm 1997 35 tỉ Mỹ kim[3] Pháp: hàng năm có 75 vạn ca ngộ độc thực phẩm (1.210 ca/10 vạn dân), đó: vạn ca cấp cứu tình trạng nguy kịch (113 ca/10 vạn dân); 113 nghìn ca phải nhập viện (24 ca/10 vạn dân); 400 người chết (0.9 người/ 10 vạn dân)[3] Ở Úc: năm ước tính có khoảng 5,4 triệu ca ngộ độc thực phẩm, cụ thể: 18 nghìn ca nhập viện, 120 ca tử vong, 2,1 triệu ca phải nghỉ làm ngộ độc, 1,2 triệu hội chẩn bác sĩ, 30 vạn toa kháng sinh [3] 1.1.2 Tình hình ngộ độc thực phẩm nước Tại thành phố Hồ Chí Minh, vào tháng 5/1996, vụ ngộ độc thức ăn sau bữa tiệc liên quan ghi nhận trường tiểu học Bàu Sen, quận 5, 818 học sinh tham dự, 164 em bị ngộ độc Qua xét nghiệm vi sinh tìm thấy Staphylococcus aureus thịt gà, bánh mì chất nôn bệnh nhân[1] Ở Việt Nam nhiều vụ ngộ độc thực phẩm hay xảy ra, đặc biệt ngộ độc tập thể, rơi nhiều vào đối tượng công nhân (khi ăn, uống bếp ăn tập thể không đảm bảo vệ sinh, an toàn chất lượng thực phẩm) Theo thống kê SVTH Hậu_11SHLT Page Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô năm 2008, năm Việt Nam có khoảng 250- 500 ca ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân 100 - 200 ca tử vong[3] Có triệu người ngộ độc thực phẩm năm Việt Nam Đây công bố Tổ chức Y tế giới (WHO) tình hình ngộ độc thực phẩm Việt Nam Tuy nhiên có 8.000 người thống kê, phát hiện, 1% số người ngộ độc thực phẩm thực tế[4] SVTH Hậu_11SHLT Page Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Chương 2: TÌM HIỂU CÁC VI KHUẨN GÂY NGỘ ĐỘC THỰC PHẨM 2.1 Tụ cầu khuẩn Staphlococus aureus Staphylococcus aureus vi khuẩn hình cầu hình thuẫn Trong bệnh phẩm vi khuẩn họp đôi đám nhỏ Vi khuẩn bắt màu Gram dương Vi khuẩn không di động, không sinh nha bào, thường vỏ Thường gặp ăn thức ăn giầu đạm bị nhiễm vi khuẩn tụ cầu như: thịt, cá, trứng, sữa, loại súp Vi khuẩn tụ cầu có nhiều da, họng bị viêm nhiễm, có không khí, nước nên trình chế biến bảo quản không hợp vệ sinh dễ nhiễm vi khuẩn vào thực phẩm Ăn thức ăn có nhiễm tụ cầu độc tố chúng bị ngộ độc Bình thường, triệu chứng xuất sớm 30 phút đến sau ăn Người bệnh thường nôn thức ăn vừa ăn xong, nhiều lần phân toàn nước, mệt mỏi, có đau đầu hôn mê nhiễm phải độc tố tụ cầu Bệnh không điều trị kịp thời dễ tử vong nước điện giải Điều trị tích cực, bệnh thường khỏi nhanh phục hồi tốt[5] 2.2 Vi khuẩn E.coli E.coli - Vi khuẩn nầy diện cách tự nhiên ruột thú vật Vi khuẩn E.coli thường nhiễm vào đất, nước, thịt, rau, quả, sữa… từ phân động vật Có trăm chủng huyết (serotypes) E.coli Đa số chủng hiền, nhiên có vài chủng dữ, chẳng hạn E.coli 0157:H7 tìm thấy ruột phân loài gia súc, đặc biệt phân bò Vi khuẩn nầy xác định lần vào năm 1982 Hoa Kỳ nhân biến cố ngộ độc thực phẩm hamburger gây Từ vi khuẩn E.coli 0157:H7 có tên vi khuẩn bệnh hamburger Độc tố verocytoxin E.coli 0157:H7 làm dung huyết (hemolysis), hủy hoại niêm mạc ruột gây tiêu chảy có máu, làm hư thận đồng thời làm giảm lượng nước tiểu Khoa học gọi hội chứng HUS (Hemolytic Uremic SVTH Hậu_11SHLT Page Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Syndrome), nguy hiểm chết, không cần phải lọc thận (renal dialysis) suốt đời[2] Khi nhiểm vi khuẩn thông qua đường thức ăn, người bị ủ bệnh từ 2-20 Người ngộ độc thấy đau bụng dội, phân lỏng nhiều lần ngày, nôn mửa Thân nhiệt sốt Trường hợp nặng bệnh nhân sốt cao, người mỏi mệt, chân tay co quắp đổ mồ hôi Thời gian khỏi bệnh vài ngày[3] - E coli: có nhóm E coli gây ỉa chảy xâm nhập với hội chứng lỵ: + EIEC (E coli Entero-invasive) bệnh xảy trẻ em, người lớn, với hội chứng lỵ lỵ trực trùng + EPEC (E coli Entero pathogenic), trước đây, tác nhân gây dịch ỉa chảy trẻ em nhà trẻ, mẫu giáo phân lập bệnh nhân ỉa chảy Điều trị kháng sinh cần thiết trẻ nhỏ + EHEC (E coli Entero Hemorragique colitis): gây ỉa chảy phân nhầy máu[11] 2.3 Vi khuẩn Listeria Listeria monocytogenes tác nhân gây bệnh listeriosis nguy hiểm, gây tử vong cao người nhiễm trùng máu, sẩy thai phụ nữ, viêm màng não, gây tử vong thai nhi Tỷ lệ tử vong mắc phải bệnh listeriosis khoảng 20% Sự nhiễm độc L monocytogenes gây số tác nhân gây độc trung gian, có listeriolysin O (LLO) độc tố quan trọng tiết mầm bệnh[14] Listeria monocytogenes gặp ruột động vật đất cát Vi khuẩn Listeria nhiễm vào loại rau cải tươi Đặc biệt âm thầm tăng trưởng tủ lạnh nhiệt độ 0C Listeria nhiễm vào thịt nguội, jăm-bông, mát, sữa tươi không hấp khử trùng trước bán[2,6] SVTH Hậu_11SHLT Page Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô 2.4 Vi khuẩn Salmonella Giống Salmonella vi sinh vật đường ruột Enterobacteriaceae có 2400 kiểu huyết Salmonella trực trùng Gram âm, kích thước khoảng 0,6 - 2,0 mm, hiếu khí, di động, không tạo bào tử, sinh lên men dextrosa, sinh khí đihyđrosunfua[7] Salmonella kém đề kháng với điều kiện bên ngoài, bị phá hủy bởi quá trình tiệt trùng bằng phương pháp Pasteur, tia bức xạ và đun sôi nấu kĩ Tuy nhiên Salmonella có thể sống sót một thời gian dài ở các thực phẩm khô và ướp lạnh Do đó làm tan thực phẩm đông lạnh vi khuẩn này dễ phát triển trở lại Chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 0C – 420C, thích hợp nhất ở 350C – 370C, pH từ – và thích hợp nhất ở pH = 7,2 Ở nhiệt độ từ 180C – 400C vi khuẩn có thể sống đến 15 ngày Đun sôi nước 600C 10 phút hay 1000C phút đã diệt được hầu hết Salmonella Chúng bị tiêu diệt phenol 5%, cloramin1% clorua thủy ngân 0,2% phút Nuôi cấy dễ dàng tăng trưởng nhanh môi trường đơn giản, môi trường phải đủ chất dinh dưỡng, với hoạt độ nước Aw = 0,93 Vi khuẩn không gây mùi vị khó chịu cho thực phẩm Sống tốt ở môi trường bên ngoài, có thể sống được cả với điều kiện bảo quản, ướp muối, ít nước Nó có khả chịu được kháng sinh Trong điều kiện ở nhiệt độ Sự xâm nhiễm Salmonella vào thể vật chủ gây bệnh thực chủ yếu qua đường tiêu hoá với biểu phổ biến gây tiêu chảy, thương hàn phó thương hàn Salmonella chủ yếu gây bệnh bằng nội độc tố Nội độc tố chịu nhiệt độ sôi không bị phân hủy protease, tính kháng nguyên yếu không sản xuất thành kháng nguyên Trái lại với ngoại độc tố Để gây bệnh, Salmonella xâm nhập vào thể theo đường tiêu hóa thức ăn, nước uống bị nhiễm bẩn, số lượng để gây bệnh chỉ khoảng 10 SVTH Hậu_11SHLT Page Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô đến 107 Các chủng Salmonella thường sản sinh entertoxin có chất lipopolysaccharide vốn có khả tác động đến nhiều mô khác nhau, đến chức mô Tuy nhiên trường hợp nhiễm độc thực phẩm chất độc có tác dụng giải phóng vào ruột từ vi khuẩn sống pha sinh sản Khi ăn bào tử sống sinh bệnh song ăn vi khuẩn bị chết nhiệt không bị ảnh hưởng Sau vào ống tiêu hóa, vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột non rồi xâm nhập qua niêm mạc vào các hạch mạc ruột Ở đây, chúng nhân lên rồi qua hệ thống bạch huyết và ống ngực vào máu, lúc này dấu hiệu lâm sàn bắt đầu xuất hiện Từ máu, vi khuẩn đến lách và các quan khác: + Tới màng Payer, vi khuẩn tiếp tục nhân lên + Tới gan theo mật đổ xuống ruột rồi được đào thải qua phân + Tới thận, một số vi khuẩn được đào thải ngoài theo nước tiểu Salmonella gây bệnh bằng sự xâm nhập của bản thân vi khuẩn phá hủy tổ chức tế bào bằng nội độc tố của Salmonella bị chết Ngộ độc Salmonella cần có điều kiện: + Thức ăn phải nhiễm một lượng lớn vi khuẩn sống, vì tính chất gây ngộ độc của vi khuẩn rất yếu + Vi khuẩn vào thể phải tiết một lượng lớn độc tố[12] Salmonella tìm thấy phân loài vật gia cầm Rùa rắn loài bò sát thường có mang vi khuẩn Salmonella Thịt bò, thịt heo thịt gà, trứng gà, sữa tươi loài thủy sản cá, tôm, sò ốc, rau cải bị nhiễm khuẩn salmonella[2] Đây tình trạng hay gặp vụ ngộ độc bếp ăn tập thể trường học bán trú, xí nghiệp sản xuất, buổi liên hoan hay lễ cưới Vi khuẩn gây ngộ độc đa số nhóm vi khuẩn đường ruột, khả gây bệnh nhóm yếu nên để gây bệnh thường phải có lượng lớn thức ăn Ngộ độc thực phẩm loại thường xảy vòng vài đến ngày sau ăn thực phẩm bị nhiễm SVTH Hậu_11SHLT Page Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Triệu chứng: Khoảng 12-14 sau ăn thực phẩm có chứa vi khuẩn, nạn nhân có triệu chứng: đau bụng, nôn, tiêu chảy, toàn thân bị lạnh sốt, suy nhược thể Nếu không cấp cứu kịp thời dẫn đến tử vong [3] 2.5 Vi khuẩn Shigella Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn người, bệnh truyền nhiễm gây thành vụ dịch địa phương Thương tổn đặc hiệu khu trú ruột già, lâm sàng biểu hội chứng lỵ với triệu chứng: đau quặn bụng, nhiều lần, phân có nhiều mũ nhầy thường có máu Shigella gây bệnh chế xâm nhập vào tế bào biểu mô niêm mạc ruột nhân lên với số lượng lớn tổ chức ruột Các Shigella có nội độc tố Riêng trực khuẩn Shiga có thêm ngọai độc tố có chất protein Nội độc tố Shigella kháng nguyên thân, có độc tính mạnh tính kháng nguyên yếu Tác dụng nội độc tố gây phản ứng tạ ruột Ngoại độc tố trực khuẩn Shiga không giống độc tố ruột Vibrio cholerae 01 ETEC, hoạt tính sinh học chủ yếu ngoại độc tố trực khuẩn Shiga tác dụng độc tế bào Ở Việt Nam, Shigella gây bệnh lỵ trực khuẩn thường gặp nhóm B (Shigella flexneri) nhóm A (Shigella dysenterae) Bệnh lây theo đường tiêu hóa, ăn uống phải thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn Ruồi vật chủ trung gian truyền bệnh Người lành mang vi khuẩn người bệnh đóng vai trò quan trọng gây dịch Dịch thường xảy vào mùa hè Nhiễm khuẩn Shigella, hay Shigellosis, bệnh nhiễm khuẩn đường ruột gây nhiều loại vi khuẩn Shigella Các loại vi khuẩn lây truyền qua thức ăn nước uống thực phẩm vệ sinh Vi khuẩn xâm nhập màng ruột, dẫn đến triệu chứng tiêu chảy, sốt hay chuột rút[8] SVTH Hậu_11SHLT Page Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Shigella - Lây truyền từ người biến chế thức ăn không chịu rửa tay cho kỹ lưỡng trước sờ mó vào rau cải thực phẩm tươi sống Khuẩn Shigella tìm thấy thịt gà, dĩa salade sữa Triệu chứng phát sau ăn vài ngày đau bụng quặn thắt, sốt nóng tiêu chảy thường có máu Khỏi bệnh sau 5-7 ngày Trường hợp nặng thấy trẻ em tuổi Các cháu bị động kinh co giật Một số người bị nhiễm mà không bị bệnh hết họ lại lây nhiễm cho người khác[2] 2.6 Vi khuẩn gây bệnh thuộc giống Vibrio Vibrio vi khuẩn hình que cong, di động nhờ lông đầu, hiếu khí kỵ khí tùy tiện Hầu hết có phản ứng oxidase catalase dương tính, lên men đường không sinh hơi, chuyển natri thành nitrit, cần Na+ (muối NaCl) cho phát triển Chúng thường xuất vùng nước ven biển, không thích hợp với môi trường thiếu muối[9,11] Vibrio cholerae chủng vi khuẩn gây trận dịch tả toàn giới Dịch tả gây V cholerae thường lan truyền nhanh qua đường nước, gây ô nhiễm thực phẩm truyền nhiễm qua người điều kiện vệ sinh Các loại rau sống tưới rửa nước nhiễm bẩn gây nhiễm khuẩn vào thức ăn[14] Vi khuẩn Vibrio cholerae thấy đồ biển, cá, tôm tép, nghêu sò, nước bẩn Các trường hợp lũ lụt thường tạo điều kiện thuận lợi dễ làm lây lan dịch bệnh cholera Vibrio cholerae gây bệnh tả, bị nhiễm đau bụng quặn thắt, ói mửa, tiêu chảy dội chục lần đêm, phân lỏng trắng đục nước vo gạo Cơ thể bị suy xụp nhanh nước kéo theo chất điện giải bại thận Không chữa trị kịp thời chết[2,6] 2.7 Vi khuẩn Clostridium perfringens Vi khuẩn Clostridium perfringens (C perfrin-gens) loại vi khuẩn thường thấy đất, nước thải, ruột người động vật SVTH Hậu_11SHLT Page 10 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Những typ huyết có khả gây bệnh thường gặp lâm sàng là: O111B4, O867B7, O126B16, O55B5, O119B4, O127B8, O25B15, O128B12 Cơ chế gây bệnh E coli khác tùy loại: ETEC: gây bệnh ngoại độc tố LT, loại độc tố ruột V cholerae Độc tố bám vào thụ thể ruột, làm giảm hấp thu Na +, tăng tiết nước Cl- EIEC: gây bệnh khả xâm nhập vào niêm mạc đại tràng, chế gây bệnh giống vi khuẩn lỵ EHEC: chế chưa hoàn toàn rõ, người ta xác định loại độc tố có cấu trúc kháng nguyên chế tác động giống với ngoại độc tố S.shiga Trong trình gây bệnh, EHEC làm tổn thương xuất huyết ruột EPEC: chế chưa biết rõ E coli phát triển dễ dàng môi trường nuôi cấy thông thường Một số phát triển môi trường tổng hợp nghèo chất dinh dưỡng, hiếu kỵ khí tùy tiện, phát triển nhiệt độ từ 5- 40oC Trong điều kiện thích hợp E coli phát triển nhanh, thời gian hệ khoảng 20 đến 30 phút Cấy vào môi trường lỏng (như canh thang) sau 3- 4h làm đục nhẹ môi trường, sau 24h làm đục đều; sau hai ngày mặt môi trường có váng mỏng, ngày sau đáy ống thấy cặn Trên môi trường thạch thường, sau 24h khuẩn lạc khoảng 1,5 mm, hình thái khuẩn lạc điển hình dạng S, dạng R M E coli có khả lên men nhiều loại đường có sinh Tất E coli lên men lactose sinh (trừ E coli loại EIEC) E.coli có khả sinh indol, không sinh H2S, không sử dụng nguồn carbon citrat môi trường Simmons, có decarboxylase (vì có khả khử carboxyl lysin, ornitin, arginin acid glutamic, betagalactosidase (+), VP (-) Kháng nguyên O: người ta biết tới gần 160 yếu tố kháng nguyên O E.coli SVTH Hậu_11SHLT Page 21 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô a) Chẩn đoán trực tiếp Bệnh phẩm khác tùy bệnh: phân với nhiễm khuẩn đường tiêu hóa, nước tiểu với nhiễm khuẩn đường tiết niệu, máu nhiễm khuẩn máu… Có thể làm tiêu soi trực tiếp số loại bệnh phẩm cặn ly tâm nước tiểu nước não tủy Phương pháp chẩn đoán chủ yếu nuôi cấy phân lập Bệnh phẩm phân cấy môi trường có chất ức chế chọn lọc DCL, Endo Nước tiểu dòng tiến hành cấy thạch thường, máu cấy vào canh thang Sau phân lập vi khuẩn tiến hành xác định tính chất sinh vật hóa học định loại kháng huyết mẫu Đối với viêm màng não, người ta tiến hành phương pháp chẩn đoán nhanh đặc hiệu kỹ thuật ngưng kết latex để xác định kháng nguyên E coli dịch não tủy b) Chẩn đoán gián tiếp Trên thực tế chẩn đoán gián tiếp không sử dụng để chẩn đoán nhiễm khuẩn E coli 3.2.2 Xác định Salmonella[11] Salmonella trực khuẩn Gram (-), kích thước trung bình 3,0 x 0,5 µm, có nhiều lông xung quanh thân, trừ S.gallinarum S.pullorum (gây bệnh gà vịt) Hiếu kỵ khí tùy tiện, phát triển môi trường nuôi cấy thông thường, mọc số môi trường có chất ức chế chọn lọc dùng phân lập vi khuẩn từ phân - Trên môi trường lỏng: sau 5-6h nuôi cấy, vi khuẩn làm đục nhẹ môi trường, sau 18h môi trường đục SVTH Hậu_11SHLT Page 22 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô - Trên môi trường thạch thường: khuẩn lạc tròn, lồi, bóng, không màu màu trắng xám - Trên môi trường phân lập SS: khuẩn lạc có màu hồng Salmonella không lên men lactose, lên men đường Glucose thường sinh Sử dụng citrat môi trường Simomons Catalase (+), oxidase (-) Lysindecarboxylase (+), urease (-), RM (+), VP (-), H2S (-), indol (-) Tuy nhiên loài có đầy đủ tính chất Những ngoại lệ xác định cần phải biết là: S.typhi lên men đường glucose không sinh citrat Simmon (-) Trong loài S.paratyphi A có số chủng sinh H2S loài kết thử citrat Simmon (-), lysindecarboxylase (-) S.arizona lên men lactose (tuy có chậm) onPG (-) a) Chẩn đoán trực tiếp  Nhuộm soi trực tiếp từ bệnh phẩm Nhuộm soi trực tiếp từ phân có giá trị chẩn đoán Thường tiến hành nhuộm đếm mật độ bạch cầu đa nhân để định hướng chẩn đoán Trong bệnh thương hàn, mật độ bạch cầu đa nhân phân khoảng 20/một vi trường (độ phóng đại x400)  Cấy máu Cấy máu tiến hành lúc bệnh nhân sốt cao, cần lấy máu trước điều trị kháng sinh Lấy đến 10 ml máu tĩnh mạch cấy vào canh thang (thường dùng canh thang có mật bò), ủ 37 oC Vi khuẩn thương hàn thường mọc sau 24 đến 48h Khi thấy có vi khuẩn mọc, tiến hành nhuộm Gram, xem hình thể tính chất bắt màu, cấy chuyển sang môi trường đặc, quan sát tính chất khuẩn lạc, kiểm tra tính chất sinh vật hóa học, cuối xác định tính công thức kháng nguyên kháng huyết mẫu Nếu chưa điều trị kháng sinh, tuần lễ đầu, tỷ lệ cấy máu dương tính đến 90%, tuần thứ khoảng 70- 80%; tuần thứ khoảng 40- 60% Cấy máu dương tính cho phép xác định chắn bệnh nhân mắc bệnh thương hàn  Cấy phân SVTH Hậu_11SHLT Page 23 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Trong phân có nhiều loại vi khuẩn, vậy, bệnh phẩm cần cấy vào môi trường có chất ức chế chọn lọc môi trường SS (Salmonella – Shigella), môi trường istrati, môi trường Endo, môi trường DCL…Trong môi trường có đường lactose thị màu giúp cho việc phân biệt vi khuẩn lên men không lên men lactose Để tránh bỏ sót trường hợp phân có mầm bệnh, thực tế, việc cấy trực tiếp vào môi trường có chất ức chế chọn lọc, cấy vào môi trường tăng sinh Sau vi khuẩn mọc, chọn khuẩn lạc nghi ngờ nhuộm soi, xác định tính chất sinh vật hóa học, xác định tính chất kháng nguyên Chỉ riêng cấy phân, dù phân lập vi khuẩn không cho phép ta xác định chắn bệnh nhân mắc bệnh người lành mang vi khuẩn thương hàn Cấy phân mục đích chẩn đoán bệnh có giá trị kiểm tra sau bệnh nhân hết dấu hiệu lâm sàng có tiếp tục đào thải vi khuẩn hay không b) Chẩn đoán gián tiếp Tiến hành phản ứng Widal để xác đinh kháng thể huyết Sau khinhiễm Salmonella 7- 10 ngày, máu xuất kháng thể O, sau 1214 ngày xuất kháng thể H Thời gian tồn kháng thể máu trung bình tháng kháng thể O đến năm kháng thể H 3.2.3 Xác định Shigella[11] Shigella trực khuẩn mảnh, bắt màu Gram (-), dài từ 1-3 µm, nuôi cấy có dạng cầu trực khuẩn Shigella lông, vỏ không sinh nha bào khả di động Như vi khuẩn đường ruột khác, Shigella vi khuẩn hiếu kỵ khí tùy tiện phát triển tốt điều kiện hiếu khí Trên môi trường đặc, chúng tạo thành khuẩn lạc tròn, lồi, bờ đều, có đường kính khoảng 2mm sau 24h Trên môi trường phân lập có lactose, khuẩn lạc không màu SVTH Hậu_11SHLT Page 24 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Tất Shigella lên men đường glucose, hầu hết không sinh hơi, số trường hợp có sinh yếu Các Shigella không lên men lactose, trừ S sonnei có khả lên men lactose chậm sau từ ngày đến tuần CácShigella flexneri, Shigella boydii Shigella sonnei có khả lên men monnitol; S dysenteriae khả Shigella không sinh H2S, không sử dụng citrat môi trường Simmons, không sinh indol Tất Shigella có kháng nguyên thân O, số có kháng nguyên K tất kháng nguyên H a) Nhuộm soi trực tiếp Bệnh phẩm lấy sau bệnh nhân bô sạch, nên lấy chỗ phân có nhầy máu, lấy trực tiếp từ trực tràng, làm tiêu nhuộm soi xác định mật độ bạch cầu đa nhân Ở bệnh nhân lỵ trực khuẩn, mật độ bạch cầu đa nhân phân cao, thường 30 đến 50, có 50 vi trường với độ phóng đại x400 b) Cấy phân Cấy phân phương pháp tốt để chẩn đoán bệnh lỵ trực khuẩn Bệnh phẩm cần phải cấy lên môi trường phân lập vi khuẩn lỵ chết nhanh sau môi trường, nên cấy môi trường có chất ức chế chọn lọc như: DCL, Endo, SS chất ức chế chọn lọc thạch lactose- xanh bromothymol Sau 24h, chọn khuẩn lạc nghi ngờ, xác định tính chất sinh vật hóa học định loại kháng huyết mẫu c) Chẩn đoán gián tiếp Phản ứng huyết làm để chẩn đoán bệnh lỵ trực khuẩn bện cấp tính, cần chẩn đoán nhanh, mặc khác, phản ứng huyết tính đặc hiệu cao Tuy nhiên, chẩn đoán huyết tiến hành với trường hợp mạn tính, cấy phân không phân lập vi khuẩn, làm mục đích nghiên cứu dịch tễ học[11] 3.2.4 Xác định Vibrio cholerae[11] V cholera hiếu khí, nhiệt độ thích hợp 37 oC, phát triển tốt môi trường kiềm (pH 8,5- 9,5), có nồng độ NaCl cao (3%) Trong môi SVTH Hậu_11SHLT Page 25 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô trường pepton kiềm mọc nhanh tạo váng Trên môi trường thạch kiềm sau 18h quan sát thấy khuẩn lạc tròn, lồi nhẵn suốt Trên thạch MacConkey khuẩn lạc (không lên men đường lactose) Trên môi trường TCBS khuẩn lác có màu vàng lên men đường sucrose Tính chất sinh vật hóa học Oxidase (+), indol (+), glucose (+), sucrose (+), manose (+), lactose (-), arabinose (-), H2S (-), urease (-) Khả đề kháng V cholerae có sức đề kháng yếu với tác nhân lý hóa, trừ pH kiềm Tuy nhiên sống 1h phân số ngày nước a) Chẩn đoán trực tiếp Bệnh phẩm phân chất nôn, cần phải xét nghiệm ngay, chưa xét nghiệm vòng 2h phải cấy vào môi trường bảo quản CaryBlair b) Nhuộm soi soi tươi Nhuộm soi để quan sát hình thể vi khuẩn trực tiếp từ bệnh phẩm có giá trị Nhuộm soi đếm bạch cầu phân: bệnh tả thường thấy số lượng ít, khoảng bạch cầu vi trường, quan sát tính di động vi khuẩn tả kính hiển vi đen c) Nuôi cấy phân lập Các môi trường thường dùng để phân lập vi khuẩn tả là: pepton kiềm, thạch kiềm, TCBS Kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp (Direct Fluorescent Antibody Test – DFA) Làm tiêu từ bệnh phẩm sau cấy vào pepton kiềm 6-8h Nhuộm tiêu kháng thể gắn huỳnh quang Rửa loại bỏ phần kháng thể huỳnh quang thừa soi kính hiển vi huỳnh quang Phương pháp cho kết nhanh có tính đặc hiệu cao, thường áp dụng kiểm dịch cửa SVTH Hậu_11SHLT Page 26 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Hiện số nước sản xuất chẩn đoán nhanh, theo nguyên lý kỹ thuật kháng thể huỳnh quang trực tiếp, sử dụng kháng thể đơn dòng với độ nhạy độ đặc hiệu đạt 100% - Các chủng không thuộc nhóm 01 gây bệnh, chế gây bệnh khác với V cholerae 01 - Từ năm 1992 xuất nhóm huyết mới, V cholerae 0139, gây nhiều vụ dịch tả nhiều nước giới- Các V cholerae không thuộc nhóm 01 không ngưng kết với kháng huyết 01, chúng bị ngưng kết gặp kháng huyết đặc hiệu Thu thập bệnh phẩm Mẫu phân nên thu thập sớm, trước điều trị kháng sinh Mẫu phân chưa làm phải bảo quản môi trường vận chuyển Cary-Blair, vi khuẩn tả sống tuần môi trường Có thể sử dụng môi trường canh thang giầu chất dinh dưỡng làm môi trường vận chuyển: nước peptôn kiềm canh thang peptôn tellurite-taurocholate Giữ lâu bệnh phẩm nước peptôn kiềm nhiệt độ phòng, loài Pseudomonas vi khuẩn tả 01 non-01 phát triển lấn át vi khuẩn tả 01 Các mẫu bệnh phẩm giữ môi trường vận chuyển nên gửi tới phòng thí nghiệm, không để tủ lạnh vi khuẩn tả nhạy cảm tủ lạnh Soi trực tiếp Lam kính 1: Hoà mẫu phân vào nước muối sinh lý, nhỏ giọt lên lam kính, đậy phiến kính mỏng (lamen) lên Soi tiêu trực tiếp kính hiển vi thấy vi khuẩn tả di động nhanh theo đường thẳng từ đầu đến cuối vi trường Lam kính 2: Nhỏ giọt huyền dịch phân lên lam kính, nhỏ giọt kháng huyết tả đa giá Nếu vi khuẩn tả vi khuẩn bị bất hoạt, không di động Soi tiêu kính hiển vi đen, vi khuẩn tả di động đổi Vi khuẩn tả trực khuẩn Gram âm, hình cong dấu phẩy Môi trường tăng sinh: pepton kiềm mặn - lần/ - giờ/ 370C SVTH Hậu_11SHLT Page 27 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Môi trường nuôi cấy: Trên môi trường thạch kiềm: khuẩn lạc tả tròn nhỏ, trong, ướt, long lanh hạt sương Trên môi trường TCBS (Thiosulphate - Citrate - Bile salts - Sucrose): khuẩn lạc tả màu vàng, to nhẵn Chọn khuẩn lạc nghi ngờ từ đĩa môi trường phân lập, cấy chuyển sang môi trường xác định tính chất sinh vật hoá học[13] 3.2.5 Xác định Shigella[11] Shigella giống vi khuẩn nguy hiểm, thuộc họ vi khuẩn đường ruột Enterobacteriaceae, gồm loài phổ biến S.flexerneri, S.dysenteriae, S.sonnei S boydii, gây bệnh lỵ cho người diện mật độ từ 10 đến 20 tế bào Bệnh nhiễm Shigella gây hội chứng Reiter, hội chứng HUS dẫn đến tử vong cao (tỷ lệ 0.7%) Gen mã hóa cho độc tính vi khuẩn Shigella nằm nhiễm sắc thể hay plasmid xâm lấn Những gen thường chịu tác động điều hòa đa yếu tố gen có khuynh hướng tập trung thành cụm gene Các phương pháp PCR phát gen độc tính gây bệnh Shigella thường tập trung vào gene: gene virA (nằm NST), ipaH ial (2 gene nằm plasmid) Gene ial thường tìm thấy plasmid lớn – có khuynh hướng bị trình di truyền, gây tượng âm tính giả phát gene Gene ipaH diện NST plasmid Shigella, gene có tính ổn định cao để phát Kit định tính Shigella dựa kỹ thuật PCR – Điện di để phát diện vi khuẩn Shigella mẫu thực phẩm Quy trình PCR sử dụng cặp mồi nhân phần đoạn gene iapH, chứng minh diện rộng rãi chủng Shigella nhiều nghiên cứu giới Việt Nam Sự diện sản phẩm PCR kích thước 423bp gel agarose cho phép kết luận mẫu nhiễm khuẩn Shigella Quy trình thực gồm bước SVTH Hậu_11SHLT Page 28 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô (1) Tăng sinh môi trường Buffered Peptone Water (2) Tách chiết, thu nhận DNA (3) Nhân DNA PCR (4) Điện di xem kết Toàn quy trình thực khoảng 30 KẾT LUẬN Tình hình ngộ độc thực phẩm nguy ô nhiễm thực phẩm thách thức việc bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm Ngộ độc thực phẩm đe dọa trực tiếp đến sức khỏe, tính mạng người tiêu dùng, công nhân làm việc, sinh hoạt nhà máy, khu công nghiệp, ảnh hưởng đến hoạt động kinh tế, an sinh xã hội Phòng, chống ngộ độc thực phẩm hiệu quả, bền vững đòi hỏi nỗ lực hợp SVTH Hậu_11SHLT Page 29 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô tác chặt chẽ, thường xuyên cấp, ngành, địa phương cộng đồng Thông qua đồ án em giúp cho em hiểu biết nhiều tình hình ngộ độc thực bồi đắp cho em kiến thức chuyên ngành công ngệ sinh Giúp cho em có ý thức ván đề giữ gìn vệ sinh an toàn thực phẩm vận động người xung quanh phòng tránh rủi ro thực phẩm không an toàn gây PHỤ LỤC SVTH Hậu_11SHLT Page 30 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Hình 3.2 E.coli, Salmonella, Shigella Hình 3.3 Phân lập E.coli MacConkey - Phân lập E.coli CHRO Magar Hình 3.4 E.coli kính hiển vi điện tử SVTH Hậu_11SHLT Page 31 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Hình 3.5 Salmonella phát triển thạch máu Hình 3.6.Salmonella thạch McConkey-Salmonella sau 24h thạch XLD Hình 3.7 Shigella thạch HE, khuẩn Hình 3.8 Nuôi cấy Shigella lạc tròn, bờ thạch McConKey SVTH Hậu_11SHLT Page 32 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Hình 3.9 Shigella kính hiển vi Hình 3.10 Vibrio cholerae kính hiển vi SVTH Hậu_11SHLT Page 33 Đồ án công nghệ GVHD: Trần Thị Xô Hình 3.11.Phân lập Vibrio MacConkey- Phân lập Vibrio CHROMagar TÀI LIỆU THAM KHẢO [1].http://tcyh.yds.edu.vn/96-02/1996-1997/thuc%20an%20&%20cac %20benh%20nhiem%20trung%20tieu%20hoa.htm [2].http://www.yduocngaynay.com/88TK_NgTChanh_NgoDocThucPham.htm [3].http://vi.wikipedia.org/wiki/Ng%E1%BB%99_%C4%91%E1%BB %99c_th%E1%BB%B1c_ph%E1%BA%A9m#Vi_khu.E1.BA.A9n [4].http://vietbao.vn/Suc-khoe/8-trieu-nguoi-ngo-doc-thuc-pham-moinam/30189842/248/ [5] http://www.t5g.org.vn/Default.aspx?u=cmdt&grnid=102&cmid=24 [6].http://www.victoriavn.com/index.php/comp:news/id:397/Cac-loai-vikhuan-thuong-gay-ngo-doc-thuc-pham.html/# [7].http://kiemnghiemthucpham.blogspot.com/2011/01/28-tcn199-2004salmonella-trong-san.html [8] http://bancuabe.org/index.php? mod=entries&act=detail&yt=2&vd=2&id=20 [9].http://ngochungtihe.blogspot.com/2011/01/xac-inh-cac-loai-vibriotrong-thuc-pham.html SVTH Hậu_11SHLT Page 34 Đồ án công nghệ [10] GVHD: Trần Thị Xô http://www.scribd.com/doc/65381143/19/I-CAMPYLOBACTER- JEJUNI [11].http://www.impe-qn.org.vn/impe-qn/vn/portal/InfoDetail.jsp? area=58&cat=1101&ID=2761 [12] http://www.scribd.com/doc/31588247/Tieu-Luan-Salmonella [13] http://www.scribd.com/doc/55372088/BAO-CAOSTAPHYLOCOCCUS-2 [14].http://kt-biotech.com/vi/kit-chan-doan-vi-khuan-listeriamonocytogenes/39-kit-lm-dinh-tinh.html [15].http://blogthuysan.blogspot.com/2011/10/cach-kiem-tra-vi-sinh-vathieu-khi.html MỤC LỤC SVTH Hậu_11SHLT Page 35