Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột

Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột

Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật MỤC LỤC LỜI NÓI ĐẦU .1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN GÂY ĐỘC CỦA CAMPYLOBACTER .17 CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 18 TÀI LIỆU THAM KHẢO 19 [7] THƯỜNG QUY KỸ THUẬT - PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER TRONG THỰC PHẨM (52 TCN - TQTP 0014 : 2006 Viện Dinh dưỡng biên soạn, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm đề nghị, Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành) .19 LỜI NÓI ĐẦU Vi sinh vật có khắp nơi xung quanh phân, nước thải, rác, bụi, thực phẩm Trong không khí thể nơi cho vi sinh vật sinh sống, chúng sống kí sinh da (đặc biệt bàn tay), miệng, đường hô hấp, đường tiêu hóa, phận sinh dục, tiết niệu… Đặc biệt thức ăn nước uống đường để vi sinh vật xâm nhập gây bệnh cho người Hiện nay, ngộ độc vi sinh vật gây vấn đề xã hội quan tâm Liều gây ngộ độc cho người phụ thuộc vào loại độc tố vi sinh vật, tuổi tác tình trạng sức khoẻ người Một số loài vi sinh vật gây bệnh cần phải quan tâm Campylobacter tồn chủ yếu gia súc gia cầm Camplybacter loại vi khuẩn có hình xoắn, Gram âm, vi hiếu khí Chúng gây sốt, đau đầu, tiêu chảy, chuột rút, mê sảng Trong loài Campylobacter gây bệnh tiêu chảy cho người phổ biến C jejuni C coli Vì việc nghiên cứu xác định tính chất, đặc điểm loài quan trọng, từ ta xác định chế gây bệnh có công tác phòng chống, điều trị hợp lí nhằm đảm bảo sức khoẻ cho người Trang Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ TÁC NHÂN GÂY ĐỘC CỦA CAMPYLOBACTER Campylobacter loại vi khuẩn gây nhiễm trùng đường ruột bao tử gọi campylobacteriosic Thường campylobacteriosix đươc gọi campylobacter 1.1 Lịch sử phát Nhận thức y tế công cộng tác động Campylobacter phát triển qua nhiều kỷ Năm 1886 Escherich quan sát thấy sinh vật tương tự Campylobacter mẫu phân trẻ em bị tiêu chảy Các triệu trứng nhiễm khuẩn Campylobacter mô tả vào năm 1886 trẻ Theodor Escherich Campylobacter, nguyên nhân gây bệnh súc vật biết từ năm 1909 sau người ta nhận thấy nguyên nhân gây bệnh người Năm 1913 McFaydean Stockman xác định Campylobacter mô bào thai cừu bị hủy bỏ Năm 1927 vi trùng học lâm sàng Bỉ cô lập Campylobacter từ mẫu phân bệnh nhân bị tiêu chảy đến năm 1957 mô tả cô lập Campylobacter từ mẫu máu trẻ em bị tiêu chảy Trang Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật Năm 1969 Dekeyer phân lập từ phân bệnh nhân tiêu chảy sau vi khuẩn đặt tên campolybacter (campylo: cong ; bacter :que để phân biệt với Vibrio Sự phát triển phương tiện truyền thông có chọn lọc năm 1970 cho phép nhiều phòng thí nghiệm kiểm tra mẫu Campylobacter loài Campylobacter thành lập tác nhân gây bệnh phổ biến người 1.2 Phân loại: Campylobacter thuộc họ Campylobacteraceae Gồm hai chi Campylobacter Arcobacter , gần người ta phát thêm chi đặt tên Sulfurospirillum Campylobacter loài sinh vật có ảnh hưởng đến sức khoẻ người động vật Việc xác đinh Campylobacter cần thiết đòi hỏi phải có phát triển ngành vi sinh, hoá sinh công nghệ sinh học nhiều trường hợp mẫu thử nghiệm có tính chất khó xác định hạn chế phát Campylobacter phòng thí nghiệm Hiện nhiều phương pháp đại người phát định lượng khoảng 16 loài Campylobacter : C coli, C concisus, C curvus, C fetus, C gracilis, C helveticus, C hyointestinalis, C jejuni, C lari, C mucosalis, C rectus, C showae, C sputorum, C upsaliensi, C.hominis, C insulaenirae, C lanienae Trong loài Campylobacter gây bệnh tiêu chảy cho người phổ biến C jejuni C coli Campylobacter Coli Campylobacter Jejuni Trang Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật 1.3 Đặc điểm 1.3.1 Đặc điểm chung Campylobacter loại vi khuẩn gây nhiễm trùng đường ruột bào tử gọi campylobacteriosis Thường campylobacteriosis gọi campylobacter Con người thường bị nhiễm trùng ăn uống thức ăn, nước uống bị ô nhiễm sữa không tiệt trùng Phần lớn người bị nhiễm campylobacter bị bệnh từ ba tới năm ngày, khoảng 20 phần trăm trường hợp, triệu chứng kéo dài tới hai tuần lâu Đôi người nhiễm bệnh phải nằm bệnh viện Tính gây bệnh Campylobacter tương đối cao, khoảng 500 tế bào đủ để gây bệnh Campylobacter vi khuẩn yếu Nó khó sống môi trường chế biến thực phẩm Di động nhờ tiên mao mọc lưỡng cực 1.3.2 Đặc điểm sinh hoá Campylobacter vi khuẩn có hình xoắn, Gram âm, vi hiếu khí (chỉ cần 5% Oxy cho sinh trưởng ,và sẽ sinh trưởng tốt điều kiện có khoảng 10% carbon dioxide) Đối với nhiệt độ, Campylobacter nhạy cảm , biên độ nhiệt độ thích hợp từ 3045oC Nhiệt độ tối thích cho phát triển 42OC, không phát triển nhiệt độ 210C Tại nhiệt độ 600C tồn khoảng giây Campylobacter nhạy cảm với điều kiện đông lạnh (đóng băng) sống vài tháng điều kiện lạnh Campylobacter nhạy cảm với acid, phát triển pH 4,8 -8,0, pH thích hợp từ 5-9, tối thích từ 6.5-7.5, Campylobacter nhạy cảm với muối Nồng độ 2,5% đủ để hạn chế chúng điều kiện phát triển tối ưu 1.4 Cấu trúc Campylobacter vi khuẩn Gram âm trực khuẩn Nó có tiên mao cực hai cực tế bào Trang Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật Hai tiên mao Một tiên mao Tế bào Campylobacter có chứa màng màng với periplasm hai màng Màng bao gồm lipopolysaccharide có endotoxic (nội độc tố) Protein màng gắn bề mặt màng đóng vai trò kháng nguyên  Cấu tạo kháng nguyên: Kháng nguyên thân O: chất lipopolisaccharid vững bền với nhiệt độ Dựa vào kháng nguyên O chia vi khuẩn thành 90 typ huyết khác Kháng nguyên lông H: dễ bị nhiệt độ phân hủy, dựa vào kháng nguyên H chia vi khuẩn thành 112 typ huyết khác 1.5 Yếu tố độc lực Các yếu tố độc lực mà Campylobacter tuân thủ tế bào biểu mô protein, tiên mao lipopolysaccharide, tương tác với dòng tế bào ruột, thâm nhập niêm mạc ruột gây tổn thương làm viêm dày ruột Enterotoxins (độc tố đường ruột): độc tố gây độc tế bào giết chết tế bào cách thay đổi đỉnh màng thẩm thấu (niêm mạc biểu mô) tế bào thành ruột Nó chủ yếu hình thành độc tố lỗ (chủ yếu clorua lỗ chân lông) tập hợp để tạo thành lỗ chân long màng tế bào dẫn đến tính thấm ion clorua màng tế bào niêm mạc đường ruột gây chết tế bào Độc tố enterotoxins gây tiêu chảy tác động trực tiếp lên chế tiết niêm mạc ruột Cytotoxin: độc tố cytotoxin phá huỷ tế bào niêm mạc gây tiêu chảy Eurotoxin: tác động trực tiếp lên hệ thống thần kinh trung ương hay ngoại biên Trang Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật Protein bám dính: tiêm mao bám dính vào niêm mạc đường ruột trình gây bệnh Vì chúng phải cạnh tranh với vi khuẩn thường trú ruột để chiếm lấy niêm mạc gây bệnh Các vi khuẩn Campylobacter sản xuất số protein bám dính chất polysaccharde thường thành phần cấu tạo màng tế bào, vách tế bào vỏ vi khuẩn 1.6 Cơ chế gây bệnh Cơ chế lây nhiễm chủ yếu bệnh chất tiết nước tiểu, máu, nước bọt đặc biệt lông chó, mèo… thứ bám vào thức ăn người, người bệnh tiếp xúc thân thiết với chó mèo hành động ve vuốt, ôm ấp, ngủ chung với chúng Một số trường hợp khác bị thú nuôi cắn trực tiếp Cơ chế truyền bệnh Campylobacter theo đường phân – miệng tiếp xúc người – người Khi mật độ vi khuẩn campylobacter tăng cao đến mức gây bệnh (khoảng 500 tế bào) chúng sẽ theo thức ăn vào thể qua đường tiêu hoá đến niêm mạc, đại tràng sử dụng roi hai cực tiết protein bám dính để cư trú, vi khuẩn phải tạo độc tố chống lại tế bào thực bào, từ tồn sản sinh phát triển Sau sản sinh độc tố enterotoxins gây tiêu chảy tác động trực tiếp lên chế tiết niêm mạc ruột, độc tố cytotoxin phá huỷ tế bào niêm mạc gây tiêu chảy…chúng sẽ thâm nhập vào đường nội bào, đường mà tế bào sử dụng để tái tạo lại phân tử từ bề mặt chúng Sau đó, nhanh chóng chuyển hướng tạo mạng lưới nội bào riêng gồm không bào chứa đầy vi khuẩn campylobacter, hay gọi túi tế bào, túi sẽ tiến dần đến nhân, cuối khu trú gần Golgi - trung tâm vận chuyển tế bào Kết làm phá huỷ niêm mạc thành ruột gây viêm thủng thành ruột dẫn đến tiêu chảy, đau bụng, mệt mỏi, sốt, buồn nôn nôn Hầu hết chủng C.jejuni sản xuất chất độc (cytolethal distending độc tố) mà gây cản trở cho tế bào từ phân chia kích họat hệ thống miễn dịch Điều giúp vi khuẩn né tránh hệ thống miển dịch tồn thời gian giới hạn tế bào Trang Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật 1.7 Bệnh triệu chứng bệnh 1.7.1 Các bệnh Campylobacter Campylobacter gây nhiễm khuẩn huyết, viêm màng não, viêm nội tâm mạc, viêm màng tim, viêm khớp… Vi khuẩn gây bệnh tiêu chảy ngộ độc thực phẩm cho người Trong bệnh viêm ruột Campylobacter (Campylobacteriosis), loài C.jejunisubsp jejuni chiếm đến 89 – 93% , C coli chiếm – 10% C lari chiếm tỷ lệ không đáng kể khoảng 0.1 – 0.2 % Hầu hết bệnh nhân Campylobacteriosis phát sớm điều trị phác đồ, sau vài ngày bệnh sẽ khỏi Nhưng người bệnh đối tượng suy yếu miễn dịch suy giảm miễn dịch trầm trọng (AIDS), tính mạng người bệnh dễ bị đe dọa Trong báo cáo mình, nhà nghiên cứu cho thấy nhiễm vi khuẩn Campylobacter kết hợp với hội chứng Guillain-Barre (gây cảm giác yếu cơ) nguyên nhân phổ biến gây bệnh bại liệt Hoa Kỳ viêm khớp, nhiễm trùng tim, nhiễm trùng máu Một số chủng C.jejuni sản sinh độc tố ruột giống vi khuẩn tả gây bệnh tiêu chảy, nước trầm trọng Campylobacter vi khuẩn có hại gây dạng phổ biến ngộ độc thực phẩm trẻ em Nó ảnh hưởng đến người lớn, mức độ thấp nhiều 1.7.2 Các triệu trứng nhiễm Campylobacter Vi khuẩn Campylobacter gây bệnh đường ruột với triệu chứng bệnh sau: Tiêu chảy, đau bụng, mệt mỏi, sốt, buồn nôn nôn Thời kỳ ủ bệnh từ 25 ngày, từ 1-10 ngày tùy theo thể trạng người Phân người bệnh lỏng, có nhiều máu không rơ, lẫn với chất nhày có bạch cầu Ở nước phát triển, trẻ tuổi thiếu niên có tỷ lệ mắc cao nhất, nước phát triển, đối tượng chủ yếu trẻ tuổi, người ta cho gần gũi trẻ với dạng vật nuôi kháng thể chưa phát triển hoàn thiện điều kiện khiến trẻ dễ bị nhiễm bệnh 1.8 Các biện pháp phòng xử lý bệnh 1.8.1 Phòng ngừa: Hiện chưa có vaccin phòng bệnh ,vì phòng bệnh chung giống bệnh đường ruột khác: vệ sinh môi trường, vệ sinh hoàn cảnh, vệ sinh an toàn thực phẩm, quản lý phân chất thải người bệnh Trang Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật Cần ăn chín, uống nước sôi, nấu chín kỹ thức ăn có nguồn gốc từ gia cầm, uống sữa tiệt khuẩn, tránh để thức ăn bị nhiễm bẩn lại sau nấu chín Nếu gia cầm, gia súc nuôi mắc bệnh cần phải điều trị kháng sinh, người tiếp xúc nên mặc quần áo bảo hộ, giày dép vào chuồng trại Khi vật nuôi bị ốm nguyên nhân không nên cho trẻ ôm ấp, gần gũi chúng Nên thực nghiêm chỉnh yêu cầu bàn tay sạch, rửa tay trước ăn sau vệ sinh xà phòng tiệt khuẩn Các chất thải người gia cầm, gia súc, vật nuôi phải tập trung khu cách ly với nơi sinh sống, không để tránh phát tán vi khuẩn gây viêm ruột mà nhiều bệnh truyền nhiễm khác 1.8.2 Điều trị: Đây bệnh nhiễm khuẩn sử dụng kháng sinh biện pháp quan trọng Ethyromycin, tetracyclin, quinolon sử dụng để điều trị Những trường hợp tiêu chảy nhiều sẽ có định bù nước điện giải Ngoài việc điều trị triệu chứng tùy theo thể bệnh Việc dùng kháng sinh nên dựa vào kết kháng sinh đồ đề có tham khảo cần thiết cho điều trị Campylobacteriosis theo số nghiên cứu gần thấy xuất Campylobacter kháng lại ciprofloxacin, tetracycline , erythromycin Địa phương chưa có điều kiệm làm kỹ thuật kháng sinh đồ cẩn phải dựa vào phác đồ hướng dẫn điều trị y tế Trang Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH 2.1 Phương pháp truyền thống (phương pháp nuôi cấy) 2.1.1 Phạm vi áp dụng Phát ô nhiễm Campylobacter sản phẩm thực phẩm tươi sống thực phẩm chế biến sẵn 2.1.2 Nguyên lý Phân lập xác định Campylobacter nuôi cấy môi trường chọn lọc môi trường vi hiếu khí 42oC thử nghiệm sinh hoá học đặc trưng 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ, môi trường thuốc 2.1.3.1 Dụng cụ, thiết bị chính: - Tủ ấm 420C - Máy đồng mẫu - Bình nuôi cấy kị khí - Túi tạo khí trường vi hiếu khí - Túi đồng mẫu có rãnh lọc - Đĩa petri, Φ 90 – 110 mm - Que cấy, đầu niken/crom platin 2.1.3.2 Môi trường: - Canh thang Preston - Thạch Charcoal cefoperazone desoxycholat (CCD) - Thạch 5% máu bò (hoặc thỏ) - Thành phần bổ sung vào môi trường sở - Thạch dinh dưỡng 2.1.3.3 Thuốc thử: - Dung dịch ôxy già (H2O2 3%) - Dung dịch Natri hippurat 1%c - Dung dịch Ninhydrin 3,5% - Dung dịch thử Oxydase - Bộ thuốc nhuộm Gram 2.1.4 Chuẩn bị môi trường mẫu thử 2.1.4.1 Chuẩn bị môi trường: Canh thang tăng sinh, môi trường nuôi cấy chọn lọc pha chế theo công thức hấp tiệt trùng Trang Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật 2.1.4.2 Chuẩn bị mẫu thử: Cân 25g thực phẩm, cắt nhỏ, xay nhuyễn đập máy đập mẫu điều kiện vô trùng 225 ml canh thang tăng sinh Preston thể đồng Các điểm cần lưu ý: Đối với loại thực phẩm đóng túi kín cần phải kiểm tra nhiều tiêu vi sinh vật nên tiến hành kiểm tra trước Campylobacter Campylobacter nhậy cảm với không khí điều kiện khô hanh Đối với loại thực phẩm có nhiều chất béo sau đồng mẫu phải lọc gạc vô trùng gập nhiều lớp 2.1.5 Tiến hành xác định Bước 1: Tăng sinh canh thang Preston Thực phẩm đồng canh thang Preston để vào bình kị khí Sau cho túi tạo khí chuẩn bị hướng dẫn phần phụ lục II vào bình đậy nắp lại Ủ điều kiện vi hiếu khí 420C từ 24 đến 48 Bước 2: Cấy chuyển sang môi trường thạch chọn lọc CCD Cấy vào đĩa thạch CCD, đĩa ăng canh thang tăng sinh chọn lọc Ủ điều kiện vi hiếu khí bước để vào tủ ấm 42oC / 24 – 48giờ * Nhận dạng: Đọc kết sau 24-48 Khuẩn lạc nghi ngờ Campylobacter dẹt, bóng, thường mọc lan, có màu từ xám kem nhạt đến xám xanh Bước 3: Xác định hình thể vi khuẩn Nhuộm Gram xác định hình thể vi khuẩn: Là bước quan trọng việc xác định Campylobacter vi khuẩn có hình dạng đặc trưng Trang 10 Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật Campylobacter vi khuẩn Gram âm (bắt mầu đỏ), có hình lượn sóng hình cánh chim Trường hợp vi khuẩn nuôi cấy để 48 có tiếp xúc với oxy không khí, Campylobacter chuyển sang dạng hình cầu Bước 4: Cấy chuyển sang môi trường thạch máu Từ khuẩn lạc xác định hình thể thạch đĩa CCD, dùng que cấy ria sang môi trường thạch 5% máu bò thỏ cho tạo thành khuẩn lạc riêng rẽ Nuôi cấy điều kiện vi hiếu khí 42 oC / 24 để thử tính chất sinh vật hoá học bước Bước 5: Thử tính chất sinh vật hoá học: a) Phản ứng Catalase: Nhỏ giọt H2O2 (oxy già) 3% lên lam kính, dùng que cấy lấy khuẩn lạc đặt vào giọt H2O2 Nếu thấy sủi bọt phản ứng dương tính b) Phản ứng Oxydase: Đặt tờ giấy lọc nhỏ lên lam kính Dùng que thuỷ tinh que gỗ vô trùng lấy khuẩn lạc phết lên tờ giấy lọc Nhỏ vài giọt thuốc thử Oxydase lên, đọc kết 10 giây đầu Phản ứng dương tính: Xuất màu tím xanh chỗ phết khuẩn lạc tờ giấy lọc * Lưu ý: Trước làm phản ứng nên thử lại thuốc thử với hai chủng vi khuẩn chuẩn có Oxydase âm tính Oxydase dương tính biết tuỳ theo phòng thí nghiệm Có thể dùng hai chủng chuẩn E.coli ATCC25922 (Oxydase âm), Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853(Oxydase dương) c) Phản ứng thuỷ phân Natri hippurat: phản ứng cần thiết để phân biệt Campylobacter jejuni với loài Campylobacter khác (khuyến khích áp dụng) Dùng que cấy lấy khuẩn lạc môi trường thạch máu cho vào ống nhựa ml có dung dịch natri hippurat 1% chuẩn bị sẵn theo hướng dẫn phần phụ lục I nghiền dung dịch có màu sữa, đem ủ ấm 37oC / Sau lấy cho từ từ 200 µ l dung dịch ninhydrin 3,5% Trang 11 Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật cách chạm nhẹ pipet vào thành ống để lớp dung dịch bên Ủ ấm lần 37oC 10 phút lấy đọc kết Phản ứng dương tính: Xuất màu tím sẫm xanh Phản ứng âm tính: Không màu mầu xám Tiêu chuẩn xác định Campylobacter: - Campylobacter vi khuẩn Gram âm (bắt mầu đỏ), có hình lượn sóng hình cánh chim - Catalase (+) - Oxydase (+) - Gr (-) - Catalase (+) Ngoài tính chất trên, C Jejuni thử khẳng định phản ứng thuỷ phân natri hippurat (+) Tính chất sinh vật hoá học số loài Campylobacter thường gặp Loài C jejuni C Coli C lari Catalase + + + Oxydase + + + + - - P/ứng Thuỷ phân natri hippurat Trang 12 Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật SƠ ĐỒ PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER TRONG THỰC PHẨM Bước 1: 25 gam TP 225 ml CT Preston KT vi hiếu khí 420C/ 24-48h Bước 2: Thạch CCD KT vi hiếu khí 420C /24 – 48h Khuẩn lạc nghi ngờ Bước 3: Nhuộm Gram xác định hình thể vi khuẩn Bước 4: Thạch máu KT vi hiếu khí /420C/24h Trang 13 Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột Thử Catalase Thử Oxydase GVHD: ThS Phạm Minh Nhật T/p Hippurat Trang 14 Test TP Hippocrate Oxidase Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật 2.2 Phương pháp đại (PCR) 2.2.2 Thiết bị, dụng cụ, vật liệu hóa chất 2.2.2.1 Dụng cụ, thiết bị chính: - Máy li tâm - Máy luân nhiệt - Thang DNA chuẩn - Pipetman đầu típ tương ứng - Eppendorf 2.2.2.2 Vật liệu hóa chất - Thành phần dung dich đệm cho phản ứng PCR gồm tris-HCl 20 mM, KCl 50 mM, MgCl2 mM, 0,01% gelatin, dNTP 0,1 mM, Taq polymerase, nước cất vô trùng - DNA xét nghiệm - Agarose gel - Dung dịch TBE - Cặp mồi xuôi va mồi ngược - Canh khuẩn BHI 2.2.3 Chuẩn bị DNA xét nghiệm phương pháp tiến hanh 2.2.3.1 Chuẩn bị DNA Cho 30 ml dung dịch nước rửa quày thịt gà vào 30 ml môi trường tiền tăng sinh có bổ sung 5% máu ngựa dung huyết, polymyxin B (10.000 IU/L), rifampicin (20 mg/L), trimethoprim (20 mg/L), cycloheximide (0,2 mg/L) trộn Ủ canh khuẩn tiền tăng sinh điều kiện vi hiếu khí (7 % O2, 10 % CO2 83 % N2) 420 C 24 Ly trích DNA cách lấy ml canh khuẩn BHI, ly tâm, bỏ phần nước phiá trên, thêm vào 500μl nước muối sinh lý, trộn sốc nhiệt 1000C phút ly tâm 8000 vòng/phút phút (Van de Giessen, 1998) Lấy 5ml phần nước phía nguồn DNA xét nghiệm 2.2.3.2 Phương pháp tiến hành Thành phần PCR gồm tris-HCl 20 mM pH 8.3, KCl 50 mM, MgCl2 mM, 0,01% gelatin, dNTP 0,1 mM, UI Taq polymerase, đoạn mồi 50 pmol, μl DNA xét nghiệm thêm nước cất hai lần vừa đủ 25 μl Phản ứng thực với máy luân nhiệt Perkin Elmer DNA Trang 15 Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật Giai đoạn biến tính 94 oC phút,2 chu kỳ (biến tính 94 oC/2 phút) - Làm đứt mạch liên kết hydrogen, hai sợi DNA tách rời đoạn ủ bắt cặp 64 oC/1 phút - Mồi bắt cặp mạch đơn DNA khuôn đầu 3’ Giai đoạn kéo dài chuỗi 72 oC/1 phút Thích hợp cho hoạt động DNA polymerase - DNA polymerase xúc tác gắn nucleotid vào cuối đoạn mồi Từ chu kỳ thứ đến 18, chu kỳ liên tiếp có nhiệt độ ủ bắt cặp giảm oC (từ 62 oC đến 58 0C) 30 chu kỳ (94 oC/1 phút, 54oC/1 phút 72 oC/ phút) Sản phẩm PCR điện di thạch agarose 1,6% Gel ngâm dung dịch TBE có 1% ethidium bromide khoảng 30 phút Kết đọc ánh sáng UV Xác định loài Campylobacter dựa vào kích thước sản phẩm khuếch đại thang DNA chuẩn (ladder) C jejuni băng có kích thước 362 bp, C coli băng có kích thước 773 bp Bảng Trình tự đoạn mồi để xác định C jejuni C coli (Van de Giessen, 1998) Đoạn mồi Trình tự Primer COL1 5’ - AGG CAA GGG AGC CTT TAA TC- 3’ Primer COL2 5’- TAT CCC TAT CTA CAA ATT CGC- 3’ Primer JUN3 5’ - CAT CTT CCC TAG TCA AGC CT- 3’ 5’ AAG ATA TGG CAC TAG CAA GACPrimer JUN4 3’ Kích cỡ (bp) 773 362 Trang 16 Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật 287 Hình cho thấy gel PCR phát mảnh 287-bp (mũi tên) C jejuni MAPA gen trường hợp viêm ruột thừa cấp tính Trang 17 Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật CHƯƠNG III: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong thời buổi đại nay, toàn cầu hóa nhanh chóng ngành chế biến công nghệ thực phẩm khiến gia tăng nguy nhiễm độc thực phẩm Nhiều vụ ngộ độc thực phẩm xảy cộng đồng nhỏ lan rộng phạm vi toàn cầu Các nhà chức trách an toàn thực phẩm giới phải đảm bảo giải khâu an toàn thực phẩm tầm quốc gia mà phải liên kết hợp tác hành động nhà chức trách phạm vi quốc tế Điều quan trọng để trao đổi thông tin thường xuyên vấn đề an toàn thực phẩm để nhanh chóng đánh giá thông tin trường hợp khẩn cấp an toàn thực phẩm Campylobacter loài vi khuẩn cấp tính đường ruột cho người động vật, đường truyền nhiễm chủ yếu qua đường ăn uống không đảm bảo vệ sinh Vậy để ngăn ngừa phòng trừ bệnh thực phẩm tiêu dùng phải đảm bảo vệ sinh an toàn, phải qua kiểm nghiệm tránh tiêu thụ loại thục phẩm không rõ nguồn gốc, chế biến bảo quản không hợp vệ sinh Các quan thẩm quyền cần phát triển mạnh mẽ công tác điều tra kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm nhiều khu vực như: xí nghiệp, chợ, nhà hàng, …và phải có hình thức xử phạt hợp lý cho nơi vi pham Khi thể có biểu khác thường( ngộ độc, tiêu chảy, …) cần đưa gấp đến sơ y tế để điều trị kip thời Trang 18 Campylobacter vi khuẩn gây bệnh đường ruột GVHD: ThS Phạm Minh Nhật TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]http://vi.wikipedia.org/wiki/C%C6%A1_ch%E1%BA%BF_%C4%91%E1%BB%99c_l %E1%BB%B1c_c%E1%BB%A7a_vi_khu%E1%BA%A9n [2] http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15373879 [3] http://www.mgc.ac.cn/cgi-bin/VFs/genus.cgi?Genus=Campylobacter [4] http://en.wikipedia.org/wiki/Campylobacter [5] BÀI GIẢNG MÔN HỌC VỆ SINH AN TOÀN THỰC PHẨM (Nguyễn Thanh Thủy Khoa Công nghệ thực phẩm) [6] NGHIÊN CỨU KHOA HỌC KỸ THUẬT - Tạp chí KHKT Nông Lâm nghiệp, số 3/2005 Đại học Nông Lâm Tp HCM - CAMPYLOBACTER TRÊN QUÀY THỊT GÀ TẠI LÒ GIẾT MỔ GIA CẦM Ở THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH - Võ Ngọc Bảo, Nguyễn Ngọc Diễn, R Fries, Trạm chẩn đoán Xét nghiệm Điều trị, Chi cục Thú y Tp Hồ Chí Minh, Viện Vệ sinh Thịt Công nghệ Chế biến, Đại học Freie Berlin, Cộng hoà Liên bang Đức, Khoa Chăn nuôi Thú Y, Đại học Nông Lâm Tp HCM [7] THƯỜNG QUY KỸ THUẬT - PHÂN LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CAMPYLOBACTER TRONG THỰC PHẨM (52 TCN - TQTP 0014 : 2006 Viện Dinh dưỡng biên soạn, Cục An toàn vệ sinh thực phẩm đề nghị, Bộ trưởng Bộ Y tế ban hành) Trang 19