tiểu luận độc tố thực phẩm có nguồn gốc động vật

•Độc tố thuỷ sản tự nhiên:  Độc tố Độc tố Tetrodotoxin  Độc tố DSP– Độc tố gây tiêu chảy  Độc tố PSP – Độc tố gây liệt cơ  Độc tố NSP – Độc tố thần kinh  Độc tố ASP – Độc tố gây mất trí nhớ  Độc tố CFP •Độc tố cóc – bufotoxin

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA TP HỒ CHÍ MINH KHOA KỸ THUẬT HOÁ HỌC BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM MÔN HỌC: ĐỘC TỐ THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT GVHD: TS Phan Ngọc Hoà LỚP: Cao học 2015.1 HVTH: Lê Thị Thuỳ Dương – 1570420 Nguyễn Tấn Anh Nguyên – 1570433 Đặng Thị Như Quỳnh – 1570438 Bùi Thiên Thanh – 1570440 Lê Thị Thanh Thuỷ – 1570442 TP Hồ Chí Minh, tháng 04 năm 2016 DANH MỤC HÍNH ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT DANH MỤC BẢNG CH2015.1 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT MỞ ĐẦU Ngộ độc thực phẩm biểu bệnh lý xuất sau ăn uống thức ăn có chứa chất độc vi sinh vật có độc tố Ngộ độc thực phẩm gây nên nhiều nguyên nhân khác Một nguyên nhân kể đến thân nguyên liệu có độc có góp mặt không nguyên liệu từ động- thực vật Chúng ta nghe báo chí phương tiện truyền thông nói đến vụ ngộ độc ăn cá nóc, thịt cóc, trường hợp khác ăn phải khoai mì độc khoai tây nảy mầm Các triệu chứng trúng độc mức độ nhẹ đau bụng, tiêu chảy mức độ nặng ảo giác, đau đầu chí dẫn đến hôn mê gây chết người Bên cạnh chất gây độc, nguyên liệu động-thực vật số chất không phát độc tính có khả làm giảm giá trị dinh dưỡng thực phẩm khác cách làm giảm tồn hay làm cho tiêu hóa động vật người Những chất gọi chất kháng dinh dưỡng Chúng gây ảnh hưởng không nhỏ đến sức khoẻ người, qua làm giảm sút chất lượng sống Từ vấn đề nói trên, việc nghiên cứu chất độc chất kháng dinh dưỡng có nguyên liệu thực phẩm có ý nghĩa việc cung cấp thông tin nguồn gây độc, chế gây độc biện pháp phòng tránh Những hiểu biết giúp hạn chế nguy bị ngộ độc bị tác động xấu chất kháng dinh dưỡng, từ chất lượng sống người nâng cao Trong phạm vi báo cáo này, nhóm thực chủ yếu tập trung trình bày loại độc tố, chất kháng dinh dưỡng có sẵn nguyên liệu động vật Với loại CH2015.1 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT độc tố, nội dung trình bày gồm: cấu tạo nguồn gốc, chế gây độc, triệu chứng cách phòng tránh Chương Tổng quan 1.1 Tổng quan thuỷ hải sản Việt Nam Việt Nam có bờ biển dài 3260 km với 112 cửa sông rạch 4000 đảo lớn nhỏ tạo nên nhiều eo vịnh đầm phá, đảm bảo cho nguồn tài nguyên thuỷ hải sản phong phú Trong vùng biển độc quyền kinh tế rộng khoảng triệu km2, tổng trữ lượng thuỷ sản biển đánh giá khoảng triệu tấn, lượng thuỷ sản tầng chiếm 62,7% nà tầng đáy chiếm 37,3% đảm bảo cho khả khai thác 1.4 đến 1.6 triệu thuỷ sản loại hàng năm có nhiều loại hải sản quý có giá trị kinh tế cao : tôm hùm, cá ngừ sò huyết…Với 1,4 triệu mặt nước nội địa, tiềm nuôi trồng thuỷ sản Việt Nam dồi dào, khoảng 1,5 triệu năm Mặt tích cực tiêu cực thuỷ hải sản:  Tích cực: Thủy hải sản nguồn thực phẩm đem lại nguồn dinh dưỡng quý báu cho người Cung cấp đạm, chất khoáng, vitamin…  Tiêu cực: Chứa độc tố nguy hiểm: tetrodotoxin- độc tố thần kinh, Ciguatoxin, DSP- độc tố gây tiêu chảy, PSP – độc tố gây liệt cơ, NSP gây rối loạn thần kinh, ASP gây trí nhớ Theo Viện Hải dương học Nha Trang, vùng biển Việt Nam, nhà khoa học xác định 41 loài sinh vật chứa độc tố có khả gây chết người Cụ thể cá nóc, cá ngừ, cua mắt đỏ, bạch tuộc… CH2015.1 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Hình 1.1 – Cá Bạch tuộc đốm xanh 1.2 Phân loại độc tố • Độc tố thuỷ sản tự nhiên:  Độc tố Độc tố Tetrodotoxin  Độc tố DSP– Độc tố gây tiêu chảy  Độc tố PSP – Độc tố gây liệt  Độc tố NSP – Độc tố thần kinh  Độc tố ASP – Độc tố gây trí nhớ  Độc tố CFP • Độc tố cóc – bufotoxin CH2015.1 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Chương Độc tố chất kháng dinh dưỡng có nguyên liệu động vật 2.1 Độc tố thuỷ sản tự nhiên 2.1.1 Độc tố Tetrodotoxin 2.1.1.1 Cấu tạo tính chất Chất độc tetrodotoxin (TTX) có công thức phân tử C 11H17O8N3, chất độc thần kinh, độc, gây tử vong cao, chất phân lập từ số loại vi khuẩn: epiphytic bacterium, phảy khuẩn (vibrio species), pseudomonas species, da nội tạng kỳ nhông, bạch tuộc vòng xanh, cá nóc… Tetrodotoxin protein, tan nước, không bị nhiệt phá huỷ Nấu chín hay phơi khô, sấy, độc chất tồn (có thể bị phân huỷ môi trường kiềm hay acid mạnh) Tetrodotoxin có tính bền vững cao, cho vào dung dịch HCl 0,2 đến 0,3% sau bị phân huỷ, đun sôi (100°C) sau giảm nửa độc tính, muốn phá hủy hoàn toàn độc tính phải đun sôi 200°C 10 phút LD50: 8–20 mg/kg lượng sử dụng Trọng lượng phân tử: 319.27, C11H17O8N3 CH2015.1 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Hình 2.2 – Công thức cấu tạo Tetredotoxin Trong phân tử TTX có nhóm guanidin tích điện dương gồm ba nguyên tử nitơ vòng pyrimidin hợp với vòng bổ sung tạo thành hệ có năm vòng Hệ thống vòng có chứa nhóm hydroxylvốn có khả làm cho phức liên kết TTX kênh Na ổn định bề mặt pha liên nước Vùng liên kết TTX kênh Na hẹp (d =10-10 nm) TTX giống cation Na+ hydrat hoá nên vào cửa (miệng) phức hệ peptid tạo kênh Na, TTX liên kết với gốc glutamat phức hệ peptid sau giữ chặt lấy chỗ dựa phức hệ peptid thay đổi độ bền Dù có thay đổi hình thể phức, TTX sau gắn kết với lỗ kênh Na liên kết tĩnh điện Tetrodotoxin độc tố thần kinh mạnh từ loài hải sản Bình thường độc tố tồn dạng tiền độc tố tetrodomin không độc Độc tố phân bố chủ yếu gan (hepatoxin), buồng trứng (tetrodotoxin, tetrodonin acid tetrodonic) Độc tố tăng lên mùa đẻ trứng từ tháng đến tháng hàng năm Thịt cá thường không độc Khi bị đập chết bị ươn tetrodomin chuyển hoá thành tetrodotoxin gây độc Chất độc từ ruột ngấm vào thịt cá chế biến không loại bỏ hết phủ tạng, da, máu cá làm cho thịt cá trở nên độc người sử dụng 2.1.1.2 Các nguồn thực phẩm chứa độc tố Tetrodotoxin Trên giới ,vấn đề ngộ độc thực phẩm chứa tetrodotoxin mà đặc biệt ngộ độc cá thực trạng cộm, gây hậu nghiêm trọng sức khoẻ tính mạng người tiêu dùng Tại Nhật Bản số thống kê cho thấy 10 năm (1954-1963) nước Nhật có tới 1.962 người bị ngộ độc ăn cá nóc, 1153 người bị tử vong (87,76% số người mắc) Con số thống kê Ngành Vệ sinh Dịch tễ giới cho thấy, số người bị ngộ CH2015.1 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT độc chết cá lên đến 60% tổng số vụ ngộ độc ăn sản phẩm thuỷ sản Ở vùng biển nước ta có nhiều loài thủy sản có khả tạo độc tố Có sáu loại độc tố tìm thấy thủy sản: tetrodotoxin - độc tố thần kinh, ciguatera, DSP - độc tố gây tiêu chảy, PSP - độc tố gây chứng liệt cơ, NSP - độc tố gây loạn thần kinh, ASP độc tố gây chứng trí nhớ Trong loài thủy sản, cá chứa nhiều độc tố Người ta tìm thấy nhiều chất độc có phận khác cá như: buồng trứng có tetrodonin, axit tetrodonin, tetrodotoxin; gan có hepatoxin Ở da máu cá tìm thấy loại chất độc Thịt cá thường không độc, cá chết, cá bị ươn thối,chất độc từ buồng trứng, gan ngấm vào thịt cá Khi thịt cá trở nên độc a Cá Cá (có nơi gọi cá cóc, cá bống biển, cá đùi gà) với hàng trăm loài giới: Mỹ (gọi pufferfish), Nhật Bản (gọi fugu fish) Ở ViệtNam gần 70 loài khác cá sống nước mặn nhiều nước Loại cá độc người dân ăn thường có thân - 40 cm, chắc, vây ngắn, đầu to, mắt lồi, thịt trắng chất độc cá tập trung da, ruột, gan, bụng, tinh hoàn nhiều nhầt trứng cá, độc đực đặc biệt mùa cá đẻ trứng chất độc gọi tetrodotoxin (TTX) Tetroditoxin có cá coi chất có độc tính mạnh hệ thần kinh tim mạch, song nghiên cứu khoa học trước cho thấy sử dụng chất độc để điều chế thuốc tê, hạ huyết áp, điều trị bệnh viêm phế quản, kích thích hoạt động hệ thần kinh, hệ tuần hoàn hỗ trợ điều trị nghiện ma túy, rượu, thuốc CH2015.1 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Hình 2.3 – Cá b Mực đốm xanh Mực đốm xanh thường sống vùng biển nước nông, có độ sâu 50m, hay gặp Ấn Độ Dương, Bắc Úc, phía Tây Thái Bình Dương, có khu vực biển Đông nước ta Mực thường sống dải san hô, khe đá, chúng ẩn vỏ trai biển, chai lọ ống bơ vứt xuống biển Cũng cá nóc, maculotoxin tetrodotoxin mực độc bền vững, tồn với nồng độ cao mực chết dù chế biến nhiệt độ cao Chính vậy, ăn mực đốm xanh dễ bị ngộ độc nặng dẫn tới tử vong Biểu ngộ độc thường chóng mặt, buồn nôn, nôn, tiếng, mệt lả, khó thở, liệt tăng dần, dẫn tới trụy tim mạch Không trường hợp ngộ độc dẫn tới tử vong Hình 2.4 – Mực đốm xanh c Cóc Trên giới Việt Nam có nhiều trường hợp ngộ độc ăn thịt cóc, xuất phát từ quan điểm loại thịt bổ dưỡng thịt gà, bò, có lợi cho người suy dinh dưỡng, còi cọc suy kiệt Thực Việt Nam chưa có tài liệu khoa CH2015.1 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT học đại khẳng định điều Một số tài liệu Đông y có đề cập đến thịt cóc nguồn dinh dưỡng giàu đạm, thuốc chữa bệnh suy dinh dưỡng trẻ em Các tuyến da cóc tiết chất nhầy màu trắng, dính keo, dân gian gọi "nhựa cóc" Đây hỗn hợp độc tố có khả gây ảo giác, nghẽn mạch tăng áp suất máu Ngoài ra, số loài cóc chứa độc tố tetrodotoxin (có cá nóc) thông qua chế cộng sinh với số vi khuẩn d Cua mặt quỷ Loài cua phần vỏ ngực rộng khoảng gần 90mm, dài khoảng 55mm, có nhiều u lồi dẹt Cua sống có màu xanh da trời pha xanh với nốt màu trắng, nâu vàng Ngón chân kìm có màu nâu đen Cua mặt quỷ có tỉnh ven biển miền Trung từ Đà Nẵng đến Vũng Tàu, thường gặp rạn cạn, vùng triều thấp Độc tố cua có dạng "Saxitonin" nằm thịt trứng, nhiều thịt chân cua Một người ăn 0,5g thịt cua loại ngộ độc dẫn đến tử vong Hình 2.5 – Cua mặt quỷ e Một số loài khác CH2015.1 10 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT  Biểu lâm sàng: • Đau mắt, mũi, họng biểu kích thích tiếp xúc • Biểu giống ngộ độc digoxin • Rối loạn tiêu hóa: buồn nôn, nôn, tiêu chảy • Trên tim mạch: rối loạn nhịp tim, blốc dẫn truyền với nhiều cấp độ, tụt HA • Trên thần kinh: ảo giác, tê môi, nhức đầu, co giật hôn mê • Những biểu cận lâm sàng • Tăng Kali máu • Nồng độ digoxin máu tăng chứng có diện độc tố • ECG: cần theo dõi liên tục để phát rối loạn nhịp Chất độc cóc chất độc không tự hủy đun nấu nhiệt độ cao, ngâm nước muối dầu mỡ chiên rán không tiêu diệt chất độc Ngộ độc thực phẩm độc tố cấu xảy ăn thịt cóc bị nhiễm độc tố từ nhựa cóc gan cóc sót lại bị lẫn vào thịt cóc chế biến không kỹ Triệu chứng ngộ độc độc tố cóc có biểu cấp tính, thường xuất từ – sau ăn 2.2.5 Biện pháp xử lý Ngộ độc độc tố cóc thường nguy hiểm, tỷ lệ tử vong cao Sơ cấp cứu chữa trị cho bệnh nhân ngộc độc độc tố cóc cần phát dấu hiệu ngộ độc sớm (khi người bệnh tỉnh táo): cần gây nôn chủ động, chuyển bệnh nhân nhanh chóng đến bệnh viện gần CH2015.1 72 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT  Xử lý ngộ độc cóc gồm bước sau: Chủ yếu chống rối loạn tim mạch, hô hấp, thần kinh thận - Thải trừ chất độc: Rửa dày với than hoạt thuốc sổ Lợi tiểu furosemide - Chống loạn nhịp tim: - Tốt đặc máy tạo nhịp tim tạm thời qua tĩnh mạch - Chống tăng huyết áp - Chống rối loạn hô hấp: oxy liệu pháp, cần đặt nội khí quản thở máy - Chống rối loạn thần kinh tâm thần như: Diazepam, phenobarbital - Chống suy thận cấp: lọc thận (thận nhân tạo) Trường hợp bị dính chất nhựa cóc vào mắt, miệng gây tượng rát bỏng, sưng phồng Nếu lỡ bị dính chất nhựa cóc vào mắt, miệng nhanh chóng rửa chổ bị dính nhiều lần nước  Cách chế biến sử dụng thịt cóc sau cho an toàn: Tốt không nên xử dụng thịt cóc; mạo hiểm tính mạng với độc tố Cóc Nếu cần thiết, bắt buộc phải dùng nên chọn cóc to, màu xám hay vàng (không dùng có mắt đỏ, gọi cóc tía, loài độc) rửa sạch, để khô Dùng dao sắc chặt bỏ đầu (phía tuyến độc mang tai), chặt bỏ bàn chân, khía dọc sống lưng, lột da (nên lột chậu nước hay vòi nước để tránh nhựa không dính vào thịt không văng vào mắt), khoét bỏ hậu môn, loại bỏ hết nội CH2015.1 73 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT tạng ruột gan, mật, trứng cóc Còn lại thịt xương, lấy chúng thả vào chậu nhiều nước, khỏa mạnh, thay nước nhiều lần Để tách phần thịt khỏi xương, cách làm sau: cho cóc (đã lột da vứt bỏ hết nội tạng) vào chậu nước sôi để chừng 5-10 phút, thịt cóc co lại, vớt tuốt hết thịt để làm chà cóc (ruốc cóc) rang dòn tán thành bột mịn  Cẩn thận chế biến cóc Tránh nhựa (mủ) bắn vào mắt người chế biến (cần đeo kính bảo hộ) Tránh nhựa (mủ) dính vào thịt cóc Tránh làm vỡ trứng cóc, dính sót trứng cóc thịt 2.2.6 Kết luận Cóc với sức khoẻ người bên cạnh lợi ích nguy lớn đe doạ đến sức khỏe tính mạng người tiêu dùng Để dự phòng ngộ độc thực phẩm ăn thịt cóc sử dụng sản phẩm cóc qua chế biến dạng thực phẩm, thuốc quan chức cho phép lưu hành; muốn sử dụng thịt cóc để ăn cần loại bỏ cóc tía (cóc có mắt màu đỏ), chế biến thịt cóc theo quy trình (cắt bỏ đầu hai tuyến mang tai, chặt bàn chân, lột da chậu nước, khoét bỏ hậu môn, loại bỏ hết ruột, trứng, gan, mật, rửa nhiều lần vòi nước sạch), lấy thịt, xương để chế biến thành thực phẩm CH2015.1 74 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT KẾT LUẬN Những lợi ích thực phẩm có nguồn gốc động vật điều không cần bàn cãi Có lẽ, mối lo lớn người tiêu dùng loại thực phẩm có chứa hóa chất độc hại mà người cho thêm vào sản phẩm Nhưng bên cạnh đó, có nhiều chất dinh dưỡng có lợi cho thể, số thực phẩm có nguồn gốc động vật chứa thành phần độc tố tự nhiên Những độc tố này, ảnh hưởng rõ ràng thể người Vì vậy, nắm vững loại thực phẩm có nguồn gốc động vật có chất độc hại tự nhiên để thận trọng sử dụng có biện pháp loại bỏ thành phần độc hại trước chế biến CH2015.1 75 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT TÀI LIỆU THAM KHẢO Intergovernmental Oceanographic Commission, IOC Manuals & Guides No 33, 1995, Manual on Harmful Marine Microalga, p.95-112 Charles Patrick Davis, Wilderness: Ciguatera Toxin, Medically Reviewed by a Doctor, 26/3/2015 L Karalliedde, Review Article: Animal toxins, British Journal of Anasthesia (1995), 74, 319-327 Mclauchlin, J., Little, C (2007) Hobb’s Food poisoning and food hyegiene, 7th edition, 219-222 Gazzaniga, M., Ivry, R., & Mangun, G (2009), Cognitive neuroscience: The biology of the mind (3rd ed.) New York, NY: W W Norton & Company, Ltd Lê Ngọc Tú (2006), Độc tố học an toàn thực phẩm, NXB Khoa học kỹ thuật PHỤ LỤC CH2015.1 76 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT A Thống kê vùng nhiễm loại độc tố từ thuỷ hải sản giới Theo kết từ Chương trình nghiên cứu khảo sát khu vực ven bờ đại dương, Trung tâm quốc gia Khí Đại dương (NOAA/CSCOR/COP, USA), tháng 7/2012 Bảng - Thống kê khu vực ảnh hưởng độc tố thuỷ sản Loại độc tố Khu vực ảnh hưởng U.S west coast including Alaska Amnesic shellfish poisoning Atlantic Canada (ASP) Georges Bank Chile Australia New Zealand United Kingdom England Azaspiracid shellfish Scotland poisoning Ireland (AZP) France Spain Morocco Norway Hawaii Ciguatera fish poisoning Gulf of Mexico (CFP) Puerto Rico Caribbean Australia Many Pacific islands CH2015.1 77 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Diarrhetic shellfish Europe poisoning Japan (DSP) Atlantic Canada South Africa Chile Thailand New Zealand Australia U.S Gulf coast Neurotoxic shellfish New Zealand poisoning (NSP) U.S west coast including Alaska Paralytic shellfish poisoning New England coastal states (PSP) Canada Chile Brazil Europe South Africa Asia Australia New Zealand Swimmer's itch Australia Dermatitis Florida worldwide throughout the tropics and subtropics CH2015.1 78 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Hình Các vùng chịu ảnh hưởng độc tố cao đánh dấu chấm đỏ B Phương pháp xác định hàm lượng DSP theo TCVN TIÊU CHUẨN QUỐC GIA TCVN 8341:2010 NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ ( XÁC ĐỊNH HÀM LỰỢNG ĐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY (DSP) ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Bivalve molluscs  Determination of diarrhetic shellfish poisons (DSP) content  Method using high-performance liquid chromatography Lời nói đầu TCVN 8341 : 2010 Cục Chế biến, thương mại nông lâm thuỷ sản nghề muối biên soạn, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn đề nghị, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng thẩm định, Bộ Khoa học Công nghệ công bố TCVN 8341:2010 NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ ( XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG ĐỘC TỐ GÂY TIÊU CHẢY (DSP) ( PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Bivalve molluscs - Determination of diarrhetic shellfish poisons (DSP) content Method using high-performance liquid chromatography Phạm vi áp dụng Tiêu chuẩn quy định phương pháp xác định hàm lượng độc tố gây tiêu chảy (DSP) thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Nguyên tắc Độc tố DSP thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ dạng dẫn xuất axit okadeic CH2015.1 79 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT (OA), dinophysistoxin-1 (DTX-1) dinophysistoxin-2 (DTX-2) chứa nhóm chức cacboxyl, chuyển sang dạng huỳnh quang phản ứng este hoá với 9-anthryldiazometan (ADAM) định lượng hệ thống HPLC dùng detector huỳnh quang Thuốc thử Chỉ sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích, trừ có quy định khác, sử dụng nước cất loại dùng cho HPLC nước có độ tinh khiết tương đương Metanol, loại dùng cho HPLC n-hexan, loại dùng cho HPLC Cloroform Khí nitơ Axetonitril, loại dùng cho HPLC Dung dịch cloroform chứa 1,15 % etanol Cho 50 g alumin (đã hoạt hoá nhiệt độ 450 oC qua đêm) vào cột thuỷ tinh khô (đường kính 35 cm, dài 21 mm) có khoá chặn nhựa teflon Rót cloroform (3.3) qua cột loại bỏ 10 ml cloroform ban đầu qua cột Hứng lấy 50 ml cloroform vào bình định mức dung tích 50 ml (4.7) có chứa sẵn 575 ul etanol khan Dung dịch AcOA Hoà tan 100 mg axit 7-O-axetyl okadaic (AcOA) chuẩn ml metanol (3.1) Dung dịch DCA Hoà tan 3,5 mg axit deoxycolic (DCA) chuẩn (độ tinh khiết 98 %) 100 ml metanol (3.1) Dung dịch OA Pha xác dung dịch chất chuẩn axit okadaic (OA) metanol (3.1) thành dung dịch có nồng độ 1,0; 2,5; 5,0 12,5 mg/ml Dung dịch DSP chuẩn Cho xác 400 ml loại nồng độ dung dịch OA (3.9) với 140 CH2015.1 80 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT ml dung dịch DCA (3.8), 50 ml dung dịch AcOA (4.321) 110 ml metanol (3.1) vào lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu (4.9) Nếu dung dịch AcOA, thay 50 ml metanol (3.1) Dung dịch ADAM Hoà tan mg 9-anthryl-diazometan (ADAM) ml metanol (3.1) ánh sáng vàng bảo quản tối nhiệt độ –80 0C Dung dịch ADAM chuẩn bị sử dụng thời gian 24 h CHÚ THÍCH: ADAM chứa lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu (4.9), lọ chứa mg ADAM, bảo quản nhiệt độ –80 0C Mẫu thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ chuẩn, biết hàm lượng DSP Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường cụ thể sau: Cân phân tích, cân xác đến 0,1 mg Rây, cỡ số Máy nghiền, tốc độ 10 000 r/min Ống li tâm, dung tích 15 ml 50 ml Máy siêu âm Cột tách chiết lỏng rắn (SPE), dung tích ml, chứa hạt silicagel đường kính 40 mm, sấy nhiệt độ 130 0C không 24 h Bình định mức, dung tích 50 ml Máy ly tâm, tốc độ 000 r/min Lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu, dung tích 1,5 ml, có nút xoáy vòng đệm nhựa teflon, rửa kỹ axeton sấy khô qua đêm tủ sấy nhiệt độ 70 0C Ống nghiệm, dung tích 50 ml Hệ thống HPLC, với detector huỳnh quang Cột sắc ký, có đường kính 4,6 mm, dài 25 cm, có chứa hạt RP-18 octadecylsilica đường kính mm CH2015.1 81 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Micropipet, có thang đo từ 10 ml đến 000 ml Cách tiến hành  Chuẩn bị mẫu thử Rửa vỏ nhuyễn thể trước mở để lấy thịt Rửa nhanh thịt nhuyễn thể nước để loại bỏ cát sạn tạp chất khác Tránh làm dập nát thịt nhuyễn thể Cân lượng thịt nhuyễn thể, w1, xác đến 0,1 mg, cho có khối lượng phần nội tạng khoảng 20 g Tách phần nội tạng nhuyễn thể cho lên rây cỡ số (4.2) để yên để loại bỏ Cân lượng nội tạng này, w2, xác đến 0,1 mg Sau đó, mẫu nghiền máy nghiền (4.3) đồng Tách chiết độc tố từ mẫu thử Cân khoảng 2,0 g nội tạng nhuyễn thể đồng theo 5.1.2, w3, xác đến 0,1 g cho vào ống ly tâm dung tích 50 ml (4.4) Thêm xác vào ống 114 ml dung dịch AcOA (3.7) 7,886 ml hỗn hợp dung dịch metanol (3.1) nƯớc theo tỷ lệ thể tích 80:20 Nếu dung dịch AcOA cho vào ống ly tâm lƯợng xác 8,0 ml hỗn hợp dung dịch metanol (3.1) nước theo tỷ lệ thể tích 80: 20 Đồng hỗn hợp ống máy nghiền (4.3) với tốc độ từ 000 r/min đến 10 000 r/min Sau đó, đặt ống ly tâm vào bể nước máy siêu âm (4.5) khoảng 10 Ly tâm hỗn hợp máy ly tâm (4.8) với tốc độ 000 r/min 10 gạn phần dung dịch ống sang lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu (4.9)  Tinh chế dung dịch chiết Cho xác 5,0 ml dung dịch chuẩn bị theo 5.2.2 vào ống ly tâm dung tích 15 ml (4.4) Tiến hành chiết lần với n-hexan (3.2), lần cho vào ml lắc mạnh khoảng 30 s, sau loại bỏ lớp n-hexan Thêm ml nước ml cloroform (3.3) vào ống ly tâm Lắc mạnh ống khoảng 30 s để trộn Chuyển lớp cloroform phía vào ống nghiệm dung tích 50 ml (4.10) Lớp dung dịch lại ống ly tâm tách chiết lần với ml cloroform (3.3) tiếp tục chuyển lớp cloroform vào ống nghiệm nói CH2015.1 82 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Làm bay dung dịch ống nghiệm có cloroform (3.3) đến khô dòng khí nitơ (3.4) Hoà tan cặn lại cách cho 200 ml dung dịch DCA (3.8) 800 ml metanol (3.1) vào ống lắc Chuyển dung dịch ống nghiệm vào lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu (4.9) Tạo dẫn xuất huỳnh quang với ADAM Chuẩn bị lọ thuỷ tinh nhỏ màu nâu (4.9) Sau đó, cho 35,0 ml dung dịch chuẩn bị theo vào lọ thứ (mẫu thử), 35,0 ml dung dịch DSP chuẩn (3.10) vào lọ thứ hai (mẫu chuẩn) 35,0 ml metanol (3.1) vào lọ thứ ba (mẫu trắng) Cho thêm vào lọ 100 ml dung dịch ADAM (3.11) (chú ý: phải sử dụng ánh sáng vàng giai đoạn để tránh ADAM bị phân hủy) Đậy chặt lọ để bể nước máy siêu âm (4.5) nhiệt độ khoảng 37 0C 10 Sau đó, tiếp tục lưu giữ lọ nhiệt độ 37 0C tối với thời gian h Làm khô dung môi lọ thuỷ tinh dòng khí nitơ (3.4) hay máy ly tâm chân không Hoà tan cặn lọ 300 ml hỗn hợp dung dịch cloroform (3.3) n-hexan (3.2) theo tỷ lệ thể tích 1:1 Tinh chế dẫn xuất cột SPE Hoạt hoá cột SPE Cho ml cloroform (3.3) ml hỗn hợp dung dịch cloroform (3.3) nhexan (3.2) theo tỷ lệ thể tích 1:1 qua cột SPE (4.6) Không để cột khô trình hoạt hoá Sau hoạt hoá, phải giữ mức dung môi cột cao mặt gel cột nhồi Tinh chế dẫn xuất ADAM Cho dung dịch dẫn xuất ADAM chuẩn bị theo 5.4.2 qua cột SPE (4.6) chuẩn bị theo với tốc độ giọt/s Loại bỏ dung dịch qua cột Rửa cột ml hỗn hợp dung dịch cloroform (3.3) n-hexan (3.2) theo tỷ lệ thể tích 1:1 ml dung dịch cloroform chứa 1,15 % etanol (3.6) Loại bỏ dung dịch rửa qua cột CH2015.1 83 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Thu hồi dẫn xuất ADAM Cho ml hỗn hợp dung dịch metanol (3.1) cloroform (3.3) theo tỷ lệ thể tích 1:9 qua cột SPE (4.6) hứng lấy dung dịch qua cột Làm khô dung dịch thu dòng khí nitơ (3.4) Hoà tan cặn 500 ml metanol (3.1) đem phân tích HPLC (4.11)  Phân tích độc tố HPLC Điều kiện phân tích cột sắc ký HPLC (4.12); pha động: hỗn hợp dung dịch axetonitril (3.5) nước theo tỷ lệ thể tích 8:2; chế độ đẳng nhiệt 40 0C; tốc độ dòng 1,0 ml/min; thể tích lần bơm 10 ml; Bước sóng cài đặt cho detector huỳnh quang: bước sóng kích thích 254 nm bước sóng phát xạ 410 nm  Dựng đường chuẩn Bơm dẫn xuất ADAM dung dịch DSP chuẩn (3.10) chuẩn bị theo 5.5 vào HPLC dựng đường chuẩn dựa độ hấp thụ nhận theo diện tích pic Khi đường chuẩn tuyến tính qua gốc tọa độ lần phân tích sau này, sử dụng dung dịch DSP chuẩn (3.10) có hàm lượng DSP gần với hàm lượng có mẫu thử Đường chuẩn lúc xây dựng từ độ hấp thụ dung dịch sử dụng gốc toạ độ  Xác định độc tố DSP Bơm dẫn xuất ADAM mẫu thử (xem 5.4) dẫn xuất ADAM mẫu trắng (xem 5.5) vào HPLC Mỗi mẫu bơm lần Tính độ hấp thụ trung bình cho mẫu theo diện tích pic sau trừ độ hấp thụ mẫu trắng Bơm dung dịch DSP chuẩn (3.10) vào HPLC với tần suất h bơm lần Tính kết Hàm lượng độc tố DSP (OA DTX-1 DTX-2) mẫu thử thịt nhuyễn thể hai mảnh vỏ, CDSP, tính miligam gam (mg/g) theo công thức sau: Trong trường hợp có sử dụng AcOA: CH2015.1 84 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT Trong trường hợp không sử dụng AcOA: Trong đó: AS độ hấp thụ trung bình độc tố có mẫu thử, tính theo diện tích pic; AC độ hấp thụ trung bình độc tố có dung dịch DSP chuẩn (3.10) nồng độ CC, tính theo diện tích pic; AIS độ hấp thụ trung bình AcOA có dung dịch mẫu thử, tính theo diện tích pic; AIC độ hấp thụ trung bình AcOA có dung dịch DSP chuẩn (3.10), tính theo diện tích pic; CC nồng độ độc tố cần xác định dung dịch DSP chuẩn (3.10), tính miligam mililit (mg/ml) w1 khối lượng mẫu thử thịt nhuyễn thể, tính gam (g); w2 khối lượng phần nội tạng thu đƯợc từ w1 (g) thịt nhuyễn thể, tính gam (g); w3 khối lượng phần nội tạng nhuyễn thể lấy để phân tích, tính gam (g); V thể tích dịch chiết thu (xem 5.3.4) tương ứng với khối lượng phần nội tạng nhuyễn thể lấy để phân tích (xem 5.2.1), tính milinit (ml) (V=2 ml tương ứng với w3=2,0 g)  Độ lặp lại độ thu hồi  Độ lặp lại Độ lệch chuẩn lặp lại, CVs, tính theo độ hấp thụ lần bơm liên tiếp dung dịch DSP chuẩn phải nhỏ 0,5 %  Độ thu hồi Độ thu hồi, R, xác định cách đo mẫu chuẩn biết xác hàm lượng độc tố DSP (3.12) Độ thu hồi thu phải nằm khoảng từ 85 % đến 115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn 90 % CH2015.1 85 ĐỘC TỐ CÓ NGUỒN GỐC TỪ ĐỘNG VẬT  Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: thông tin cần thiết việc nhận biết đầy đủ mẫu thử; phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; phương pháp thử sử dụng viện dẫn tiêu chuẩn này; thao tác không quy định tiêu chuẩn này, điều coi tự chọn, chi tiết có ảnh hưởng tới kết quả; kết thử nghiệm thu CH2015.1 86