PHÁT HIỆN dấu ấn SINH học CHẨN đoán sớm UNG THƯ vòm mũi HỌNG

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG GẤM PHÁT HIỆN DẤU ẤN SINH HỌC CHẨN ĐOÁN SỚM UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN CỨU SINH HÀ NỘI - 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HỒNG GẤM PHÁT HIỆN DẤU ẤN SINH HỌC CHẨN ĐOÁN SỚM UNG THƯ VÒM MŨI HỌNG Chuyên ngành: Dị ứng miễn dịch Mã số: 62720109 ĐỀ CƯƠNG DỰ TUYỂN NGHIÊN CỨU SINH NGƯỜI DỰ KIẾN HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS Nguyễn Văn Đô TS Nguyễn Thanh Bình HÀ NỘI – 2015 CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc BÀI LUẬN VỀ DỰ ĐỊNH NGHIÊN CỨU - Họ tên thí sinh: NGUYỄN THỊ HỒNG GẤM - Cơ quan công tác: Trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên - Chuyên ngành dự tuyển: Miễn dịch Mã số : 62720109 Lý chọn đề tài lĩnh vực nghiên cứu Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) bệnh gặp giới lại coi bệnh đặc thù số nước khu vực Đông Nam Á có Việt Nam, Tỷ lệ mắc UTVMH Trung Quốc Đông Á 21/100.000 dân, Đông Nam Á 12,5/100.000 UTVMH thường có tỷ lệ tử vong cao Năm 2002, 80.000 ca UTVMH chẩn đoán toàn giới, có tới 50.000 ca tử vong Do UTVMH xếp hạng thứ 23 danh sách nhóm ung thư phổ biến giới UTVMH xếp loại giai đoạn theo cách phân loại T.N.M giai đoạn lâm sàng Liên ban phân loại ung thư Hoa Kỳ Trong đó, bệnh nhân UTVMH giai đoạn I II có khả sống dài so với giai đoạn III IV Tỷ lệ sống sót sau năm bệnh nhân giai đoạn III IV 54,5%, bệnh nhân giai đoạn I II lên tới 95% UTVMH bệnh khó chẩn đoán giai đoạn sớm, mà triệu chứng lâm sàng UTVMH nghèo nàn Bệnh nhân thường đến viện khối u phát triển gây triệu chứng mượn; Hoặc chí giai đoạn muộn tế bào ung thư di sang hạch bạch huyết, xâm lấn vào sọ làm cho bệnh nhân bị đau đầu thường xuyên Khoảng 70% bệnh nhân chẩn đoán UTVMH giai đoạn bệnh tiên triển có tiên lượng xấu Do vậy, chẩn đoán sớm UTVMH quan trọng để bệnh nhân điều trị sớm, góp phần làm giảm tỷ lệ tử vong nâng cao chất lượng sống Các phương pháp chẩn đoán UTVMH lâm sàng chưa cho phép chẩn đoán sớm Xét nghiệm mô bệnh học (chuẩn vàng) chẩn đoán hình ảnh (CT, MRI PET) có giá trị chẩn đoán theo dõi UTVMH, nhiên phương pháp thường áp dụng kích thước khối u lớn và/hoặc xâm lấn Do việc tìm kiếm công cụ chẩn đoán sớm UTVMH cần thiết Đề tài nghiên cứu với tên: “Phát dấu ấn sinh học chẩn đoán sớm ung thư vòm mũi họng” Mục tiêu mong muốn đạt đăng ký học nghiên cứu sinh - Mục tiêu: Mục tiêu chung đề tài xây dựng công cụ chẩn đoán sớm UTVMH cho người Việt Nam để từ tiến hành can thiệp sớm, làm giảm tỷ lệ tử vong nâng cao chất lượng sống cho người bệnh - Mong muốn: Được làm nghiên cứu sinh hội tốt cho thực mong muốn, ấp ủ nghề nghiệp Bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội số Trung tâm đầu ngành chuyên ngành Miễn dịch học nước, nơi thực nhiều nghiên cứu Miễn dịch kỹ thuật liên quan đến sinh học phân tử, chất lượng uy tín khoa học Qua trình thực luận án Tiến sỹ, mong muốn nắm vững kỹ thuật, kiến thức thông qua học hỏi thầy cô đồng nghiệp Bộ môn Bên cạnh đó, tham gia nghiên cứu, thầy cô truyền dạy cho phương pháp nghiên cứu khoa học, chia sẻ thành nghiên cứu Sau hoàn thành luận án, áp dụng kết nghiên cứu vào thực tiễn, góp phần nâng cao chất lượng nghiên cứu khoa học giảng dạy sở Lý để lựa chọn sở đào tạo Trường Đại Học Y Hà Nội, thành lập năm 1902, nôi đào tạo cán y tế chất lượng cao nước Cùng với bề dày truyền thống lịch sử phát triển lâu dài mình, Trường Đại học Y Hà Nội có đóng góp to lớn vào nghiệp giáo dục - đào tạo nghiệp xây dựng phát triển đất nước Đặc biệt nhà trường đào tạo đội ngũ đông đảo nhà khoa học với chương trình đạo tạo sau đại học với tất chyên nghành Y, Dược cho nước nhà Ngày nay, trường Đại học Y Hà Nội tiếp tục phát huy vai trò trọng điểm mình: gắn bó với nghiệp chăm sóc sức khoẻ nhân dân đào tạo nguồn nhân lực chất lượng cao cho ngành y tế Việt Nam Tất lý sở để định chọn trường Đại học Y Hà Nội nơi mong muốn theo học nghiên cứu sinh Những dự định kế hoạch để đạt mục tiêu mong muốn Để hoàn thành mục tiêu nghiên cứu luận án Tiến sĩ, phải cố gắng học tập, làm việc chủ động, tích cực nữa, luôn trau dồi thêm kiến thức trực tiếp qua thầy cô giáo qua sách báo Lên kế hoạch chi tiết cho việc nghiên cứu, lấy số liệu Bệnh viện K Hà Nội, Tiến hành kỹ thuật nghiên cứu labo xét nghiệm Bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà Nội Ngoài việc thực đề tài phải học tập, nghiên cứu chứng khung chương trình đào tạo Bộ Nhà trường Kết hợp với việc học tập kiến thức chuyên môn học hỏi kinh nghiệm sống quý báu từ thầy cô, đặc biệt thầy hướng dẫn - có uy tín đạo đức nghề nghiệp cao Kinh nghiệm, kiến thức, hiểu biết chuẩn bị thí sinh vấn đề dự định nghiên cứu 5.1 Kinh nghiệm - Về nghiên cứu Từ trường, công tác Bộ môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên, giúp đỡ lãnh đạo, thầy, cô đồng nghiệp, hàng năm có thực đề tài nghiên cứu khoa học cấp sở, đồng thời hướng dẫn cho em sinh viên thuộc hệ Bác sĩ đa khoa, đại học quy trường Đại học Y Dược Thái Nguyên nghiên cứu khoa học Qua trình học cao học Miễn dịch từ năm 2009 đến 2011, học hỏi số kiến thức kinh nghiệm nghiên cứu Quá trình nghiên cứu, đào tạo đem lại cho nhiều kinh nghiệm cách tiếp cận giải vấn đề, nâng cao kiến thức kỹ chuyên môn, kể kỹ trình bày báo cáo khoa học - Về thực tế, hoạt động xã hội ngoại khóa khác Tôi người đam mê công tác xã hội xem phần thiếu sống Tôi tham gia chương trình hoạt động nghiên cứu khoa học hay văn hóa văn nghệ mà môn nhà trường tổ chức cách tự giác, tích cực Tham gia khóa học, tập huấn ngắn hạn chuyên gia nước giáo sư nước giảng dạy đợt tập huấn Đại học Y Hà Nội Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Những lần học tập tiếp xúc giúp hoàn thiện thân, nâng cao trình độ chuyên môn tăng cường mối quan hệ giao lưu với bạn bè đồng nghiệp nước 5.2 Kiến thức, hiểu biết chuẩn bị thí sinh vấn đề dự định nghiên cứu Nghiên cứu phát dấu ấn sinh học gen EBV gen ức chế ung thư , với hy vọng giúp chẩn đoán sớm ung thư vòm mũi họng Theo định hướng hai thầy hướng dẫn, tiến hành nghiên cứu đề tài góp phần hoàn thiện phương pháp chẩn đoán sớm ung thư vòm mũi họng Nếu tiến hành thực nghiên cứu Đại học Y Hà Nội, nơi có điều kiện phương pháp nghiên cứu đạt chuẩn cho đề tài thực nghiệm, cố gắng tận dụng thời gian để học tập môi trường tuyệt vời cho học tập, làm việc để nâng cao trình độ chuyên môn Bản thân nhận thấy sẵn sàng cho đề tài nghiên cứu sinh 5.3 Các tồn Quá trình làm nghiên cứu sinh trường Đại học Y Hà Nội giúp bổ sung kiến thức kỹ chuyên môn, khả nghiên cứu khoa học, nâng cao đạo đức nghề nghiệp, nhằm phục vụ tốt cho công việc giảng dạy công tác chăm sóc sức khỏe nhân dân Dự kiến việc làm nghiên cứu sau tốt nghiệp Sau học xong nghiên cứu sinh, Tôi nhanh chóng áp dụng kiến thức học vào công tác giảng dạy môn Miễn dịch – Sinh lý bệnh, trường Đại học Y - Dược Thái Nguyên Trên sở hiểu biết sâu công tác nghiên cứu khoa học, tiếp tục tiến hành nhiều đề tài nghiên cứu phát sớm ung thư khác có liên quan đến EBV nhằm góp phần nâng cao giá trị khoa học, góp phần xây dựng phương pháp chẩn đoán sớm ung thư Việt Nam Đồng thời có trách nhiệm hướng dẫn, đào tạo hệ sinh viên đại học, học viên sau đại học chuyên ngành kiến thức chuyên môn, giúp nâng cao chất lượng cán y tế Đề xuất người hướng dẫn Hướng dẫn 1: TS Nguyễn Văn Đô Hướng dẫn 2: TS Nguyễn Thanh Bình DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADN ARN CD CS EA EBV EBER EBNA HLA LMP MHC MMSP PCR UCNT UTVMH VCA ZEBRA RAASF1A DAPK TSGs IARC Acid Desoxyribonucleic Acid Ribonucleic Cluster of Differenciation Cộng Early Antigen Epstein Barr Virus Epstein Barr virus Encoded RNAs Epstein Barr Virus Nuclear Antigen Human Leucocyte Antigen Latent Membrane Protein Major Histocompatibility Complex Multi Methylation Specific PCR Polymerase Chain Reaction Undifferentiated Carcinoma of Nasopharyngeal Type Ung thư vòm mũi họng Viral Capsid Antigen Bam H1 EBV Replication Activateur RAAS family A Dead associated protein kinase Tumor surpressor gens International Agency For Research on Cancer MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG 10 42 3.2.5 Xác định methyl hoá gen EBNA1 kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hoá đa mồi (MSP) Bảng 3.13 Kết phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hoá gen EBNA1: Methyl hoá (M), Không methyl hoá (K) Mồi Namalwa K M B95.8 Raji K M K Gen EBNA1 Wp Cp Qp 3.3 Xác định gen ức chế ung thư : RAASF1A, DAPK, BLU M 3.3.1 Tỷ lệ gen RAASF1A, DAPK, BLU mẫu bệnh phẩm bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Bảng 3.14 Tỷ lệ xuất gen RAASF1A, DAPK, BLU mẫu sinh thiết ung thư vòm mũi họng Mồi RAASF1A n Kết Tỷ lệ % DAPK n Tỷ lệ % BLU n Tỷ lệ % PCR (+) PCR (-) Tổng số Bảng 3.15 Tỷ lệ xuất gen RAASF1A, DAPK, BLU mẫu máu bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Mồi Kết PCR (+) PCR (-) Tổng số 42 RAASF1A n Tỷ lệ % DAPK n Tỷ lệ % BLU n Tỷ lệ % 43 Bảng 3.16 Tỷ lệ xuất gen RAASF1A, DAPK, BLU mẫu nước bọt bệnh nhân ung thư vòm mũi họng Mồi RAASF1A n Kết Tỷ lệ % DAPK n Tỷ lệ % BLU n Tỷ lệ % PCR (+) PCR (-) Tổng số 3.3.2 Xác định trình tự gen RAASF1A, DAPK, BLU bệnh nhân UTVMH ghi lại kết sau truy cập Ngân hàng gen 3.3.3 Xác định methyl hoá gen RAASF1A, DAPK, BLU kỹ thuật PCR đặc hiệu methyl hoá đa mồi (MSP) mồi thết kế sẵn Bảng 3.17 Kết phản ứng PCR đa mồi đặc hiệu methyl hoá gen RAASF1A, DAPK, BLU : Methyl hoá (M), Không methyl hoá (K) Mồi RAASF1A n Kết Tỷ lệ % DAPK n Tỷ lệ % BLU n Tỷ lệ % M (MSP+) K (MSP-) 3.4 Đối chiếu phát methyl hoá TSGs với mô bệnh học lâm sàng 3.4.1 Đối chiếu phát methyl hoá TSGs với mô bệnh học Bảng 3.18 kết MSP+ TSGs so với giai đoạn UCNT MSP+ Kết UCNT(SI) UCNT (SII) 43 RAASF1A n Tỷ lệ % DAPK n Tỷ lệ % BLU n Tỷ lệ % 44 UCNT (SIII) UCNT (SIV) Tổng 3.4.2 Đối chiếu phát methyl hoá TSGs với số đặc điểm : Tuổi, hạch di Bảng 3.19 kết MSP+ TSGs so với giai đoạn UCNT MSP+ Đặc điểm Tuổi T M N Tổng 44 RAASF1A n Tỷ lệ % DAPK n Tỷ lệ % BLU n Tỷ lệ % 45 45 46 CHƯƠNG DỰ KIẾN BÀN LUẬN Bàn luận kết thu được: - Nồng độ ADN, ARN mẫu bệnh phẩm bệnh nhân UTVMH - Mức độ methyl hoá gen EBV - Tỷ lệ phát gen ức chế ung thư mẫu sinh thiết bệnh nhân UTVMH - Mức độ methyl hoá gen ức chế ung thư xác định mẫu nghiên cứu - So sánh độ nhạy/ độ đặc hiệu phản ứng phát gen EBV, gen ức chế ung thư qua mẫu bệnh phẩm khác - Sự tương quan methyl hoá điều hoà biểu lộ gen - So sánh kết thu với nghiên cứu trước đó, gợi mở cho kiến nghị 46 47 DỰ KIẾN KẾT LUẬN Khả phát gen EBV, gen ức chế ung thư loại bệnh phẩm sử dụng Sự phát vê mức độ methyl hoá gen EBV gen ức chế ung thư bệnh nhân UTVMH Tìm mối tương quan mức độ methyl hoá gen điều hoà biểu lộ gen 47 48 DỰ KIẾN KIẾN NGHỊ Theo kết bàn luận 48 KẾ HOẠCH NGHIÊN CỨU 1.Tiến độ thực hiện: Đề tài tiến hành vòng 24 tháng (từ tháng 1/2016 đến tháng năm 2018), cụ thể sau: ST T Các nội dung, công việc thực Sản phẩm Thời gian Người thực Thông tin 1/2016 đến 3/2016 Chủ nhiệm đề tài cs Số liệu 1/2016 đến 12/2016 Chủ nhiệm đề tài cs Số liệu 1/2016 đến 12/2016 Chủ nhiệm đề tài cs Chủ nhiệm đề tài cs Thu thập mẫu nghiên cứu cho nội dung nghiên cứu Tách ADN toàn mẫu Thiết kế quy trình thí nghiệm Số liệu 1/2017 đến 3/2017 Thực kỹ thuật phân tích MMSP quy tình thí nghiệm Số liệu 4/2017 đến 12/2017 Nhập số liệu, xử lý số liệu Phần mềm quản lý, xử lý số liệu 1/2018 đến 3/2018 Chủ nhiệm đề tài cs Phân tích kết thu được, viết đề tài Báo cáo chuyên đề 4/2018 đến 8/2018 Chủ nhiệm đề tài cs 49 Thu thập tài liệu Tổng kết, nghiệm thu Báo cáo tổng kết 9/2018 đến 12/2018 Chủ nhiệm đề tài cs Tài chính: Dự kiến kinh phí thực đề tài 200 triệu đồng Trong đó: - Kinh phí từ đề tài cấp Bộ Y tế: 120 triệu đồng - Kinh phí Đại học Thái Nguyên dành cho nghiên cứu sinh: 60 triệu đồng - Kinh phí cá nhân người nghiên cứu: 20 triệu đồng - Cụ thể sau: STT I II III Khoản chi, nội dung chi Chi công lao động tham gia trực tiếp thực đề tài Chi công lao động cán khoa học, nhân viên kỹ thuật trực tiếp tham gia thực đề tài Chi công lao động khác phục vụ triển khai đề tài Chi mua xử lý mẫu nghiên cứu , Thực kỹ thuật Chí phí liên quan đến thu thập mẫu bệnh phẩm Hóa chất, dụng cụ, kít xét nghiệm phục vụ nghiên cứu Chi khác Văn phòng phẩm, in ấn, dịch tài liệu Chi khác liên quan trực tiếp đến đề tài Tổng cộng Thời gian thực Tổng kinh phí 50 50 40 40 10 10 140 Ghi 25% 140 70% 10 10 05% 6 4 200 200 100% 40 100 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 Nguồn kinh phí Kinh Các phí nguồn từ đề khác tài Altiok E., Minarovits J., Hu L.F et al (1992) "Hott- cell -phenotype-depdent control of thr BCR2/BWR1 promoter complex regulates the expression of Epstein - Barr viruss nuclear antigens 2-6 Proc Natl Acad Sci USA, 89, 905- 909 Trần Thị Chính cộng (2007) Định typ Epstein - Barr virus mô sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mũi họng kỹ thuật PCR Tạp chí nghiên cứu y học, 50(4), 12-16 Nguyễn Đức Thuận (2002) Nghiên Cứu Đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học hoạt tính gen virus Epstein - Barr ung thư vòm họng, Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y Trần Thị Hợp cộng (1999), Ung thư vòm mũi họng, Nhà xuất Y học, tr 97-101 Robertson E.S., Lin J., Kieff E et al (1996) The amino - terminal domains of Epstein - Barr virus nuclear proteins 3A, 3B, and C interact with RBPJ (kappa), J Virol, 70(5), 3068-3074 Simons M.J and Shanmugaratnam K (1982), The Biology of Nasopharyngeal Carcinoma UICC Technical Report Series: Geneva, International Union Against Cancer, 71, 46-54 Egger G et al(2004) Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy, Nature 429 (6990), 457-463 Zhe Zhang1 et al(2012) Epigenetics of Nasopharyngeal Carcinoma, Carcinogenesis, Diagnosis, and Molecular Targeted Treatment forNasopharyngeal Carcinoma, InTech, 1-12 Busson, P., et al (2013) Nasopharyngeal Carcinoma Advances in Experimental Medicine and Biology, ed XIX Vol 778 Springer Science 200-205 10 Zhang, Z et al (2012) Development of a non-invasive method, 51 multiplex methylation specific PCR (MMSP), for early diagnosis of nasopharyngeal carcinoma, PloS one 7, 45 - 90 11 Nguyễn Bá Đức, Nguyễn Văn Hiếu, cộng (2000), Chẩn đoán điều trị bệnh ung thư, Nhà xuất Y học, 100-112 12 Henegariu O., et al (1997) Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol, Biotechniques, 23, 504-511 13 Woisetschelaeger M (1991) Role for the Epstein - Barr virus nuclear antigen in viral promoter swiching during initial stages of infection Proc Natl Acad Sci USA, 88, 3942-3946 14 Nielsen, N H.et al (1977) Nasopharygeal cancerin Greenland The incidence in an Arctic Eskimo population, Acta Pathol Microbiol Scand A, 85, 850-858 15 Raab P R et al (1997) Epstein - Barr virus Nasopharygeal Carcinoma, Epstein - Barr virus Nasopharygeal Carcinoma., 14-23 16 Nguyễn Thị Bích Hà (1995), Nghiên cứu giá trị chẩn đoán tiên lượng ung thư vòm mũi họng kỹ thuật đặc hiệu IgA kháng VCA EA EBV tế bào diệt tự nhiên máu ngoại vi, Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y 17 Chang E.T.et al(2006) The Enigmatic epidemiology of nasopharygeal carcinoma,Cancer Epidemiol Biomarker Prev,15, 1765-1777 18 Furukawa M et al (1986) Epstein - Barr virus early antigen induction in nasopharygeal hybrid cells by Chinese medicinal herbs, Auris Nasus Larynx, 13, 101-105 19.Goldsmith D B et al (2002) HLA associations with nasopharygeal carcinoma in Southern Chinese: a meta- analysis, Clin Otolaryngol Allied Sci, 27, 61-67 52 20.Trần Ngọc Dung (2000) Nghiên cứu thông số miễn dịch - sinh học giúp tiên lượng, phát sớm tái phát UTVH kết hợp viên M sau xạ trị nhằm giảm tái phát, Luận án Tiến sĩ Y học, Trường đại học Y Hà Nội 21 Reddy S.P et al (1995) Prognostic significance of keratinization in nasopharyngeal carcinoma, Am J Otolaryngol, 16, 103-108 22 Simons M J et al (1982) The Biology of Nasopharyngeal Carcinoma, UICC Technical Report Series: Geneva, International Union Against Cancer 71, 46-54 23 Bedforrd M T., and and Richard S (2005) Arginine methylation an emerging regulator of protein function, Mol Cell, 18, 263-272 24 Fingeroth J D et al (1984) Epstein - Barr virus receptor of human B lymphocytes is Cd3 receptor CR2, Proc Natl Acad Sci USA 81, 45104514 25 Nguyễn Đình Phúc cộng (2006) Nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng gen EBV ung thư vòm mũi họng, Luận án Tiến sĩ Y học, Đại học Y Hà Nội 26 Li Q., Spriggs M.K et al (1997) Epstein - Barr virus uses HLA classII as a cofactor for infection of B lymphocytes, J Virol, 46574662 27 Roberson K.D et al (1995) Transcriptional activation of the Epstein - Barr virus latency C promotor after 5- azacytidin treament: evidence that demethyllation at a single CpG site is crucial, Mol Cell Biol, 15, 6150-6159 28 Hennessy K et al (1983) One of two Epstien - Barr virus nuclear angtigens contais a glycine - alanine, Proc Natl Acad Sci USA, 80, 5665-5669 53 29 Tao Q et al (1998) The Epstein-Barr virus major latent promoter Qp is constitutively active, hypomethylated, and methylation sensitive, J Virol, 72, 75-83 30 Miyamoto K and Ushijima T.(2005), Diagnostic and therapeutic applications of epigenetics, Jpn J Clin Oncol, 35(6), p 293-301 31 Hennessy K et al(1984) A membrane protein encoded by Epstein - Barr virus in latent growth - transforming in fection, Proc Natl Acad Sci USA, 81(22), 7202-7211 32 Furukawa M et al (1986) Epstein - Barr virus early antigen induction in nasopharygeal hybrid cells by Chinese medicinal herbs, Auris Nasus Larynx, 13(2), 101-105 33 Lasse S.K., and Lise L.H (2009) PCR- Based Methods for Detecting Single – Locus ADN Methylation Biomarkers in Cancer Diagnostics, Prognostics, and Response to Treatment, Clinical Chemistry, 55(8), 1471-1483 34 Miller We and Ehar T.N (1995) The Epstein - Barr virus latent membrane protein induces expression of the epidermal growth factor receptor, J Virol, 69, 4390-4398 35 Zhang Z et al (2012), Development of a non-invasive method, multiplex methylation specific PCR (MMSP), for early diagnosis of nasopharyngeal carcinoma PLoS One, 7(11), 845-908 36 Schulz, W (2005) Qualified promise: ADN methylation assays for the detection and classification of human cancers J Biomed Biotechnol 2005 (3):227-9 37 Balch C F et al (2009), Minireview: epigenetic changes in ovarian cancer, Endocrinology, 150 (9), 4003- 4011 54 38 Lo K.W et al (2001), High frequency of promoterhypermethylation of RASSF1A in nasopharyngeal carcinoma, Cancer Res, 61 (10), 3877-3881 39 Zhang Z et al (2007), Inactivation of RASSF2A by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma, Int J Cancer, 120 (1), 32-38 40 Boguski M S and McCormick M (1993), Proteins regulating Ras and its relatives Nature, 366 (6456), 643-654 41 Chang H W et al (2003) Evaluation of hypermethylated tumor suppressor genes as tumor markers in mouth and throat rinsing fluid, nasopharyngeal swab and peripheral blood of nasopharygeal carcinoma patient, Int J Cancer, 105 (6), 851-855 42 Kong W J.et al (2006) Effect of methylation-associated silencing of the death-associatedprotein kinase gene on nasopharyngeal carcinoma, Anticancer Drugs,17 (3), 251-259 43 Fendri., A et al(2009) Inactivation of RASSF1A, RARβ2 and DAPkinase by promoter methylation correlates with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma, Cancer Biology & Therapy, 8(5), 444-445 44 Qiu G H et al (2004), The candidate tumor suppressor gene BLU, located at the commonly deleted region 3p21.3, is an E2F-regulated, stress-responsive gene and inactivated by both epigenetic and genetic mechanisms in nasopharyngeal carcinoma, Oncogene 23, 4793-4806 45 Xiao-Qiong Liu et al (2003) Alterations of BLU, a candidate tumor suppressor gene on chromosome 3p21.3, in human nasopharyngeal carcinoma, International Journal of Cancer , 106, 60-65 55 56