Nghiên cứu chẩn đoán lâm sàng và gen virus epstein - barr trong ung thư vòm mũi họng
Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế trờng đại học y h nội nguyễn đình phúc nghiên cứu chẩn đoán lâm sng v gen virus epstein - barr trong ung th vòm mũi họng Chuyên ngnh : Tai mũi họng Mã số : 3.01.30 Tóm tắt luận án tiến sĩ y học H nội - 2006 Công trình đợc hoàn thành tại : bộ môn tai mũi họng - trờng đại học y h nội bệnh viện tai mũi họng trung ơng Viện công nghệ sinh học viện khoa học công nghệ việt nam Ngời hớng dẫn khoa học : PGS. TS. Phạm Khánh Hoà GS. TSKH. Đái Duy Ban Phản biện 1 : GS. TS. Trần Hữu Tuân Phản biện 2 : GS. TS. Lê Huy Chính Phản biện 3 : PGS. TS. Đinh Duy Kháng Luận án đã đợc bảo vệ trớc Hội đồng chấm luận án cấp Nh nớc tổ chức tại Trờng Đại học Y H Nội. Vo hồi: 14 giờ, ngy 29 tháng 12 năm 2006. Có thể tìm hiểu luận án tại : - Th viện Quốc gia - Th viện Thông tin Y học Trung ơng - Th viện Trờng Đại học Y H Nội. - Th viện Bệnh viện TMH Trung ơng. - Th viện Viện Công nghệ Sinh học (VKHCNVN) DANH MC CễNG TRèNH NGHIấN CU LIấN QUAN N LUN N 1. Nguyn ỡnh Phỳc v CS (2006), Mi quan h ca chng EBV (EB45VN) ca Vit Nam vi cỏc chng trong vựng v th gii, Tp chớ Y hc Vit Nam, Tp 326, s 9/2006, tr. 16-20. 2. Nguyn ỡnh Phỳc (2005), Identify the presentation of the EBV gene in nasopharyngeal cancer biopsy tissue by PCR, The 11 Asean ORL head neck surgery congress, p. 89. 3. Nguyn ỡnh Phỳc, ỏi Duy Ban (2001), Genetic engineering in the diagnosis of nasopharyngeal carcinoma, International workshop on biology Hanoi, Vietnam, tome 2. tr 342-345. 4. Nguyn ỡnh Phỳc, Phm Khỏnh Hũa (2001), Nghiờn cu nhng chn oỏn nhm ln v cm by lõm sng trong ung th vũm mi hng, Tuyn tp cụng trỡnh khoa hc NCS HYHN, tp 6A, NXB Y Hc, tr 6-9. 5. Nguyn ỡnh Phỳc, ỏi Duy Ban (2001), Phỏt hin s cú mt ca gen EBV trong mụ sinh thit ung th vũm hng bng phn ng tng hp chui, Tuyn tp cụng trỡnh khoa hc NCS HYHN, tp 6A, NXB Y Hc, tr. 10-14. 6. Nguyn ỡnh Phỳc (2000), Nhng du hiu gi ý sm trong ung th vũm mi hng, Ni san Tai Mi Hng, tr. 16-19. 7. Nguyn ỡnh Phỳc (2000), Nghiờn cu nhng chn oỏn nhm ln v cm by lõm sng trong ung th vũm mi hng, Hi ngh TMH Vit-Phỏp ln th 5, tr. 35. 8. Nguyn ỡnh Phỳc (2000), Phỏt hin s cú mt ca gen EBV trong mụ sinh thit ung th vũm hng bng phn ng tng hp chui, Hi ngh Vit Phỏp ln th 5, tr. 33-34. 9. Nguyn ỡnh Phỳc (1999), Nhn xột bc u v s cú mt ca gen virus EBV trong mụ sinh thit ung th vũm mi hng, Ni san Tai Mi Hng, s 2. tr. 62-64. 10. Nguyn ỡnh Phỳc (1993), Ung th vũm mi hng-Nhn xột lõm sng qua 410 bnh nhõn iu tr ti Vin Tai Mi Hng T, Tp chớ nghiờn cu Y hc HYHN, tr. 75-79. 1 Những chữ viết tắt trong luận án BL Burkitts lymphoma U lympho xơng hàm trên DNA Desoxy ribonucleic acid DNA DMCTNC Danh mục công trình nghiên cứu ĐHYHN Đại học Y Hà Nội EA Early antigen Kháng nguyên sớm EBER EB encoded latent infection membran protein regulator RNA RNA của EBV điều chỉnh protein màng gây nhiễm trùng tiềm tàng EBNA Epstein Barr virus nuclear antigen Kháng nguyên nhân EBV EBV Epstein Barr virus Virus Epstein Barr Gp Glycoprotein Glycoprotein GPB Giải phẫu bệnh HLA Humain leukocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu ngời HPV Human papilloma virus Virus gây u nhú ở ngời HSV Herpes simplex virus Virus herpes thông thờng IR Internal repeat Vùng lặp lại trong IM Infectious mononucleosis Bệnh tăng bạch cầu đơn nhân nhiễm trùng KBMKSH Ung th biểu mô không sừng hóa KBMSH Ung th biểu mô sừng hóa LCL Lymphoplastoid cell line Dòng tế bào lympho nhiễm trùng muộn LM Lymphomalin Bệnh hạch ác tính LMP Latent membral protein Protein màng tiềm tàng MBH Mô bệnh học PCR Polymerase chain reaction Phản ứng tổng hợp chuỗi RLTHN Rối loạn tuần hoàn não RNA Ribonucleic acid Ribonucleic acid TNMS Tumor, Node, Metastasis, Stade Khối u, hạch, di căn xa, giai đoạn US Unique courte Vùng ngắn đơn độc UL Unique long Vùng dài đơn độc UCNT Undifferentiated carcinoma nasopharyngeal type Ung th biểu mô không biệt hóa vòm mũi họng UTBM Ung th biểu mô UTVMH Ung th biểu mô vòm mũi họng VADS Voie aero-digestif superieure Đờng tiêu hóa và hô hấp trên VCA Viral capsid antigen Kháng nguyên vỏ capsid VTGTD Viêm tai giữa thanh dịch VTG-XC Viêm tai giữa xơng chũm VTXCMTHV Viêm tai xơng chũm mạn tính hồi viêm T VN Ung th vũm mi hng l mt khi u ỏc tớnh xut phỏt t lp biu mụ ph ca vựng vũm mi hng (NPC), c xp vo khi u ca ng tiờu hoỏ v hụ hp trờn (VADS), l mt trong 5 loi ung th ph bin nht ngi Vit Nam v l loi hay gp nht trong vựng tai mi hng. Trờn th gii, ung th vũm hay gp cỏc nc vựng 2 ụng nam v phớa Nam Trung Quc [32] [34] [38] [41] [44] [192] [198] [206] [226]. Cỏc bnh nhõn thng n khỏm v c chn oỏn giai on mun ca bnh, lm hn ch kt qu iu tr v nh hng xu n tiờn lng. Qua nghiờn cu ca cỏc tỏc gi trong v ngoi nc, ó phỏt hin c hng trm chui nucleotid v mt s h gen hon chnh ca EBV trong cỏc mụ sinh thit ung th vũm mi hng thuc cỏc type EB (WT), EB (B95-8), EB (RAJI), EB (GD1), EB (CN) Cỏc chng virus ny cú phõn b khỏc nhau theo cỏc vựng trờn th gii. Chỳng cú c tớnh v c tớnh gõy bnh khỏc nhau. Vit Nam, cho n nay ó xỏc nh c chng EBV ging chng ca chõu u B95-8 [49][50]. gúp phn tỡm hiu thờm nhng c im lõm sng, s cú mt ca EBV trong t chc ung th vũm mi hng v nh loi virus Epstein Barr gõy bnh trờn ngi Vit Nam, chỳng tụi tin hnh lun ỏn Nghiờn cu chn oỏn lõm sng v gen virus Epstein Barr trong ung th vũm mi hng : Mc tiờu nghiờn cu: 1. Nghiờn cu v cỏc triu chng, hỡnh thỏi tn thng thc th, cỏc chn oỏn nhm v cm by lõm sng nhm rỳt kinh nghim cho chn oỏn. 2. Phỏt hin s cú mt ca gen EBV trong cỏc mụ sinh thit, gii trỡnh trỡnh t gien, tỡm hiu thờm nhng chng type EBV trờn bnh nhõn ung th vũm mi hng min Bc Vit Nam. 3. i chiu kt qu: chn oỏn lõm sng, chn oỏn mụ bnh hc v chn oỏn gen EBV. T nhng lun chng khoa hc trờn a ra nhng ngh v chn oỏn sm v nhng phi hp nghiờn cu trong ung th vũm mi hng. NHNG ểNG GểP MI CA LUN N 1. ó phỏt hin c chng EBV (EB45VN) ln u tiờn bnh nhõn UTVMH min Bc Vit Nam, s ng ký Ngõn hng gen DQ516382 (ng nht vi chng GD1-Nam Trung QucNgõn hng gen AY961628). 2. ó phỏt hin c trong 8 mu ung th biu mụ tuyn vỳ cú EBV (PCR(+)) vi cp mi EBK1F EBK2R. 3. Du hiu nut vng trong hch di cn khong bờn hng cng cú th coi l mt gi ý sm nh hng chn oỏn lõm sng trong UTVMH. 3 Cn khỏm kim tra vũm hng, theo dừi nh k cho cỏc trng hp VTGTD, lit thn kinh s, au u kộo di, ri lon tun hon nóo v khi u khong bờn hng chn oỏn sm, hoc loi tr UTVMH. ó a ra c mt s nhn nh v chn oỏn lõm sng, i chiu chn oỏn gen EBV vi MBH v lõm sng. úng gúp vo chn oỏn sm v hiu bi t tin b hn v UTVMH. Cấu trúc luận án: Luận án gồm 152 trang, với 50 bảng, 17 biểu đồ, 12 hình, 2 sơ đồ, 16 ảnh minh hoạ. Có 250 ti liệu tham khảo gồm: 76 ti liệu tiếng Việt, 174 ti liệu tiếng nớc ngoi. Ngoi phần đặt vấn đề 2 trang; kết luận v kiến nghị 3 trang, đóng góp mới của luận án 1 trang; luận án gồm 4 chơng: Chơng 1- Tổng quan 34 trang; Chơng 2- Đối tợng v phơng pháp nghiên cứu 20 trang; Chơng 3-Kết qủa nghiên cứu 45 trang; Chơng 4- Bn luận 47 trang. Chơng 1. Tổng Quan 1.1. Lịch sử nghiên cứu về ung th vòm mũi họng 1.1.1. Trờn th gii : UTVMH cú t hn 300 nm trc cụng nguyờn, kho c cho thy tn thng bo mũn xng ỏy s cỏc xỏc p ca ngi Ai Cp, tn thng ú cú liờn quan n khi u ỏy s. Khi u ca ngi Qung ụng (Kwang Tung Tumor), Oscart Thomson (1923) ó lý gii l liờn quan n UTVMH. Nm 1964 Epstein Barr tỡm ra virus trong B.L., vo nm 1966 Old phỏt hin ra s liờn quan ca virus Epstein Barr vi ung th vũm, t ú cú nhiu nghiờn cu v lnh vc ny. Vo nm 1980, k thut sinh hc phõn t v phn ng tng hp chui (PCR) ra i. K t ú cú nhiu cụng trỡnh nghiờn cu phỏt hin s cú mt ca gen EBV trong t chc u, trong hch c, trong mỏu v trong huyt thanh ca bnh nhõn UTVMH : Muray (2001), Zeng (2005), Zhong (2006) 1.1.2. Vit Nam : Nghiờn cu v ging dy v UTVMH, ngi khi xng l Trn Hu Tc, Phm Thy Liờn, ng Hiu Trng, Vừ Tn. ó xu t hin s hp tỏc nghiờn cu Vit Phỏp : hi ngh 12/1983. Phan Th Phi Phi, ỏi Duy Ban, Trng Nam Hi, Phm Thỳy Hng v CS ó phỏt hin c gen ca virus Epstein Barr trong mụ sinh thit khi u vũm hng, ó m ra nhiu trin vng mi nghiờn cu v UTVMH. 4 1.2. Giải phẫu ứng dụng trong UTVMH Hng mi nm ngay di ỏy s, hon ton thụng khớ vi hc mi qua ca mi sau. Cú cỏc thnh trc, trờn sau, bờn, di. Bch mch : Cỏc nhúm hch hay gp: Cnh trong, gai, di hm, hch sau hng bờn, c ngang. Liờn quan gii phu ca hng mi : Mi xoang, t sng c, ỏy s, khong bờn hm hng, hng ming. 1.3. Biểu mô phủ vùng vòm mũi họng : Biu mụ hụ hp cú lụng chuyn cũn gi l bi u mụ tr cú t, biu mụ Malpighi, biu mụ trung gian (chuyn tip). 1.4. Dịch tễ học của UTVMH : Cú 3 vựng mc khỏc bit nhau trờn th gii, vựng ụng Nam chõu cú tn s mc cao nht. Tui tng dn t 20 tui v t nh cao 40-50 tui. [19][32][38][41][70]. Nam gp 2-3 ln n. Cỏc gi thuyt nguyờn nhõn ca UTVMH : ó cú nhiu cụng trỡnh nghiờn cu v EBV, nú c coi nh l virus gõy ra ung th u tiờn loi ngi [182][183][184][185][195] [203]. 1.5. Virus Epstein Barr và UTVMH EBV thuc loi virus DNA vi 2 si xo n, cú khong 172 KB. Hai chui DNA c cha ng trong mt v capsid. H gen ca EBV cú 6 t hp gen mó hoỏ cho cỏc loi protein khỏng nguyờn: Khỏng nguyờn nhõn, ký hiu l EBNA: (EBNA-1, EBNA-2, EBNA- 3A, EBNA-3B, EBNA-3C v EBNA-LP) v 3 gen mó hoỏ cho protein mng (LMP-1, LMP-2A v LMP-2B) (Muray v cs, 2001) [168]. Sỏu protein EBNA cú liờn quan n vai trũ xõm nhp v nhõn lờn ca virus trong t bo Lympho B giai on u, cũn 3 loi protein LMP liờn quan n chu k EBV trong dũng t bo Lympho B ó chuyn i t dng ngh sang dng thng trc - nhng dũng t bo mm gõy nhim trựng mun (LCL). Trong dũng t bo LCL, EBNA c sao chộp trong mt ARN thụng tin n nht v tng h p thnh mt protein chung, sau ú c phõn ct thnh cỏc EBNA thnh phn c lp (Hỡnh 1.4). 1.6. Bệnh học lâm sàng của UTVMH Hi bnh v khai thỏc bnh s : Chỳ ý dch t hc lõm sng. Cỏc du hiu gi ý sm : au u, ngt mi, Xỡ mỏu mi v kht khc mỏu, ự tai, nghe kộm, hch c to. 5 Chẩn đoán hình ảnh : Tư thế Hirtz, sọ nghiêng, C.T Scanner, MRI. Chẩn đoán mô bệnh học : Theo phân loại của WHO (1978) [38][56][66][72][104][113][114][202]: Type I (KBMSH), type II (KBMKSH), type III (UCNT). Chẩn đoán miễn dịch học : IgA/VCA (kháng nguyên vỏ), IgG/EA (kháng nguyên sớm), IgG/EBNA (kháng nguyên nhân). Chẩn đoán giai đoạn (UICC 2002) [202] Chẩn đoán phân biệt : U đáy sọ, lao hạch, lác mắt Chẩn đoán nhầm lẫn và những cạm bẫy lâm sàng của UTVMH: Với ung thư sàng hàm, VTGTD, u não, lác mắt, lao hạch. Điều trị : Tia xạ, hoá chất, miễn dịch, phẫu thuật Tiên lượng : Nếu phát hiện sớm, có tiên lượng tốt. Phòng bệnh : Phát hiện sớm UTVMH, phòng bệnh và chăm sóc sức khoẻ ban đầu. Ch−¬ng 2. §èi t−îng vμ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.1. §èi t−îng nghiªn cøu 2.1.1. Số lượng bệnh nhân Mục tiêu 1: Bao gồm 200 bệnh nhân được khám lâm sàng và khẳng định chẩn đoán bằng mô bệnh học là ung thư vòm mũi họng (Phụ lục 1). Mục tiêu 2: Bước 1: Bao gồm 91 bệnh nhân có chẩn đoán lâm sàng và mô bệnh học là UTVMH, được lựa chọn ngẫu nhiên trong số 200 bệnh nhân nói trên để nghiên cứu phát hiện gen của EBV trong mô sinh thiết vòm với cặp mồi TH 1 và TH 2 (Phụ lục 2). Bước 2: Chọn ngẫu nhiêu 40 bệnh nhân trong số 91 đối tượng của bước 1 để nghiên cứu cấu trúc gen và tìm hiểu chủng, type EBV với các cặp mồi EBK1F, EBK2R và EBV1F, EBV3F, EBV2R và EBV4R (Phụ lục 3). Mục tiêu 3 : Đối chiếu các hình thái tổn thương và các dấu hiệu gợi ý sớm (200 bệnh nhân), đối chiếu với chẩn đoán mô bệnh học và lâm sàng (91 bệnh nhân). 2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân : B ệnh nhân phải có chẩn đoán lâm sàng và mô bệnh học phù hợp là UTVMH. 6 2.1.3. Tiêu chuẩn loại trừ bệnh nhân : Mô bệnh học âm tính, không thực hiện nghiên cứu theo dõi dọc. 2.2. Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu 2.2.1. Cỡ mẫu : Chọn cỡ mẫu không xác suất, loại mẫu mục đích (không có yêu cầu tính cỡ mẫu) 2.2.2. Biến số nghiên cứu : Chọn biến số nghiên cứu là các biến định lượng, định tính, mô tả mối quan hệ nhân quả của các biến độc lập và ph ụ thuộc. 2.2.3. Phương pháp tiến hành nghiên cứu 2.2.3.1. Chẩn đoán lâm sàng : Sử dụng phương pháp nghiên cứu ngang, mô tả lâm sàng. 2.2.3.2. Nghiên cứu chẩn đoán gen EBV : Sử dụng phương pháp nghiên cứu ngang, mô tả kết quả thực nghiệm để tìm căn nguyên, a. Chất liệu nghiên cứu: Mô tổ chức ung thư vòm, dùng để chẩn đoán mô bệnh học, nghiên cứu gen. b. Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu và hoá ch ất : Của Viện Công nghệ sinh học, của hãng QIAGEN (Mỹ), Invitogen, Genset, Sigma (Mỹ). 2.2.4. Qui trình thực hiện nghiên cứu gen EBV 2.2.4.1. Tách chiết DNA tổng số 2.2.4.2. Phát hiện sự có mặt của gen EBV bằng cặp mồi TH 1 và TH 2 2.2.4.3.Phản ứng PCR với cặp mồi EBK1F và EBK2R, giải trình trình tự gen Bảng 2.2. Cặp mồi của phản ứng PCR phát hiện gen EBV Tên mồi Chuỗi mồi (20 base) Kết hợp cặp mồi Độ dài sản phẩm PCR TH 1 5’ – AGCCAATTGTCAGTTCTAGGGAGGG – 3’ Tm = 77,5 o C TH 2 5’ – GCTTGGATGGCGGAGTCAGCGACGG – 3’ Tm = 83,3 o C TH 1 / TH 2 240bp EBK1F 5’-GTCATCATCATCCGGGTCTC - 3’ Tm = 56 o C EBK2R 5’-TTCGGGTTGGAACCTCCTTG - 3’ Tm = 56 o C EBK1F - EBK2R 270 bp EBV1F 5’-ATCGTGGTCAAGGAGGTTCC - 3’ Tm = 56 o C EBV2R 5’-ACTCAATGGTGTAAGACGAC - 3’ Tm = 56 o C EBV3F 5’-AAGGAGGGTGGTTTGGAAAG - 3’ Tm = 56 o C EBV4R 5’-AGACAATGCACTCCCTTAGC - 3’ Tm = 56 o C EBV1F/EBV3F - EBV4R/EBV2R (PCR lång) 209 bp 7 Mụ hỡnh nghiờn cu chn oỏn gen virus Epstein - Barr Chu trỡnh nhit ca phn ng PCR vi cp mi EBK1F-EBK2R v mi lng : 1 chu k (95 o C- 3 phỳt), 40 chu k (94 o C 1 phỳt, 56 o C 50 giõy, 72 o C 3 phỳt), 1 chu k (72 o C 7 phỳt), Tinh sch sn phm PCR, ghộp- ni sn phm PCR vo vector tỏch dũng, chuyn np, nuụi cy vi khun tỏi t hp, tỏch chit cỏc plasmid tỏi t hp, ct kim tra bng enzym EcoRI. Bệnh nhân UTVMH (Bệnh viện TMH) Mô ung th Tách chiết DNA Phản ứng PCR Cặp mồi TH 1 và TH 2 Bảo quản cho nghiên cứu sau ny Chẩn đoán MBH Sinh thiết - Đo quang phổ - Điện di trên thạch Agarose Bớc 1 Bớc 2 Chẩn đoán lâm sng - Lm BA theo mẫu nghiên cứu - Lm các xét nghiệm cơ bản Phản ứng PCR, giải trình trình tự gen Cặp mồi EBK1F EBK2R Truy cập Ngân hàng gen Phân tích, so sánh kết quả, tìm hiểu chủng, type EBV Xây dựng phơng pháp PCR đối với EBV Mẫu bệnh phẩm UTVMH Mẫu bệnh phẩm khả nghi UTVMH ứng dụng PCR phát hiện EBV sng lọc mẫu bệnh phẩm khác Mẫu bệnh phẩm UTBM vú 8 Gii trỡnh trỡnh t v x lý s liu. Ngõn hng Gen [GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) ]. 2.2.5. Chn oỏn MBH : WHO (1978) 2.2.6. Chn oỏn TNM v giai on S S dng phõn loi TNM theo WHO 2002 [202]. 2.3. Địa điểm thực hiện nghiên cứu Khoa Ung bu BV. Tai Mi Hng TW. B mụn Gii phu bnh Trng HYHN, Khoa Gii phu bnh Bnh vin K v BV. Tai Mi Hng T.Phũng Min dch hc v phũng K thut di truyn, Vin Cụng ngh Sinh hc, Vin Khoa hc v Cụng ngh Vit Nam. Qun lý khoa hc: Trng i hc Y H Ni. 2.4. Xử lý số liệu S dng chng trỡnh phn mm EPI Info 6.0. S dng thut toỏn so sỏnh hai t l theo cụng thc kim nh 2 v cụng thc so sỏnh theo test T student. S dng cụng thc tớnh khong c lng t l CI (95%)= [ ]. Trong ú: = T l xut hin ca hin tng nghiờn cu. = Sai s ca c lng = (1 ) (/2)t n Chơng 3. Kết quả nghiên cứu 3.1. Dịch tễ học đại cơng của UTVMH 3.1.1. Phân bố theo giới : nam gấp ba lần ở nữ giới. 3.1.2. Phân bố theo tuổi : 40-69 (79%), hay mắc nhất 48-52 (CI =95%). 3.1.3. Phân loại theo dân tộc : Kinh (95%, dân tộc (5%). 3.1.4. Phân bố theo địa d : Gặp ở 23 tỉnh thnh của miền Bắc. 3.2. Chẩn đoán mô bệnh học và lâm sàng UTVMH 3.2.1. Chẩn đoán MBH : UCNT (92,5%), KBMKSH (6%), KBMSH (1,5%) 3.2.2. Chẩn đoán khối u (T) 3.2.2.1. Các dấu hiệu mợn khi thăm khám : Đau đầu (91%), ù tai (84%), ngạt mũi (75%), hạch cổ di căn (71%), nghe kém (70%), xì 9 máu (66%), khịt máu (63%), VTGTD (11%), khít hm (4%), nuốt vớng (3%), trên 50% bệnh nhân đến khám có nhiều dấu hiệu mợn. 3.2.2.2. Vị trí xuất phát của tổn thơng Bảng 3.7. Vị trí xuất phát của tổn thơng Vị trí n % CI p Thành trên sau 98 49 [4,9 56,1] p1, p2>0,05 Rosenmuler 85 42,5 [35,6 49,7] Vựng loa vũi 15 7,5 [4,4 12,3] p2< 0,001 Thành dới 2 1 [0,2 3,9] Tổng 200 100 Thnh trên sau 49%, thnh bên 50%. 3.2.2.3. Hình thái tổn thơng thực thể Bảng 3.8. Hình thái tổn thơng thực thể Thể n=200 % p CI Sùi 172 86 [80,2 90,3] Thâm nhiễm 25 12,5 p<0,01 [8,4 18,1] U nhẵn, to (xơ hóa) 2 1 [0,2 3,9] U nhẵn đỏ (u máu) 1 0,5 Loét, hoại tử đi kèm 62 31 Thể sùi nhiều hơn thể thâm nhiễm (p < 0,01). 3.2.2.4. Phân loại tổn thơng khu trú tại vòm và lan ra ngoài vòm họng Khối u khu trú tại vòm 31,5%, lan ra ngoi vòm 68,5% (p < 0,01). Bảng 3.10. Lan tràn ra ngoài vòm họng Hớng lan n=200 100% CI p Đáy sọ 79 39,50 [32,7 46,7] Mũi xoang 50 25,00 [19,3 31,7] < 0,05 Họng miệng 10 5,00 [2,6 9,3] Hố CBH 8 4,00 [1,9 8,0] Tai giữa 2 1,00 [0,2 3,9] ổ mắt 2 1,00 [0,2 3,9] Đốt sống cổ 0 0,00 Lan lên đáy sọ nhiều hơn mũi xoang (p < 0,05). 10 3.2.2.5. Tổn thơng thần kinh sọ não Có 39,5% liệt dây thần kinh sọ khi thăm khám lần đầu tiên : dây V, dây VI, nhóm vận nhãn, lỗ rách sau. Có thể gặp dây II, VII, VIII. 3.2.2.6. Chẩn đoán khối u (T) Bảng 3.14. Chẩn đoán khối u (T) T T 1 T 2 T 3 T 4 Tổng n 30 33 26 111 200 % 15 16,5 13 55,5 100% CI [10,5 20,9] [11,8 22,5] [8,8 16,6] [48,3 62,5] p p1> 0,05 p1, p2< 0,05 Bệnh nhân đến khám ở giai đoạn muộn T 3 (13%), T 4 (55,5%). 3.2.3. Chẩn đoán hạch cổ di căn (N) Bảng 3.15. Chẩn đoán hạch cổ di căn (N) N N 0 N 1 N 2 N 3 Tổng n 58 37 8 97 200 % 29 18,5 4 48,5 100% CI [22,9 35,5] [13,5 24,7] [1,9 8,0] [41,5 55,6] p < 0,001 N 0 (29%), N(+) 71% : N 3 48,5%. Hạch Kutner gặp nhiều nhất (77,46%), nhiều dãy v hai bên (14,08%), gặp cả hạch di căn ở khoảng bên họng (4,23%). 3.2.4. Di căn xa (M) và chẩn đoán giai đoạn (S) Bảng 3.18. Chẩn đoán giai đoạn (S) S S I S II S III S IV Tổng n 9 30 20 141 200 % 4,5 15 10 71,5 100% p p1>0,05 p1, p2<0,001 Di căn xa trớc điều trị 1,5%. S IV chiếm 71,5%. 11 3.2.5. Chẩn đoán nhầm và cạm bẫy lâm sàng Bảng 3.19. Chẩn đoán nhầm trong UTVMH Chẩn đoán nhầm l n=84 100% CI p Bệnh lý mũi xoang 36 42,8 [34,8 55,9] Bệnh lý tai xơng chũm 20 23,8 [15,6 33,8] < 0,001 Rối loạn THN 7 8,3 [3,7 15,8] U khoảng bên họng 6 7,1 [2,9 14,2] Hạch 5 6,0 [2,2 12,7] Lao hạch 2 2,4 [0,4 7,6] Viêm hạch 2 2,4 [0,4 7,6] Lymphomalin hạch cổ 1 Mắt 5 6,0 [2,2 12,7] U đỉnh hố mắt 2 [0,4 7,6] Bệnh cơ trực (lác) 3 3,6 [0,9 9,4] U não 2 2,4 [0,4 7,6] Họng miệng 3 3,6 [0,9 9,4] U màn hầu 1 Cắt amidan 1 Nạo VA 1 > 0,05 Chẩn đoán nhầm 42%. Các dấu hiệu dễ bị nhầm lẫn đợc coi l cạm bẫy lâm sng chính l các dấu hiệu mợn của mũi xoang, tai xơng chũm, VTGTD, hạch khoảng bên họng, liệt thần kinh sọ, thiếu kinh nghiệm, phản xạ định hớng, UTVMH. 3.3. Kết quả chẩn đoán gen EBV 3.3.1. Kết quả tách chiết DNA tổng số : Gồm 91 mẫu. 3.3.2. Phát hiện gen EBV bằng phản ứng PCR với cặp mồi TH 1 và TH 2 Kết quả chẩn đoán gen EBV với cặp mồi TH 1 v TH 2 Bảng 3.26. Kết quả phản ứng PCR với cặp mồi TH 1 / TH 2 8 n % CI p PCR(+) 87 95,60 [89,7 98,6] PCR(-) 4 4,40 [1,4 10,3] p<0,001 Tổng 91 100% Phản ứng trùng hợp dơng giữa lâm sng, MBH, gen EBV l 95,6%. 12 3.3.3. Tìm hiểu chủng type EBV trong UTVMH ở miền Bắc Việt Nam 3.3.3.1. Kết quả chẩn đoán gen EBV với các cặp mồi đặc hiệu của gen EBNA-1 (EBK1F - EBK2R) : Thực hiện phản ứng PCR thnh công với cả cặp mồi đơn (270bp) v cặp mồi lồng (209 bp). 3.3.3.2. Kết quả tách dòng sản phẩm PCR Thực hiện tách dòng thnh công với cả 2 sản phẩm PCR của cặp mồi đơn v cặp mồi lồng. ảnh 3.10: Điện di sản phẩm PCR trên thạch agarose 0,8%. ảnh 3.11. Điện di sản phẩm tách dòng trên thạch agarose 1,0%. Hình 3.1. : Giải trình trình tự plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen EB45 3.3.3.3. Đoạn gen EBNA-1 của chủng EB45, EB39 và kết quả truy cập Ngân hàng gen Đoạn gen EBNA-1 gồm 270bp, dòng trên l nucleotid, dòng dới kí hiệu của acid amin, mồi xuôi đóng khung ở biên trên, mồi ngợc đóng ở biên dới của chuỗi gen. M123456(-) 2,3kb 2,0kb 564bp 270bp 209bp M123456(-) 2,3kb 2,0kb 564bp 270bp 209bp M1234567 2,3kb 2,0kb 564bp 270bp 209bp M1234567 2,3kb 2,0kb 564bp 270bp 209bp EcoRI pCR 2.1- TOPO EBNA-1(EB45) Chuỗi nucleotid của chủng EB45 13 Hình 3.2. Trình tự nucleotid và thành phần acid amin của đoạn gen EBNA-1 (270 bp) thu nhận từ chủng EB45 Hình 3.3 : Kết quả truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi nucleotid của đoạn gen EBNA-1 đợc giải trình trình tự từ mẫu bệnh phẩm EB45 Chủng EB45VN tơng đồng cao với GD1 Nam Trung Quốc có hệ số 535, gía trị 2E-149. 3.3.3.4. Phát hiện chủng EBV (EB45VN) lần đầu tiên ở bệnh nhân UTVMH miền Bắc Việt Nam Bệnh nhân N.T. T. ở Nghệ An, nữ, 48 tuổi, đến khám tại Khoa khối u, Bệnh viện Tai Mũi Họng TW ngy 12/11/1999. Đợc chẩn đoán l UTVMH giai đoạn T 1 N 3 M 0 S IV , mang bệnh án số NT 39. Chẩn đoán mô bệnh học l UCNT (tiêu bản KV22-PGS. Lê Đình Roanh). Truy cập chuỗi EB45 Số đăng ký Ngân hng Gen Tên loại virus có kết quả tơng đồng Hồ sơ Giá trị 14 Hạch đồ có di căn của ung th biểu mô. Mô bệnh phẩm đó đợc tách chiết DNA v cho phản ứng PCR(+) với cặp mồi TH 1 /TH 2 , với cặp mồi EBK1F/EBK2R cũng cho kết quả (+) - Số khuôn DNA : EB45, thử phản ứng PCR với cặp mồi lồng EBV1F, EBV3F-EBV2R, EBV4R cũng cho kết quả (+). Tách dòng sản phẩm PCR với vector pCR 2.1- TOPO (Invitrogen Inc.) của khuẩn E.coli, giải trình trình tự gen của mẫu EB45 ny v so sánh đối chiếu với các chủng EBV hiện có trong Ngân hng gen NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) : đã cho thấy có thnh phần gen đồng nhất cao với các chủng EBV khác trên thế giới, đặc biệt đồng nhất với chủng GD1 của Nam Trung Quốc. Trớc đây ở Việt Nam mới chỉ phát hiện v công bố chủng EBV giống với chủng EBV (B95-8) của châu Âu (nh chủng EB39). Còn chủng EB45 chúng tôi mới phát hiện đợc thì có thnh phần gen đồng nhất với chủng GD1. Chủng EB45-VN đã đợc đăng ký tại Ngân hng gen với bản quyền xác nhận số hiệu DQ516382 ngy 28 tháng 04 năm 2006 (Phụ lục 3B). 3.3.4. Kết quả sàng lọc các mẫu UTVMH bằng sinh học phân tử 3.3.4.1. Sàng lọc 37 mẫu UTVMH bằng phản ứng PCR với cặp mồi EBK1F-EBK2R : PCR(+) 100%. 3.3.4.2. Phát hiện sự có mặt của EBV trong 6 tổn thơng nghi ngờ UTVMH (Dysplasie) với cặp mồi EBK1F-EBK2R Với 6 bệnh nhân có nghi ngờ l dị sản biểu mô vòm qua thăm khám lâm sng v chẩn đoán mô bệnh học l dysplasie (đã sinh thiết 3 lần). Cả 6 trờng hợp ny đều cho phản ứng PCR (+) : gồm số PCR 8,13 (bản gen A); 17 (bản gen B); 30 (bản gen C) ảnh Phụ lục 4 v 36, 42 (bản gen D ảnh 3.12). ảnh 3.12. Điện di sản phẩm PCR với cặp mồi EBK1F, EBK2R Số PCR 36, 42 của hai mô sinh thiết vòm nghi ngờ UTVMH (dị sản); Số PCR BK8 và 25 của ung th biểu mô vú; Số PCR còn lại của mô UTVMH M ( - ) ( +1 BK BK2 3 3 3 M 3 3 4 4 4 4 4 270 564 270 564 M ( - ) ( +1 BK BK2 3 3 3 M 3 3 4 4 4 4 4 M ( - ) ( +1 BK BK2 3 3 3 M 3 3 4 4 4 4 4 270 564 564 270 564 564 D 15 3.3.4.3. Phát hiện sự có mặt của EBV trong 8 mẫu ung th biểu mô vú với cặp mồi EBK1F-EBK2R : 8/8 có PCR (+). 3.4. Đối chiếu chẩn đoán lâm sàng, MBH và gen EBV 3.4.1. Đối chiếu chẩn đoán lâm sàng Bảng 3.31. Đối chiếu hình thái tổn thơng với các dấu hiệu lâm sàng Thâm nhiễm Sùi n 25 % CI n 172 % CI p UCNT 23 92 [76,0-98,6] 159 92,4 [87,7-95,7] p>0,05 II 1 4 [0,2-18,2] 11 6.4 [3,4-10,8] p>0,05 MBH I 1 4 [0,2-18,2] 1 Hạch cổ to 10 40 [22,4-59,8] 25 14,5 [9,8-20,4] p<0,01 Đau đầu 8 32 [16,1-51,7] 68 39,5 [32,4-47,0] p>0,05 Về tai 5 20 [7,7-38,9] 35 20,3 [14,8-26,8] p>0,05 Dấu hiệu gợi ý sớm Về mũi 2 8 [1,4-24,0] 44 25,6 [19.5-32,5] p>0,05 Trên sau 21 84 [65,8-94,7] 77 44,8 [37,5-52,2] p<0,001 Thành bên 4 16 [5,3-34,2] 93 54,1 [46,6-61,4] p<0,001 Vị trí xuất phát tổn thơng Thành dới 0 0 2 1,2 [0,2-3,8] Đáy sọ 11 44 [25,7-63,6] 68 39,5 [32,4-47,0] p>0,05 Mũi xoang 0 0 48 27,9 [21,6-34,9] Họng miệng 0 0 9 5,2 [2,6-9,4] Hố CBH 0 0 8 4,7 [2,2-8,6] Tai giữa 0 0 2 1,2 [0,2-3,8] Lan trn ổ mắt 0 0 2 1,2 [0,2-3,8] Di căn xa M 1 0 0 3 1.8 [0,7-4,2] Hạch cổ di căn sớm ở thể thâm nhiễm nhiều hơn thể sùi. Dấu hiệu mợn mũi v tai phối hợp với đau đầu. Thể thâm nhiễm xuất phát ở thnh trên sau, lan lên đáy sọ. Thể sùi xuất phát ở thnh bên nhiều hơn thnh trên sau, lan ra ngoi vòm sớm, rộng (mũi xoang, đáy sọ, họng miệng). Di căn xa ở thể sùi gặp ngay từ lần thăm khám đầu tiên. 16 3.4.2. Đối chiếu chẩn đoán gen EBV với MBHvà lâm sàng Bảng 3.39. Đối chiếu chẩn đoán gen EBV với MBH và lâm sàng Chẩn đoán dấu hiệu PCR(-) PCR(+) Phân loại n=4 % n=87 % Tổng số UCNT 3 82 94,2 85 II 1 4 4,6 5 MBH I 0 1 1,1 1 Thnh sau trên 2 58 66,7 60 Vị trí xuất phát Thnh bên 2 29 33,3 31 Sùi 4 78 89,6 82 Hình thái tổn thơng Thâm nhiễm 0 9 10,4 9 Đáy sọ 2 32 36,8 34 Mũi xoang 6 6.9 6 Hố CBH 5 5,7 5 Lan trn Họng miệng 1 1,1 1 1 1 13 14.94 14 2 1 14 16,16 15 3 0 9 10,30 9 T 4 2 51 58,60 53 Có 2 61 70,1 63 Hạch cổ to (N) Không 2 26 29,9 28 Di căn xa (M) M 1 1 1,1 1 I 1 4 4,6 5 I 1 12 13,8 13 III 0 3 3,4 3 S IV 2 68 78,2 70 PCR (+) ở cả 3 thể MBH, ở cả 9/9 thể thâm nhiễm. PCR (+) nhiều ở thể UCNT, T 4 , S IV , ở hạch cổ to, lan trn đáy sọ. PCR (-) gặp ở 4/4 thể sùi. Có 6/6 biểu mô vòm dị sản có PCR (+), điều đó giúp cho sự phối hợp giữa lâm sng, MBH, gen EBV để theo dõi định kỳ, chẩn đoán sớm UTVMH. [...]... 4,4% 2.2 ó phỏt hin c chng EB39 ging vi nhúm I ca th gii v chõu u (B9 5-8 ) Chng EB45VN mi c phỏt hin hon ton ng nht vi chng GD1 ca Nam Trung Quc 37 mu sng lc, 3 mu thc hin tỏch dũng gii trỡnh trỡnh t v 6 mu niờm mc vũm d sn u cho kt qu PCR(+) ó phỏt hin s cú mt ca EBV trong 8 mu ung th biu mụ vỳ 2 3 3 Đối chiếu chẩn đoán lâm sàng, MBH và gen EBV 3.1 i chiu chn oỏn lõm sng Cỏc du hiu gi ý sm : gp nhiu l... chng EBV khỏc qua chng trỡnh tin sinh hc Chng EB45VN ó c ng ký ti Ngõn hng gen vi s DQ516382 ngy 28/04/2006 (Ph lc 3B) 21 22 Sng lc cỏc mu UTVMH bng sinh hc phõn t Qua sng lc 37 mu NPC tip theo u cho kt qu PCR (+) vi cp mi EBK1F/EBK2R Phỏt hin trong 8 mu UTBM tuyn vỳ cú DNA EBV (PCR(+)) 4.4 Đối chiếu chẩn đoán lâm sàng, MBH và gen EBV 4.4.1 i chiu chn oỏn lõm sng Qua s so sỏnh i chiu trờn cú th h thng... hp vi nhiu ti liu 4.1.2 V tui : Tui gp nhiu nht l CI = 48 - 52 tui 4.2 Bàn luận về chẩn đoán MBH và lâm sàng của UTVMH 4.2.1 Chn oỏn mụ bnh hc : Gp ch yu UCNT (III) (92,5%) Phự hp vi [38] [39] [43] [56] [58] [198] 4.2.2 Chn oỏn khi u (T) 4.2.2.1 Cỏc du hiu mn khi thm khỏm trong UTVMH Thm khỏm ln u tiờn cú hn 50% s bnh nhõn ó biu hin rt rm r ti 2-3 hoc 4 triu chng mn v tai, mi, hch c v thn kinh Nut vng:... 42% Chn oỏn nhm gp 42% trong ú nhúm mi xoang 42,5%, tai 23,8%, thn kinh 17,86%, hch v mt l 13,1% Cm by lõm sng thng gp chớnh l triu chng hc c s ca mi xoang, tai, VTGTD, lit thn kinh s, hch khong bờn hng, lit vn nhón KIN NGH 1 2 Chẩn đoán gen EBV và chủng EBV mới đợc phát hiện 2.1 S trựng hp dng gia chn oỏn gen EBV, mụ bnh hc v lõm sng l 95,6% PCR (+) c 3 type mụ bnh hc PCR (-) cú 4,4% 2.2 ó phỏt hin... nhim v th sựi 3.2 i chiu chn oỏn gen EBV, mụ bnh hc v lõm sng : PCR (+) c 3 type mụ bnh hc, c 9 th thõm nhim (100%), PCR (+) gp nhiu: bnh nhõn cú hch c di cn, lan lờn ỏy s, giai on T4, SIV v th mụ bnh hc UCNT (p < 0,05) PCR (-) c 4 th sựi (100%) 1 Chẩn đoán lâm sàng UTVMH 1.1 Dch t hc i cng : Nam gp nhiu hn n vi t l 3/1 Gp nhiu tui : 40 69 (79%), hay gp nht 4 8-5 2 tui 1.2 Chn oỏn mụ bnh hc : Type... nhúm ph h ca cỏc chng lu tr trong chng trỡnh tin sinh hc GENEDOC 2.5 v x lý phõn tớch quan h phõn nhúm ph h bng chng trỡnh MEGA3.1 (Kumar v cs, 2004) [141] cho thy : chng EB39 cú thnh phn gen tng ng vi cỏc chng ca th gii, chõu u (B9 5-8 ) ó c cp ti trong cỏc nghiờn cu trc õy [22] [23] [27] [30] [47] [49][50] Tra cu cỏc ti liu tham kho chỳng tụi cha thy cp ti chng GD1 ca Trung Quc v cha cú chng EBV no... 4.3 Bàn luận về chẩn đoán gen EBV 4.3.1 Phỏt hin gen EBV bng PCR vi cp mi TH1/TH2 So sỏnh vi s phỏt hin EBV trong mụ sinh thit UTVMH ca mt s tỏc gi khỏc (Bng 4.1) thỡ cú s trựng hp vi nhiu nghiờn cu th t t s 110 (S th t ca bng 4.1) p > 0,05 v nú cng phự hp vi nhiu nghiờn cu khỏc na [145] [148] [154] [158] [161] [166] [193][194] Nhng cng cú s khỏc nhau v t l PCR (+) vi cỏc s th t 11 - 14 (bng 4.1),... cho thy cú DNA EBV trong c d sn trung bỡnh (3/3) v nng (3/3) cng nh trong ung th biu mụ ti ch (insitu) (5/5) Qua nghiờn cu sõu hn v gen EBNA1 v LMP, tỏc gi ny ó a ra nhn nh rng : ó cú 1 dũng EBV gõy ra d sn t bo biu mụ vũm hng (focus of EBV), t ú gõy ra s xõm ln, lm dy lp niờm mc v mt i hỡnh thỏi ca biu mụ tr (strafication), gõy ra hỡnh thỏi sinh sn bt thng vi cỏc nhõn a hỡnh V trong nhng tn thng tin... thut PCR, tỏch dũng, gii trỡnh trỡnh t v xỏc nh chng/type vi nhiu mu EBV nhm khng nh s cú mt ca chng EBV mi ng nht vi cỏc chng Trung Quc, t ú xut can thip v dch t Xõy dng kit chn oỏn a nng, a mi (multiplex-PCR) phỏt hin cỏc virus ung th thng gp, a nhim trong UTVMH v cỏc ung th biu mụ cỏc b phn, c quan khỏc ng dng thc t ti Vit Nam ... E), 42 (V M) V quan h ph h chng EB39 c xp vo nhúm I ging vi chõu u (B9 5-8 ) Chng EB45VN xp vo nhúm II cựng vi Nam Trung Quc (GD1) Ghi chỳ: 1: EBV(45)VN chng EB45; 2: EBV(GD1)CN chng GD1; 3: EBV(39)VN chng EB39; 4: EBV(B9 5-8 ) chng B9 5-8 ; 5: EBV(pCMVEBNA) loi pCMVEBNA; 6: EBV(RaJI) chng Raji; 7: EBV(rpDR2) loi rPDR2; 8: EBV(WT) loi Wild-type; 9: EBV(pEBAC190G) loi pEBAC190G (Chi tit v cỏc chng xem Bng 4.2) . nghiên cứu chẩn đoán lâm sng v gen virus epstein - barr trong ung th vòm mũi họng Chuyên ngnh : Tai mũi họng Mã số : 3.01.30 Tóm tắt luận án tiến sĩ y học H nội -. chẩn đoán gen EBV để giúp cho lâm sàng, mô bệnh học có định hướng theo dõi định kỳ các tổn thư ng còn nghi ngờ trên lâm sàng, và vấn đề kết hợp chẩn đoán gen EBV, mô bệnh học và lâm sàng trong. TH 1 và TH 2 Bảo quản cho nghiên cứu sau ny Chẩn đoán MBH Sinh thiết - Đo quang phổ - Điện di trên thạch Agarose Bớc 1 Bớc 2 Chẩn đoán lâm sng - Lm BA theo mẫu nghiên cứu - Lm