Với mục đích góp phần đưa xét nghiệm định lượng nồng độ cf ADN-EBV vào chẩn đoán sớm, điều trị và tiên lượng bệnh UTVMH tại Việt Nam, nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: Đánh giá nồng độ cf ADN-EBV trước xạ trị và mối liên quan với các thể mô bệnh học và giai đoạn bệnh UTVMH, từ đó giúp tiên lượng, đánh giá kết quả điều trị bệnh UTVMH.
Trang 1ĐÁNH GIÁ NỒNG ĐỘ CF ADN-EBV TRONG HUYẾT TƯƠNG
TRƯỚC XẠ TRỊ VÀ MỐI TƯƠNG QUAN VỚI CÁC THỂ
MÔ BỆNH HỌC VÀ GIAI ĐOẠN BỆNH UNG THƯ V M M I HỌNG
Đỗ Trâm Anh 1 ; Nghiêm Đức Thuận 1 ; Hồ Hữu Thọ 2
TÓM TẮT
Mục tiêu: đánh giá nồng độ cell-free ADN EBV trong huyết tương trước xạ trị và mối tương
quan với các thể mô bệnh học và giai đoạn bệnh ung thư vòm mũi họng Đối tượng và phương pháp:
bệnh nhân được chẩn đoán xác định ung thư vòm mũi họng giai đoạn I - IV, có chẩn đoán mô
bệnh học được lựa chọn vào nhóm nghiên cứu; sử dụng quy trình realtime PCR xét nghiệm
cell-free ADN-EBV trong máu ngoại vi với độ nhạy cao, với ngưỡng phát hiện 25 copies/ml
huyết tương Kết quả: 50 bệnh nhân được làm xét nghiệm định lượng nồng độ cell-free ADN-EBV
trong huyết tương trước xạ trị: 49 bệnh nhân (98%) dương tính, nồng độ cell-free ADN-EBV
trung bình 1,14 x 104 (0 - 1,4 x 105) copies/ml Mối tương quan giữa nồng độ cell-free ADN-EBV
huyết tương với chẩn đoán TNMs: giai đoạn bệnh càng muộn hay di căn hạch cổ càng nhiều,
nồng độ cell-free ADN-EBV trong huyết tương càng cao, sự tương quan này có ý nghĩa thống kê
Kết luận: nồng độ cell-free ADN-EBV huyết tương có mối liên quan với tình trạng di căn hạch cổ,
giai đoạn và thể mô bệnh học của bệnh nhân ung thư vòm mũi họng
* Từ khoá: Ung thư vòm mũi họng; Cell-free ADN-EBV; Mô bệnh học; Giai đoạn bệnh
Evaluation of cf DNA-EBV Levels in Plasma before Radiotherapy
and the Correlation with Histopathology, Disease Stage of
Nasopharyngeal Carcinoma
Summary
Objectives: To investigate serum cf DNA-EBV levels in plasma before radiotherapy and the
correlation with histopathology, disease stage of nasopharyngeal carcinoma patients Subjects
and methods: Diagnosis of nasopharyngeal carcinoma was confirmed by histopathology of
nasopharyngeal biop sies; cf DNA-EBV in peripheral blood was detected using a sensitive technique
of realtime PCR with the detection limit of 25 copies/mL of plasma Results: 50 patients were
tested cf DNA-EBV serum level plasma before radiotherapy, 49 patients (98%) were positive and
1 Bệnh viện Quân y 103
2 Học viện Quân y
Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Trâm Anh (tramanhdo3110@gmail.com)
Ngày nhận bài: 10/08/2018; Ngày phản biện đánh giá bài báo: 28/09/2018
Trang 2had 1.14 x 10 4 (0 - 1.4 x 10 5 ) copies/mL DNA-EBV average serum The correlation between the plasma cf DNA-EBV level and TNMs diagnosis: The rate of patients with high DNA-EBV positive levels was positively correlated with the higher disease stages with metastatic lymphadenopathy, and the correlation was statistically significant with p < 0.05 Conclusion: Plasma cf DNA-EBV level is correlated with node metastases, disease stages, and histopathology of nasopharyngeal carcinoma patients
* Keywords: Nasopharyngeal carcinoma; cf DNA-EBV; Histopathology; Disease stage
ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) là
bệnh ác tính xuất phát từ lớp biểu mô phủ
vùng vòm họng, đây là một trong những
loại ung thư phổ biến hay gặp ở Việt Nam
và các nước Đông Nam Á [6] Bệnh đứng
hàng đầu trong các bệnh ung thư vùng
đầu mặt cổ và là một trong 5 loại ung thư
phổ biến nhất ở nước ta Trên thế giới,
hàng năm có khoảng 80.000 trường hợp
mới mắc Phía nam Trung Quốc, tỷ lệ mắc
cao (25 trường hợp/100.000 dân/năm),
trong khi ở Mỹ và châu Âu tỷ lệ này thấp
hơn (0,5 - 2/100.000 dân [7] Tỷ lệ mắc
bệnh UTVMH cao ở nam giới, độ tuổi từ
40 - 60, UTVMH có liên quan đến nhiều
yếu tố như địa lý, chủng tộc, thói quen
sinh hoạt và đặc biệt là vai trò sinh bệnh
học của Epstein Barr Virus (EBV) trong
UTVMH [1] Việc sử dụng các xét nghiệm
phát hiện kháng thể chống lại EBV để
chẩn đoán sớm và sàng lọc bệnh UTVMH
đã tiến hành ở một vài khu vực Tuy nhiên,
các xét nghiệm thường âm tính ở thể ung
thư biểu mô tế bào vảy của UTVMH và
các bệnh ung thư đầu cổ khác Vì vậy,
EBV là một dấu ấn sinh học để chẩn đoán
sớm bệnh Ở Việt Nam đã có một số
nghiên cứu về xuất hiện EBV trong mô
sinh thiết khối UTVMH, tuy nhiên chưa
có nghiên cứu nào cụ thể về nồng độ
cell-free ADN-EBV (cf ADN-EBV) trong
huyết tương bệnh nhân (BN) UTVMH với các thể mô bệnh học, giai đoạn bệnh và biến đổi nồng độ này trong quá trình xạ trị Với mục đích góp phần đưa xét nghiệm
định lượng nồng độ cf ADN-EBV vào
chẩn đoán sớm, điều trị và tiên lượng bệnh UTVMH tại Việt Nam, nghiên cứu
được thực hiện với mục tiêu: Đánh giá
nồng độ cf ADN-EBV trước xạ trị và mối liên quan với các thể mô bệnh học và giai đoạn bệnh UTVMH, từ đó giúp tiên lượng, đánh giá kết quả điều trị bệnh UTVMH
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
1 Đối tượng nghiên cứu
BN được chẩn đoán UTVMH và điều trị tại Trung tâm Y học Hạt nhân, Bệnh viện K Trung ương từ tháng 1 - 2017 đến 1 - 2018
* Tiêu chuẩn lựa chọn BN:
- Được chẩn đoán xác định UTVMH bằng mô bệnh học
- Chưa được điều trị
- Có đầy đủ hồ sơ bệnh án
- BN đồng ý hợp tác nghiên cứu
2 Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu tiến cứu mô tả từng trường hợp có can thiệp
Trang 3* Khám lâm sàng và cận lâm sàng:
- Hỏi bệnh:
+ Khai thác tiền sử bản thân BN và gia
đình liên quan đến ung thư, lý do vào viện
+ Dựa vào các triệu chứng cơ năng:
ngạt mũi, khịt khạc nhày lẫn máu, xì ra nhày
lẫn máu, ù tai, đau nửa đầu, nghe kém,
viêm tai giữa thanh dịch, liệt dây thần kinh
sọ não
- Thăm khám: sau khi lập bệnh án và
khai thác các triệu chứng cơ năng, đánh
giá các triệu chứng thực thể, nội soi tai
mũi họng cho thấy:
+ Vị trí khối u: thành sau trên, thành bên,
thành dưới
+ Kích thước khối u
+ Hình ảnh đại thể: sùi, loét, thâm nhiễm,
hoại tử chảy máu
+ Lan tràn khối u: mũi xoang, họng
miệng, nền sọ, hố chân bướm hàm
+ Khám hạch cổ: vị trí, kích thước, mật
độ, màu sắc da
+ Sinh thiết khối u chẩn đoán mô
bệnh học
+ Chẩn đoán tế bào học nếu có hạch cổ
+ Chẩn đoán hình ảnh: MRI, CT-scanner
đầu mặt cổ, PET/CT
+ Chẩn đoán giai đoạn TNM theo phân
loại AJCC (2010) của WHO
+ Kết quả xét nghiệm ADN-EBV trong
huyết tương trước điều trị
* Định lượng nồng độ cf ADN-EBV
huyết tương:
Xác định nồng độ cf ADN-EBV huyết
tương bằng kỹ thuật realtime PCR với độ
nhạy cao đã được chúng tôi thiết lập và
mô tả chi tiết trong công bố gần đây [12], bao gồm các bước sau:
- Chuẩn bị mẫu máu: mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi với thể tích 5 ml/lần lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA
- Trong vòng 6 giờ sau lấy, vận chuyển mẫu máu đến labo, tách huyết tương bằng ly tâm 1.500 g trong 10 phút và chuyển sang tuýp nhựa polypropylen
- Tách chiết ADN-EBV từ huyết tương theo quy trình: tách chiết ADN huyết tương bằng bộ kít Anapure DNA/RNA Viral Mini với quy trình cải tiến, đồng thời
bổ sung lượng Viral Lysis buffer và Proteinase K
- Đánh giá kỹ thuật realtime PCR tối
ưu trên bộ panel mẫu chuẩn quốc tế
Độ nhạy của kỹ thuật realtime PCR tối
ưu phát hiện cf ADN-EBV đánh giá chất
lượng trên bộ panel mẫu chuẩn của Đại học Hồng Kông, kết quả thu được từ
kỹ thuật realtime PCR tối ưu có độ đặc hiệu cao (chứng âm không cho tín hiệu khuếch đại) và có khả năng phát hiện mẫu ADN của EBV có nồng độ thấp nhất trong bộ panel mẫu chuẩn quốc tế Kết quả xét nghiệm với 10 lần lặp lại cho thấy ngưỡng phát hiện của kỹ thuật realtime PCR tối ưu là 25 copies/ml huyết tương [12]
* Xử lý số liệu:
Số liệu xử lý bằng phần mềm SPSS 20.0, so sánh các đại lượng định tính bằng thuật toán 2, khảo sát khác biệt về giá trị trung bình bằng kiểm định Mann - Whitney
Trang 4KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Bảng 1: Chẩn đoán giai đoạn theo TNM (AJCC, 2010)
Đánh giá theo khối u nguyên phát, đa số BN thuộc giai đoạn T1, T2 và T4 Đánh giá theo hạch vùng, đa số BN thuộc giai đoạn N1, N0, N2 Đánh giá theo di căn xa, đa số
BN thuộc giai đoạn M0 Đánh giá theo giai đoạn: gặp nhiều ở giai đoạn IV (36%) và giai đoạn II (30%) theo chẩn đoán TNM
* Chẩn đoán mô bệnh học khối u nguyên phát vòm mũi họng:
Týp I (ung thư biểu mô dạng biểu bì sừng hóa): 1 BN (2%); týp II (ung thư biểu mô dạng biểu bì không sừng hóa): 2 BN (4%); týp III (ung thư biểu mô không biệt hóa): 47 BN (94%)
* Nồng độ cf ADN-EBV trong huyết tương: âm tính: 1 BN (2%); dương tính: 49 BN (98%);
số bản copies trung bình: 1,14 x 104
Bảng 2: Mối tương quan giữa nồng độ cf AND-EBV huyết tương với chẩn đoán T và
chẩn đoán N
Theo kích thước u (T)
0,324
Theo kích thước hạch (N)
0,003
Theo kích thước hạch (N)
Theo kích thước khối u (T)
Chẩn đoán TNMs
Trang 5- Mối tương quan giữa nồng độ cf ADN-EBV với giai đoạn T: giai đoạn T1 và T2 có nồng độ ≥ 25 copies/ml là 87,5% và 81,2%; giai đoạn T3 và T4 đều ≥ 25 copies/ml (100%), sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê, p > 0,05
- Mối tương quan giữa nồng độ cf ADN-EBV với giai đoạn N: giai đoạn N1, N2, N3 đều ≥ 25 copies/ml (100%), sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, p < 0,05
Bảng 3: Mối tương quan giữa nồng độ cf ADN-EBV huyết tương với giai đoạn bệnh
Nồng độ ADN-EBV
0,036
Trước điều trị, 100% BN UTVMH giai đoạn III - IV có nồng độ cf ADN-EBV huyết tương ≥ 25 copies/ml Nồng độ trung bình có sự khác biệt rõ rệt, tăng cao ở giai đoạn III, IV so với giai đoạn I, II Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
Bảng 4: Mối tương quan giữa nồng độ cf ADN-EBV huyết tương với mô bệnh học.
Nồng độ ADN-EBV
0,009
Đa số mô bệnh học của BN UTVMH là ung thư biểu mô không biệt hoá (týp 3) với nồng độ cf ADN-EBV huyết tương tăng cao ở thể mô bệnh học týp 2, týp 3 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05)
BÀN LUẬN
Mối liên quan giữa EBV và UTVMH
được chứng minh qua các phản ứng
huyết thanh miễn dịch, qua phản ứng
PCR phát hiện sự hiện diện của EBV
trong máu, nước bọt và trong mô sinh
thiết khối u của BN UTVMH Năm 1998,
Mutirangura và CS đã phát hiện cf ADN-EBV
lưu hành trong máu ngoại vi của BN UTVMH [8] mà không xuất hiện ở 82 đối tượng trong nhóm chứng khỏe mạnh, mặc dù có tới 95% người trong nhóm chứng khỏe mạnh đã từng bị nhiễm EBV Như vậy, EBV thâm nhiễm vào tế bào lympho B ở thể tiềm ẩn, có thể không giải
phóng cf ADN-EBV tự do ra huyết tương,
vì thế không gây hiện tượng dương tính giả
Trang 6Phát hiện này là một bước đột phá quan
trọng cho thấy cf ADN-EBV trong huyết
tương là dấu ấn rất đặc hiệu của UTVMH
Tuy nhiên, tại Việt Nam kỹ thuật định
lượng cf ADN-EBV có độ nhạy còn thấp,
với ngưỡng phát hiện 300 copies/ml huyết
tương, nên chỉ phát hiện được cf ADN-EBV
trong máu ngoại vi ở 64 - 68% BN UTVMH,
nghiên cứu của Nguyễn Huy Tần (2018)
là 74% [4]
Chúng tôi xác định nồng độ cf ADN-EBV
trong huyết tương ở 50 BN UTVMH bằng
kỹ thuật realtime PCR với độ nhạy cao,
ngưỡng phát hiện 25 copies/ml, kết quả
đã xác định được nồng độ dương tính 98%,
tỷ lệ âm tính trước điều trị 2% Kết quả của
chúng tôi tương đương với nghiên cứu
của Lo và CS sử dụng phương pháp
realtime PCR để nâng cao độ nhạy phát
hiện cf ADN-EBV tự do lưu hành trong máu
ngoại vi và phát hiện được cf ADN-EBV ở
96% BN UTVMH [9] Nồng độ cf ADN-EBV
có vai trò quan trọng trong chẩn đoán,
tiên lượng, đánh giá kết quả điều trị
Về mối tương quan giữa nồng độ
cf ADN-EBV huyết tương và giai đoạn
bệnh theo phân loại TNM (AJCC 2010)
cho thấy có mối liên quan có ý nghĩa
thống kê Ở giai đoạn III, IV: 100% BN
có nồng độ cf ADN-EBV huyết tương
≥ 25 copies/ml, cao hơn rõ rệt so với giai
đoạn I, II Khi đánh giá nồng độ so với
giai đoạn T, chúng tôi thấy không có sự
khác biệt nhiều giữa giai đoạn T1, T2 và
T3, T4 Như vậy, nồng độ cf ADN-EBV
không bị biến đổi nhiều bởi kích thước
khối u Tuy nhiên, chưa có tài liệu nào
công bố cụ thể về vấn đề này Ngược lại,
đối với giai đoạn N, càng nhiều di căn hạch
cổ, tỷ lệ ADN-EBV dương tính càng cao UTVMH là bệnh đáp ứng tốt với điều trị nhưng thường áp dụng điều trị đặc thù
đa mô thức [2], đối với giai đoạn I (T1N0M0),
xạ trị đơn thuần có thời gian sống thêm
5 năm > 90%; giai đoạn II (T2N0M0) đáp ứng với xạ trị đơn thuần như giai đoạn I, trong khi ở giai đoạn II (T1,2N1M0), nguy
cơ tái phát cao hơn, cần cân nhắc hóa xạ trị đồng thời Ở giai đoạn III, IV, thời gian sống thêm 5 năm toàn bộ giảm xuống 75% và 58% [2, 8] Chính vì vậy, việc xét nghiệm nồng độ cf ADN-EBV có ý nghĩa quan trọng trong phát hiện, sàng lọc sớm
và tiên lượng bệnh
Về kết quả chẩn đoán mô bệnh học: chúng tôi gặp cả ba loại theo phân nhóm của WHO, trong đó thể mô bệnh học phổ biến nhất là ung thư biểu mô không biệt hóa týp 3 (94,0%) Kết quả này phù hợp với nhiều tài liệu và nghiên cứu trong nước cũng như nước ngoài trước đây: Nguyễn Đình Phúc (92,5%), Nghiêm Đức Thuận (88,89%), Tang M (96,1%) [3, 5, 11] Trong nghiên cứu của chúng tôi, mối liên quan giữa thể mô bệnh học và nồng độ
cf ADN-EBV huyết tương có ý nghĩa thống
kê với p < 0,05
KẾT LUẬN
50 BN được làm xét nghiệm định lượng nồng độ cf ADN-EBV trong huyết tương trước điều trị xạ trị, 49 BN (98%) cho kết quả dương tính, nồng độ cf ADN-EBV trung bình 1,14 x 104 copies/ml Nồng độ
cf ADN-EBV huyết tương có tương quan
thuận với chẩn đoán giai đoạn TNMs:
Trang 7giai đoạn bệnh càng muộn hay di căn
hạch cổ càng nhiều, nồng độ cf ADN-EBV
trong huyết tương càng cao, sự tương
quan này có ý nghĩa thống kê
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1 Đỗ Hòa Bình Nghiên cứu tình trạng suy
giảm đáp ứng miễn dịch tế bào ở bệnh nhân
ung thư vòm mũi họng trước điều trị Tạp chí
Y học Việt Nam 1993, 9, tr.5-9
2 Lê Chính Đại Nghiên cứu điều trị phối
hợp hóa-xạ trị và xạ trị đơn thuần bệnh ung
thư vòm mũi họng giai đoạn III, IV (Mo)
Luận án Tiến sỹ Y học Trường Đại học Y
Hà Nội 2007
3 Nguyễn Đình Phúc Nghiên cứu chẩn
đoán lâm sàng và gen virut Epstein-Barr trong
ung thư vòm mũi họng Luận án Tiến sỹ Y học
Trường Đại học Y Hà Nội 2006
4 Nguyễn Huy Tần Nghiên cứu đặc điểm
lâm sàng, cận lâm sàng và định lượng nồng
độ ADN-EBV huyết tương trong ung thư vòm
mũi họng Luận án Tiến sỹ Y học Trường Đại
học Y Hà Nội 2018
5 Nghiêm Đức Thuận Nghiên cứu đặc
điểm lâm sàng, mô bệnh học và hoạt tính gen
virut Epstein-Barr trong ung thư vòm mũi họng
Luận án Tiến sỹ Y học Học viện Quân y Hà Nội
2002
6 Jemal A, Bray F, Center M.M et al
Global cancer statistics CA Cancer J Clin
2011, 61 (2), pp.69-90
7 Altun M, Fandi A, Dupuis O et al
Undifferentiated nasopharyngeal cancer (UCNT): Current diagnostic and therapeutic aspects
J Radiat Oncol Biol Phys 1995, 32 (3), pp.859-877
8 Mutirangura A et al AND-EBV in serum of
patients with NPC Clin Cannar Res 1998,
4 (3), pp.665-659
9 Lo Y.M et al Quantitative analysis of
cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of
patients with nasopharyngeal carcinoma Cancer Res 1999, 59 (6), pp.1188-1191
10 Al-Sarraf, M, LeBlanc, M, Giri P.G et al
Chemoradiotherapy versus radiotherapy in patients with advanced nasopharyngeal cancer:
Phase III randomized intergroup study 0099
J Clin Oncol 1998, 16, p.1310
11 Tang M, Ou N, Li C et al Expression
and prognostic significance of macrophage inflammatory protein-3 alpha and cystatin A in nasopharyngeal carcinoma BioMed Res
2015, 617143
12 Ho Huu Tho et al Establishment of
ultrasensitive PCR assay targeting cell-free DNA-EBV for early detection of nasopharyngeal carcinoma Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering 2017 [S.l.],
v 59, n 3, p.53-59, 2017, Sep ISSN 2525-2461