Với mục đích góp phần đưa xét nghiệm định lượng nồng độ cf ADN-EBV vào chẩn đoán sớm, điều trị và tiên lượng bệnh UTVMH tại Việt Nam, nghiên cứu được thực hiện với mục tiêu: Đánh giá nồng độ cf ADN-EBV trước xạ trị và mối liên quan với các thể mô bệnh học và giai đoạn bệnh UTVMH, từ đó giúp tiên lượng, đánh giá kết quả điều trị bệnh UTVMH.
Tạp chí y - d-ợc học quân số 8-2018 ĐÁNH GIÁ NỒNG ĐỘ CF ADN-EBV TRONG HUYẾT TƢƠNG TRƢỚC XẠ TRỊ VÀ MỐI TƢƠNG QUAN VỚI CÁC THỂ MÔ BỆNH HỌC VÀ GIAI ĐOẠN BỆNH UNG THƢ V M M I HỌNG Đỗ Trâm Anh1; Nghiêm Đức Thuận1; Hồ Hữu Thọ2 TÓM TẮT Mục tiêu: đánh giá nồng độ cell-free ADN EBV huyết tương trước xạ trị mối tương quan với thể mô bệnh học giai đoạn bệnh ung thư vòm mũi họng Đối tượng phương pháp: bệnh nhân chẩn đoán xác định ung thư vòm mũi họng giai đoạn I - IV, có chẩn đốn mơ bệnh học lựa chọn vào nhóm nghiên cứu; sử dụng quy trình realtime PCR xét nghiệm cell-free ADN-EBV máu ngoại vi với độ nhạy cao, với ngưỡng phát 25 copies/ml huyết tương Kết quả: 50 bệnh nhân làm xét nghiệm định lượng nồng độ cell-free ADN-EBV huyết tương trước xạ trị: 49 bệnh nhân (98%) dương tính, nồng độ cell-free ADN-EBV trung bình 1,14 x 10 (0 - 1,4 x 10 ) copies/ml Mối tương quan nồng độ cell-free ADN-EBV huyết tương với chẩn đoán TNMs: giai đoạn bệnh muộn hay di hạch cổ nhiều, nồng độ cell-free ADN-EBV huyết tương cao, tương quan có ý nghĩa thống kê Kết luận: nồng độ cell-free ADN-EBV huyết tương có mối liên quan với tình trạng di hạch cổ, giai đoạn thể mơ bệnh học bệnh nhân ung thư vòm mũi họng * Từ khố: Ung thư vòm mũi họng; Cell-free ADN-EBV; Mô bệnh học; Giai đoạn bệnh Evaluation of cf DNA-EBV Levels in Plasma before Radiotherapy and the Correlation with Histopathology, Disease Stage of Nasopharyngeal Carcinoma Summary Objectives: To investigate serum cf DNA-EBV levels in plasma before radiotherapy and the correlation with histopathology, disease stage of nasopharyngeal carcinoma patients Subjects and methods: Diagnosis of nasopharyngeal carcinoma was confirmed by histopathology of nasopharyngeal biop sies; cf DNA-EBV in peripheral blood was detected using a sensitive technique of realtime PCR with the detection limit of 25 copies/mL of plasma Results: 50 patients were tested cf DNA-EBV serum level plasma before radiotherapy, 49 patients (98%) were positive and Bệnh viện Quân y 103 Học viện Quân y Người phản hồi (Corresponding): Đỗ Trâm Anh (tramanhdo3110@gmail.com) Ngày nhận bài: 10/08/2018; Ngày phản biện đánh giá báo: 28/09/2018 Ngày báo c ng: 02/10/2018 102 tạp chí y - d-ợc học qu©n sù sè 8-2018 had 1.14 x 10 (0 - 1.4 x 10 ) copies/mL DNA-EBV average serum The correlation between the plasma cf DNA-EBV level and TNMs diagnosis: The rate of patients with high DNA-EBV positive levels was positively correlated with the higher disease stages with metastatic lymphadenopathy, and the correlation was statistically significant with p < 0.05 Conclusion: Plasma cf DNA-EBV level is correlated with node metastases, disease stages, and histopathology of nasopharyngeal carcinoma patients * Keywords: Nasopharyngeal carcinoma; cf DNA-EBV; Histopathology; Disease stage ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư vòm mũi họng (UTVMH) bệnh ác tính xuất phát từ lớp biểu mơ phủ vùng vòm họng, loại ung thư phổ biến hay gặp Việt Nam nước Đông Nam Á [6] Bệnh đứng hàng đầu bệnh ung thư vùng đầu mặt cổ loại ung thư phổ biến nước ta Trên giới, hàng năm có khoảng 80.000 trường hợp mắc Phía nam Trung Quốc, tỷ lệ mắc cao (25 trường hợp/100.000 dân/năm), Mỹ châu Âu tỷ lệ thấp (0,5 - 2/100.000 dân [7] Tỷ lệ mắc bệnh UTVMH cao nam giới, độ tuổi từ 40 - 60, UTVMH có liên quan đến nhiều yếu tố địa lý, chủng tộc, thói quen sinh hoạt đặc biệt vai trò sinh bệnh học Epstein Barr Virus (EBV) UTVMH [1] Việc sử dụng xét nghiệm phát kháng thể chống lại EBV để chẩn đoán sớm sàng lọc bệnh UTVMH tiến hành vài khu vực Tuy nhiên, xét nghiệm thường âm tính thể ung thư biểu mô tế bào vảy UTVMH bệnh ung thư đầu cổ khác Vì vậy, EBV dấu ấn sinh học để chẩn đoán sớm bệnh Ở Việt Nam có số nghiên cứu xuất EBV mô sinh thiết khối UTVMH, nhiên chưa có nghiên cứu cụ thể nồng độ cell-free ADN-EBV (cf ADN-EBV) huyết tương bệnh nhân (BN) UTVMH với thể mô bệnh học, giai đoạn bệnh biến đổi nồng độ trình xạ trị Với mục đích góp phần đưa xét nghiệm định lượng nồng độ cf ADN-EBV vào chẩn đoán sớm, điều trị tiên lượng bệnh UTVMH Việt Nam, nghiên cứu thực với mục tiêu: Đánh giá nồng độ cf ADN-EBV trước xạ trị mối liên quan với thể mô bệnh học giai đoạn bệnh UTVMH, từ giúp tiên lượng, đánh giá kết điều trị bệnh UTVMH ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu BN chẩn đoán UTVMH điều trị Trung tâm Y học Hạt nhân, Bệnh viện K Trung ương từ tháng - 2017 đến - 2018 * Tiêu chuẩn lựa chọn BN: - Được chẩn đoán xác định UTVMH mô bệnh học - Chưa điều trị - Có đầy đủ hồ sơ bệnh án - BN đồng ý hợp tác nghiên cứu Phƣơng pháp nghiên cứu Nghiên cứu tiến cứu mơ tả trường hợp có can thip 103 Tạp chí y - d-ợc học quân sù sè 8-2018 * Khám lâm sàng cận lâm sàng: - Hỏi bệnh: + Khai thác tiền sử thân BN gia đình liên quan đến ung thư, lý vào viện + Dựa vào triệu chứng năng: ngạt mũi, khịt khạc nhày lẫn máu, xì nhày lẫn máu, ù tai, đau nửa đầu, nghe kém, viêm tai dịch, liệt dây thần kinh sọ não - Thăm khám: sau lập bệnh án khai thác triệu chứng năng, đánh giá triệu chứng thực thể, nội soi tai mũi họng cho thấy: + Vị trí khối u: thành sau trên, thành bên, thành + Kích thước khối u nhạy cao thiết lập mô tả chi tiết công bố gần [12], bao gồm bước sau: - Chuẩn bị mẫu máu: mẫu máu tĩnh mạch ngoại vi với thể tích ml/lần lấy vào ống chứa chất chống đông K2 EDTA - Trong vòng sau lấy, vận chuyển mẫu máu đến labo, tách huyết tương ly tâm 1.500 g 10 phút chuyển sang tuýp nhựa polypropylen - Tách chiết ADN-EBV từ huyết tương theo quy trình: tách chiết ADN huyết tương kít Anapure DNA/RNA Viral Mini với quy trình cải tiến, đồng thời bổ sung lượng Viral Lysis buffer Proteinase K + Hình ảnh đại thể: sùi, loét, thâm nhiễm, hoại tử chảy máu - Đánh giá kỹ thuật realtime PCR tối ưu panel mẫu chuẩn quốc tế + Lan tràn khối u: mũi xoang, họng miệng, sọ, hố chân bướm hàm Độ nhạy kỹ thuật realtime PCR tối ưu phát cf ADN-EBV đánh giá chất lượng panel mẫu chuẩn Đại học Hồng Kông, kết thu từ kỹ thuật realtime PCR tối ưu có độ đặc hiệu cao (chứng âm khơng cho tín hiệu khuếch đại) có khả phát mẫu ADN EBV có nồng độ thấp panel mẫu chuẩn quốc tế Kết xét nghiệm với 10 lần lặp lại cho thấy ngưỡng phát kỹ thuật realtime PCR tối ưu 25 copies/ml huyết tương [12] + Khám hạch cổ: vị trí, kích thước, mật độ, màu sắc da + Sinh thiết khối u chẩn đoán mơ bệnh học + Chẩn đốn tế bào học có hạch cổ + Chẩn đốn hình ảnh: MRI, CT-scanner đầu mặt cổ, PET/CT + Chẩn đoán giai đoạn TNM theo phân loại AJCC (2010) WHO + Kết xét nghiệm ADN-EBV huyết tương trước điều trị * Định lượng nồng độ cf ADN-EBV huyết tương: Xác định nồng độ cf ADN-EBV huyết tương kỹ thuật realtime PCR với độ 104 * Xử lý số liệu: Số liệu xử lý phần mềm SPSS 20.0, so sánh đại lượng định tính thuật tốn 2, khảo sát khác biệt giá trị trung bình kiểm nh Mann Whitney tạp chí y - d-ợc học quân sù sè 8-2018 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Bảng 1: Chẩn đoán giai đoạn theo TNM (AJCC, 2010) Chẩn đoán TNMs Theo kích thước hạch (N) Theo kích thước khối u (T) Theo di xa (M) Chẩn đoán TNMs (n = 50) % No, Nx 16 32 N1 15 30 N2 16 32 N3 T1 16 32 T2 16 32 T3 T4 15 30 M0 48 96 M1 I 12 II 15 30 III 11 22 IV 18 36 Đánh giá theo khối u nguyên phát, đa số BN thuộc giai đoạn T1, T2 T4 Đánh giá theo hạch vùng, đa số BN thuộc giai đoạn N1, N0, N2 Đánh giá theo di xa, đa số BN thuộc giai đoạn M0 Đánh giá theo giai đoạn: gặp nhiều giai đoạn IV (36%) giai đoạn II (30%) theo chẩn đoán TNM * Chẩn đốn mơ bệnh học khối u ngun phát vòm mũi họng: Týp I (ung thư biểu mơ dạng biểu bì sừng hóa): BN (2%); týp II (ung thư biểu mơ dạng biểu bì khơng sừng hóa): BN (4%); týp III (ung thư biểu mô không biệt hóa): 47 BN (94%) * Nồng độ cf ADN-EBV huyết tương: âm tính: BN (2%); dương tính: 49 BN (98%); số copies trung bình: 1,14 x 104 Bảng 2: Mối tương quan nồng độ cf AND-EBV huyết tương với chẩn đoán T chẩn đoán N < 25 copies/ml Chẩn đốn TNMs Theo kích thước u (T) Theo kích thước hạch (N) ≥ 25 copies/ml Tổng n % n % T1 12,5 14 87,5 16 T2 18,8 13 81,2 16 T3 0 100 T4 0 15 100 15 Nx, N0 38,5 61,5 13 N1 0 15 100 15 N2 0 16 100 16 N3 0 100 p 0,324 0,003 105 T¹p chÝ y - d-ợc học quân số 8-2018 - Mi tương quan nồng độ cf ADN-EBV với giai đoạn T: giai đoạn T1 T2 có nồng độ ≥ 25 copies/ml 87,5% 81,2%; giai đoạn T3 T4 ≥ 25 copies/ml (100%), khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê, p > 0,05 - Mối tương quan nồng độ cf ADN-EBV với giai đoạn N: giai đoạn N1, N2, N3 ≥ 25 copies/ml (100%), khác biệt có ý nghĩa thống kê, p < 0,05 Bảng 3: Mối tương quan nồng độ cf ADN-EBV huyết tương với giai đoạn bệnh Nồng độ ADN-EBV huyết tƣơng Giai đoạn I Giai đoạn II Giai đoạn III Giai đoạn IV < 25 copies/ml 0 ≥ 25 copies/ml 12 11 18 1048 3985 19554 16102 (13 - 5.990) (0 - 39.000) (119 - 114.000) (156 - 140.000) p 0,036 Nồng độ trung bình Trước điều trị, 100% BN UTVMH giai đoạn III - IV có nồng độ cf ADN-EBV huyết tương ≥ 25 copies/ml Nồng độ trung bình có khác biệt rõ rệt, tăng cao giai đoạn III, IV so với giai đoạn I, II Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Bảng 4: Mối tương quan nồng độ cf ADN-EBV huyết tương với mô bệnh học Nồng độ ADN-EBV huyết tƣơng Týp Týp Týp < 25 copies/ml ≥ 25 copies/ml 43 Nồng độ trung bình 22 798 12.115 (156 - 1.440) (0 - 140.000) p 0,009 Đa số mô bệnh học BN UTVMH ung thư biểu mơ khơng biệt hố (týp 3) với nồng độ cf ADN-EBV huyết tương tăng cao thể mô bệnh học týp 2, týp Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) BÀN LUẬN Mối liên quan EBV UTVMH chứng minh qua phản ứng huyết miễn dịch, qua phản ứng PCR phát diện EBV máu, nước bọt mô sinh thiết khối u BN UTVMH Năm 1998, Mutirangura CS phát cf ADN-EBV 106 lưu hành máu ngoại vi BN UTVMH [8] mà không xuất 82 đối tượng nhóm chứng khỏe mạnh, có tới 95% người nhóm chứng khỏe mạnh bị nhiễm EBV Như vậy, EBV thâm nhiễm vào tế bào lympho B thể tiềm ẩn, khơng giải phóng cf ADN-EBV tự huyết tương, khơng gây tượng dương tính giả t¹p chÝ y - d-ợc học quân số 8-2018 Phỏt hin bước đột phá quan trọng cho thấy cf ADN-EBV huyết tương dấu ấn đặc hiệu UTVMH Tuy nhiên, Việt Nam kỹ thuật định lượng cf ADN-EBV có độ nhạy thấp, với ngưỡng phát 300 copies/ml huyết tương, nên phát cf ADN-EBV máu ngoại vi 64 - 68% BN UTVMH, nghiên cứu Nguyễn Huy Tần (2018) 74% [4] Chúng xác định nồng độ cf ADN-EBV huyết tương 50 BN UTVMH kỹ thuật realtime PCR với độ nhạy cao, ngưỡng phát 25 copies/ml, kết xác định nồng độ dương tính 98%, tỷ lệ âm tính trước điều trị 2% Kết tương đương với nghiên cứu Lo CS sử dụng phương pháp realtime PCR để nâng cao độ nhạy phát cf ADN-EBV tự lưu hành máu ngoại vi phát cf ADN-EBV 96% BN UTVMH [9] Nồng độ cf ADN-EBV có vai trò quan trọng chẩn đoán, tiên lượng, đánh giá kết điều trị Về mối tương quan nồng độ cf ADN-EBV huyết tương giai đoạn bệnh theo phân loại TNM (AJCC 2010) cho thấy có mối liên quan có ý nghĩa thống kê Ở giai đoạn III, IV: 100% BN có nồng độ cf ADN-EBV huyết tương ≥ 25 copies/ml, cao rõ rệt so với giai đoạn I, II Khi đánh giá nồng độ so với giai đoạn T, chúng tơi thấy khơng có khác biệt nhiều giai đoạn T1, T2 T3, T4 Như vậy, nồng độ cf ADN-EBV khơng bị biến đổi nhiều kích thước khối u Tuy nhiên, chưa có tài liệu cơng bố cụ thể vấn đề Ngược lại, giai đoạn N, nhiều di hạch cổ, tỷ lệ ADN-EBV dương tính cao UTVMH bệnh đáp ứng tốt với điều trị thường áp dụng điều trị đặc thù đa mô thức [2], giai đoạn I (T1N0M0), xạ trị đơn có thời gian sống thêm năm > 90%; giai đoạn II (T2N0M0) đáp ứng với xạ trị đơn giai đoạn I, giai đoạn II (T1,2N1M0), nguy tái phát cao hơn, cần cân nhắc hóa xạ trị đồng thời Ở giai đoạn III, IV, thời gian sống thêm năm toàn giảm xuống 75% 58% [2, 8] Chính vậy, việc xét nghiệm nồng độ cf ADN-EBV có ý nghĩa quan trọng phát hiện, sàng lọc sớm tiên lượng bệnh Về kết chẩn đốn mơ bệnh học: chúng tơi gặp ba loại theo phân nhóm WHO, thể mô bệnh học phổ biến ung thư biểu mơ khơng biệt hóa týp (94,0%) Kết phù hợp với nhiều tài liệu nghiên cứu nước nước ngồi trước đây: Nguyễn Đình Phúc (92,5%), Nghiêm Đức Thuận (88,89%), Tang M (96,1%) [3, 5, 11] Trong nghiên cứu chúng tôi, mối liên quan thể mô bệnh học nồng độ cf ADN-EBV huyết tương có ý nghĩa thống kê với p < 0,05 KẾT LUẬN 50 BN làm xét nghiệm định lượng nồng độ cf ADN-EBV huyết tương trước điều trị xạ trị, 49 BN (98%) cho kết dương tính, nồng độ cf ADN-EBV trung bình 1,14 x 104 copies/ml Nồng độ cf ADN-EBV huyết tương có tương quan thuận với chẩn đốn giai đoạn TNMs: 107 T¹p chÝ y - d-ợc học quân số 8-2018 giai on bệnh muộn hay di hạch cổ nhiều, nồng độ cf ADN-EBV huyết tương cao, tương quan có ý nghĩa thống kê TÀI LIỆU THAM KHẢO Đỗ Hòa Bình Nghiên cứu tình trạng suy giảm đáp ứng miễn dịch tế bào bệnh nhân ung thư vòm mũi họng trước điều trị Tạp chí Y học Việt Nam 1993, 9, tr.5-9 Lê Chính Đại Nghiên cứu điều trị phối hợp hóa-xạ trị xạ trị đơn bệnh ung thư vòm mũi họng giai đoạn III, IV (Mo) Luận án Tiến sỹ Y học Trường Đại học Y Hà Nội 2007 Nguyễn Đình Phúc Nghiên cứu chẩn đốn lâm sàng gen virut Epstein-Barr ung thư vòm mũi họng Luận án Tiến sỹ Y học Trường Đại học Y Hà Nội 2006 Nguyễn Huy Tần Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng định lượng nồng độ ADN-EBV huyết tương ung thư vòm mũi họng Luận án Tiến sỹ Y học Trường Đại học Y Hà Nội 2018 Nghiêm Đức Thuận Nghiên cứu đặc điểm lâm sàng, mơ bệnh học hoạt tính gen virut Epstein-Barr ung thư vòm mũi họng Luận án Tiến sỹ Y học Học viện Quân y Hà Nội 2002 108 Jemal A, Bray F, Center M.M et al Global cancer statistics CA Cancer J Clin 2011, 61 (2), pp.69-90 Altun M, Fandi A, Dupuis O et al Undifferentiated nasopharyngeal cancer (UCNT): Current diagnostic and therapeutic aspects J Radiat Oncol Biol Phys 1995, 32 (3), pp.859-877 Mutirangura A et al AND-EBV in serum of patients with NPC Clin Cannar Res 1998, (3), pp.665-659 Lo Y.M et al Quantitative analysis of cell-free Epstein-Barr virus DNA in plasma of patients with nasopharyngeal carcinoma Cancer Res 1999, 59 (6), pp.1188-1191 10 Al-Sarraf, M, LeBlanc, M, Giri P.G et al Chemoradiotherapy versus radiotherapy in patients with advanced nasopharyngeal cancer: Phase III randomized intergroup study 0099 J Clin Oncol 1998, 16, p.1310 11 Tang M, Ou N, Li C et al Expression and prognostic significance of macrophage inflammatory protein-3 alpha and cystatin A in nasopharyngeal carcinoma BioMed Res 2015, 617143 12 Ho Huu Tho et al Establishment of ultrasensitive PCR assay targeting cell-free DNA-EBV for early detection of nasopharyngeal carcinoma Vietnam Journal of Science, Technology and Engineering 2017 [S.l.], v 59, n 3, p.53-59, 2017, Sep ISSN 2525-2461 ... cứu thực với mục tiêu: Đánh giá nồng độ cf ADN-EBV trước xạ trị mối liên quan với thể mô bệnh học giai đoạn bệnh UTVMH, từ giúp tiên lượng, đánh giá kết điều trị bệnh UTVMH ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG... - Mối tương quan nồng độ cf ADN-EBV với giai đoạn N: giai đoạn N1, N2, N3 ≥ 25 copies/ml (100%), khác biệt có ý nghĩa thống kê, p < 0,05 Bảng 3: Mối tương quan nồng độ cf ADN-EBV huyết tương với. .. (BN) UTVMH với thể mô bệnh học, giai đoạn bệnh biến đổi nồng độ trình xạ trị Với mục đích góp phần đưa xét nghiệm định lượng nồng độ cf ADN-EBV vào chẩn đoán sớm, điều trị tiên lượng bệnh UTVMH