khảo sát thành phần hóa học của trái mãng cầu xiêm

[1, 2] Nhằm đóng góp một phần hiểu biết thêm về thành phần hóa học của cây thuốc dân gian và nhận thấy lợi ích của trái Mãng cầu xiêm trong việc hỗ trợ điều trị bệnh, đề tài được thực hi

(Annona muricata L.)

LUẬN VẶN TỐT NGHIỆP CAO HỌC

NGÀNH HÓA HỮU CƠ

2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

- -

TRƯƠNG VĂN GIANG

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA TRÁI MÃNG CẦU XIÊM

(Annona muricata L.)

LUẬN VẶN TỐT NGHIỆP CAO HỌC

NGÀNH HÓA HỮU CƠ

MÃ SỐ: 60440114

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

TS NGUYỄN THỊ THU THỦY

2015

i

LỜI CẢM ƠN



Trong suốt quá trình thực hiện đề tài tôi đã nhận được rất nhiều sự giúp

đỡ và động viên từ quý thầy cô và bạn bè Nhờ vậy, đề tài hoàn thành đúng thời hạn, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến:

- Ts Nguyễn Thị Thu Thủy – người cô đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

-Ts Nguyễn Trọng Tuân – người thầy đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi thực hiện và hoàn thành đề tài nghiên cứu này

- PGs-Ts Bùi Thị Bửu Huê, Ts Lê Thanh Phước, Ts Tôn Nữ Liên Hương và các thầy cô trong bộ môn Hóa Học - khoa Khoa Học Tự Nhiên - trường Đại học Cần Thơ đã giúp đỡ và trang bị cho tôi những kiến thức cần thiết cho việc hoàn thành đề tài này

- Tập thể lớp cao học Hóa hữu cơ K20, các em sinh viên Hóa Dược trường đại học Cần Thơ đã động viên, ủng hộ và giúp đở tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến với gia đình những thành viên luôn dõi theo, ủng hộ và động viên tôi trong công việc

ii

iii

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận văn này được hoàn thành dựa trên các kết qủa nghiên cứu của riêng tôi, các kết qủa của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận văn cùng cấp nào khác và được sự hướng dẫn khoa học của TS Nguyễn Thị Thu Thủy

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2015

Người cam đoan

Trương Văn Giang

iv

TÓM TẮT

Cơm của trái Mãng cầu xiêm (Annona muricata L.), khoảng ba tháng

tuổi được chọn làm đối tượng nghiên cứu cho đề tài Từ các cao chiết của cơm trái Mãng cầu xiêm, bằng phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH, đã xác định

được hoạt tính kháng oxi hóa của cao methanol tổng, cao n-hexane, cao ethyl

acetate và cao nước với giá trị IC50 (g/mL) lần lượt là: 162; 282,3; 158,2 và 75,6 Kết quả định tính cho thấy trong cao tổng của cơm trái Mãng cầu xiêm

có chứa alkaloid, steroid, glycoside và polyphenol Từ các cao chiết n-hexane

và ethyl acetate đã phân lập được sáu hợp chất: 3-hydroxystigmast-5-en (TMC4); 3-hydroxystigmast-5,22-dien (TMC6a); 3-hydroxystigmast-7,22-

dien (TMC6b); 3-O--D-glucopyranosyl stigmast-5-en (TMC01); annoreticuin (TMC5) và cohibin A (TMC02) Cấu trúc các hợp chất phân lập được xác định bởi các kỹ thuật phân tích quang phổ: phổ cộng hưởng từ hạt nhân, khối phổ

và được so sánh với các dữ liệu đã công bố trước đó Các kết quả này góp phần làm phong phú thêm vốn hiểu biết về Mãng cầu xiêm ở Việt Nam

v

ABSTRACT

The pulp of Annona muricata L., which is threemonth years old, has

been chosen as the subject of the research From the various extracts of the

pulp of Annona muricata L., using the free radical DPPH, have determined the antioxydant activity of n-hexane, ethyl acetate, water and total methanol

extracts with a wide range of IC50 (g/mL) values: 162; 282,3; 158,2 and 75,6 respectively Qualitative results show that there are many phytochemical groups such as alkaloid, steroid, glycoside and polyphenol in soursop fruit

From the n-hexane extracts and ethyl acetate was isolated six compounds: 3hydroxystigmast-5-en (TMC4); 3-hydroxystigmast-5,22-dien (TMC6a); 3-

-hydroxystigmast-7,22-dien (TMC6b); 3-O--D-glucopyranosyl stigmast-5-en (TMC01); annoreticuin (TMC5) and cohibin A (TMC02) The structures of isolated compounds were determined by spectroscopic analysis techniques, Nuclear Magnetic Resonance Spectrum (NMR) , Mass Spectrometry (MS) and

by comparison of their previously reported spectra data These results have

contributed to our knowledge about Vietnamese annona muricata L

vi

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN i

LỜI CAM ĐOAN iii

TÓM TẮT iv

ABSTRACT v

MỤC LỤC vi

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT x

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cấp thiết 1

1.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1

1.3 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Đại cương về cây Mãng cầu xiêm 3

2.1.1 Mô tả cây Mãng cầu xiêm 3

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố sinh thái của cây Mãng cầu xiêm 4

2.2 Thành phần dinh dưỡng của trái Mãng cầu xiêm 5

2.3 Dược tính: 5

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 6

2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 6

2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 13

2.5 Hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH 13

2.5.1 Sơ lược về gốc tự do và chất chống oxi hóa 13

2.5.2 Nguyên tắc của phương pháp DPPH 14

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16

3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện 16

3.1.1 Địa điểm 16

3.1.2 Thu và xử lý mẫu 16

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị 16

3.1.4 Hóa chất 16

3.2 Điều chế các cao chiết 17

3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa bằng DPPH 17

3.3.1 Chuẩn bị dung dịch DPPH và điều kiện phản ứng 17

3.3.2 Khả năng kháng oxi hóa của vitamin C 18

3.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các cao chiết 18

3.4 Định tính thành phần hóa học của các cao chiết 20

3.4.1 Alkaloid 20

3.4.2 Flavonoid 20

3.4.3 Steroid 20

3.4.4 Glycoside 21

3.4.5 Polyphenol 21

3.5 Phân lập các chất từ cao n-hexane 21

vii

3.5.1 Khảo sát cao HE 21

3.5.2 Khảo sát phân đoạn HE4 22

3.5.3 Khảo sát phân đoạn HE4-2 23

3.5.4 Khảo phân đoạn HE6 23

3.5.5 Khảo sát phân đoạn HE6-3 24

3.5.6 Khảo sát phân đoạn HE9 24

3.6 Phân lập các chất từ cao ethyl acetate 25

3.6.1 Khảo sát cao EA 25

3.6.2 Khảo sát phân đoạn EA3 25

3.6.3 Khảo sát phân đoạn EA3-3 26

3.6.4 Khảo sát phân đoạn EA8 26

3.6.5 Khảo sát phân đoạn EA8-4 27

3.7 Phương pháp xác định cấu trúc các chất 28

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29

4.1 Kết quả thử hoạt tính kháng oxi hóa 29

4.1.1 Xây dựng đường chuẩn Vitamin C 29

4.1.2 Kết quả hoạt tính kháng oxi hóa của cao tổng MeOH 30

4.1.3 Kết quả hoạt tính kháng oxi hóa của cao n-hexane 30

4.1.4 Kết quả hoạt tính kháng oxi hóa của cao EA 31

4.1.5 Kết quả hoạt tính kháng oxi hóa của cao nước 32

4.1.6 Đánh giá chung hoạt tính kháng oxi hóa 33

4.2 Kết quả định tính thành phần hóa học 35

4.3 Xác định cấu trúc và nhận danh các chất 35

4.3.1 Xác định cấu trúc và nhận danh TMC4 35

4.3.2 Xác định cấu trúc và nhận danh TMC6 38

4.3.3 Xác định cấu trúc và nhận danh TMC01 40

4.3.4 Xác định cấu trúc và nhận danh TMC5 42

4.3.5 Xác định cấu trúc và nhận danh TMC02 46

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48

5.1 Kết luận 48

5.2 Kiến nghị 49

TÀI LIỆU THAM KHẢO 51

PHỤ LỤC 55

Phụ lục 1: Phổ của TMC4 55

Phụ lục 2: Phổ của TMC6 70

Phụ lục 3: Phổ của TMC01 91

Phụ lục 4: Phổ của TMC5 98

Phụ lục 5: Phổ của TMC02 115

viii

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 3.1: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của vitamin C 18

Bảng 3.2: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của cao tổng methanol 19

Bảng 3.3: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của cao n-hexane 19

Bảng 3.4: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của cao ethyl acetate 19

Bảng 3.5: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của cao nước 20

Bảng 3.6: Kết quả khảo sát cao HE 22

Bảng 3.7: Kết quả khảo sát phân đoạn HE4 23

Bảng 3.8: Kết quả khảo sát phân đoạn HE4-2 23

Bảng 3.9: Kết quả khảo sát phân đoạn HE6 24

Bảng 3.10: Kết quả khảo sát phân đoạn HE6-3 24

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát cao EA 25

Bảng 3.12: Kết quả khảo sát phân đoạn EA3 26

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát phân đoạn EA3-3 26

Bảng 3.14: Kết quả khảo sát phân đoạn EA8 27

Bảng 3.15: Kết quả khảo sát phân đoạn EA8-4 27

Bảng 4.1: Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của Vitamin C 29

Bảng 4.2: Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của cao tổng 30

Bảng 4.3: Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của cao n-hexane 31

Bảng 4.4: Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của cao EA 32

Bảng 4.5: Phần trăm ức chế gốc tự do DPPH của cao nước 33

Bảng 4.6: Liều dùng tương đương (g) VitC của các cao chiết 34

Bảng 4.7: Kết quả định tính các nhóm hợp chất 35

Bảng 4.8: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR, HMBC của TCM4 và so sánh với tài liệu [36] 37

Bảng 4.9: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR của TCM6 và so sánh với 3tài liệu [36, 37] 39

Bảng 4.10: Dữ liệu phổ 13C, 1H–NMR của TCM01 và so sánh với tài liệu [38] 41

Bảng 4.11: Dữ liệu phổ 13 C, 1H–NMR của TCM5 và so sánh với tài liệu [36] 44

Bảng 4.12: Dữ liệu phổ 13 C, 1H–NMR của TCM02 và so sánh với tài liệu [43] 47

ix

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Cây Mãng cầu xiêm trồng ở quận Thốt Nốt, thành phố Cần Thơ 4

Hình 2.2: Trái và cơm Mãng cầu xiêm 4

Hình 3.1: Quy trình chiết phân đoạn các loại cao chiết: Cao tổng MeOH, cao HE, cao Ea và cao nước từ cơm trái Mãng cầu xiêm 17

Hình 3.2: Sơ đồ tóm tắt quy trình phân lập các chất từ cao HE và cao EA 28

Hình 4.1: Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế theo nồng độ của vitamin C 29

Hình 4.2: Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế theo nồng độ của cao tổng 30

Hình 4.3: Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế theo nồng độ của cao HE 31

Hình 4.4: Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế theo nồng độ của cao EA 32

Hình 4.5: Đồ thị biểu diễn phần trăm ức chế theo nồng độ của cao nước 33

Hình 4.6: Đồ thị biểu diễn hoạt tính kháng oxi hóa DPPH của các cao chiết so với Vitamin C 34

Hình 4.7: Kết quả định tính các nhóm chất hóa học có trong cao tổng MeOH của trái Mãng cầu xiêm 35

x

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

 Chemical shift

13

C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance

1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

CHCl3 Chloroform

dd Doublet of doublet

DMSO Dimethyl sulfoxide

DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

EtOAc Ethyl acetate

MeOH Methanol

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

TLC Thin layer chromatography (Sắc ký lớp mỏng)

IC50 Half-maximal Inhibitory Concentration

LD50 The median lethal dose

1

CHƯƠNG 1 GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết

Việt Nam nằm trong vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, hệ thực vật phong phú và đa dạng với nhiều loại thực vật là dược liệu quí Từ thời xưa, người dân đã biết sử dụng nhiều loại cây cỏ thiên nhiên làm thuốc chữa bệnh, chính

vì thế thực vật đóng vai trò hết sức quan trọng trong đời sống hằng ngày của con người

Từ cây cỏ nhiều hợp chất thiên nhiên được cô lập, ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất thảo dược Việc sử dụng các loại thảo dược theo cách cổ truyền có xu hướng ngày càng tăng và chiếm một vị trí quan trọng trong nền y học Việt Nam Hợp chất tự nhiên càng ngày càng được quan tâm không những

ở nước ta mà còn ở các nước trên thế giới Việc nghiên cứu hợp chất thiên nhiên làm tiền đề cho việc nghiên cứu chiết xuất để tìm ra các loại thuốc mới, tổng hợp ra những chất có hoạt tính sinh học cao trong việc chữa trị nhiều loại bệnh Chính vì vậy việc nghiên cứu thành phần hóa học từ những cây cỏ thiên nhiên có một ý nghĩa khoa học và thực tiễn cao

Cây Mãng cầu xiêm có tên khoa học Annona muricata họ Annonaceae

Quả xanh của trái Mãng cầu xiêm làm săn da, phơi khô tán bột dùng chữa kiết

lỵ và sốt rét Trái hay nước ép từ trái dùng trị nóng sốt, giúp sinh sữa và trị tiêu chảy, nước ép từ trái Mãng cầu xiêm còn là tác dụng chống vi khuẩn, nhiễm nấm, chống kí sinh trùng đường ruột và giun sán, hạ thấp huyết áp, chống trầm cảm và những rối loạn thần kinh [1, 2]

Nhằm đóng góp một phần hiểu biết thêm về thành phần hóa học của cây thuốc dân gian và nhận thấy lợi ích của trái Mãng cầu xiêm trong việc hỗ trợ

điều trị bệnh, đề tài được thực hiện nhằm: “Khảo sát thành phần hóa học

của trái Mãng cầu xiêm (Annona muricata L.)”

1.2 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Cơm của trái Mãng cầu xiêm (Annona muricata L.) khoảng ba tháng

tuổi, được trồng tại quận Thốt Nốt, thành phố Cần Thơ

- Cao n-hexane và cao ethyl acetate của cơm trái Mãng cầu xiêm

- Nghiên cứu ở quy mô phòng thí nghiệm

2

1.3 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

- Định tính các nhóm hợp chất có trong cơm trái Mãng cầu xiêm

- Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa ở mức độ in vitro của các cao chiết từ

cơm trái Mãng cầu xiêm (cao tổng MeOH, cao HE, cao EA và cao nước)

- Nghiên cứu chiết tách, phân lập và xác định cấu trúc hóa học một số

hợp chất từ cao n-hexane, cao ethyl acetate của cơm trái Mãng cầu xiêm (Annona muricata L.) được trồng tại quận Thốt Nốt, thành phố Cần Thơ

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn

Nghiên cứu khảo sát các hợp chất có hoạt tính của cơm trái Mãng cầu xiêm để có thể giải thích rõ các tác dụng dược lý trong dân gian và góp phần

xác định mức độ, tính chính xác của các thông tin từ những nghiên cứu trước

3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đại cương về cây Mãng cầu xiêm

2.1.1 Mô tả cây Mãng cầu xiêm [3, 4]

Giới (kingdom): Plantae

Ngành (phylum): Magnoliophyta

Lớp (class): Magnoliopsida

Loài (species): A muricata

Tên gọi khác của Mãng cầu xiêm: Mãng cầu gai, na xiêm, na gai

Tên nước ngoài: Soursop (Anh-Mỹ), Guanabana, Graviola, Brazilian Paw Paw, Corossolier (Pháp), Guanavana, Durian benggala Nangka londa Mãng cầu xiêm thuộc loại cây thân gỗ, cao 6 – 8 m Vỏ có nhiều lỗ bì nhỏ, màu nâu Lá mọc so le, nguyên, hình trái xoan ngọn giáo, có mũi, nhẵn, thơm, có 7 - 9 đôi gân bên

Hoa mọc đơn độc ở thân hay nhánh già, 3 lá đài nhỏ màu xanh, 3 cánh hoa màu xanh vàng; 3 cánh hoa trong màu vàng, hơi nhỏ hơn; nhị và nhuỵ làm thành một khối tròn cỡ 1,5 cm Quả mọng kép lớn, hình trứng, dài 25-30 cm, màu lục hay vàng xanh khi chín quá mức sẽ chuyển đổi sang vàng, vỏ rất mỏng, bên ngoài có những mũi nhọn thẳng hay cong, chứa nhiều hạt màu nâu đen Thịt của trái màu trắng chia thành nhiều khối chứa hạt nhỏ

4

Hình 2.1: Cây Mãng cầu xiêm trồng ở quận Thốt Nốt, thành phố Cần Thơ

Hình 2.2: Trái và cơm Mãng cầu xiêm

2.1.2 Nguồn gốc và phân bố sinh thái của cây Mãng cầu xiêm [3, 4]

Cây mãng cầu xiêm là cây bản địa của vùng Trung Mỹ như Mexico, Cuba, vùng Caribe và phía bắc của Nam Mỹ chủ yếu ở Brazil, Colombia, Peru, Ecuador và Venezuela Cây cũng được trồng ở Mozambique, Somalia, Uganda Ngày nay nó cũng được trồng ở một số vùng ở Đông Nam Á, cũng như ở một số đảo Thái Bình Dương

Mãng cầu xiêm chịu được khí hậu nóng Ở Việt Nam, Mãng cầu xiêm được trồng nhiều ở Miền Nam Hầu hết các loài Mãng cầu trồng được trên các loại đất, kể cả đất xấu, chịu được hạn nhưng không chịu úng

Mãng cầu xiêm còn có ở vùng Tây Ấn và miền bắc Nam Mỹ Hiện nay được tìm thấy ở Bermuda và Bahamas, từ mực nước biển đến độ cao 1.150 m trên toàn Tây Ấn và từ miền nam Mexico đến Peru và Argentina Mãng cầu xiêm là một trong những cây ăn quả đầu tiên được đưa từ châu Mỹ về lục địa

5

và sau đó nó được trồng rộng rãi từ Đông Nam Trung Quốc đến Australia và những vùng đất thấp ấm áp của Đông và Tây Phi Mãng cầu xiêm cũng rất phổ biến tại các thị trường Malaya và Đông Nam Á Trái cây này có giá trị rất lớn

đã được trồng ở miền Nam Việt Nam và nó cũng được trồng sớm nhất trong quần đảo Thái Bình Dương, sau đó cây đã được nhân giống thành công, nhưng không có quả ở Israel

2.2 Thành phần dinh dƣỡng của trái Mãng cầu xiêm

100 gram phần thịt của trái Mãng cầu Xiêm, bỏ hạt, chứa [3, 4]:

Các nhà khoa học đã nghiên cứu về dược tính của Mãng cầu xiêm từ

1940 và ly trích được nhiều hoạt chất Một số các nghiên cứu sơ khởi được công bố trong khoảng thời gian 1940 đến 1962 ghi nhận vỏ thân và lá Mãng cầu xiêm có những tác dụng làm hạ huyết áp, chống co giật, làm giãn nở mạch máu, thư giãn cơ trơn khi thử trên thú vật Đến 1991, nghiên cứu cho biết dịch chiết từ lá Mãng cầu xiêm có tác dụng hạ huyết áp Các nghiên cứu sau đó đã chứng minh được là dịch chiết từ lá, vỏ thân, rễ, chồi và hạt Mãng cầu xiêm có những tác dụng kháng sinh chống lại một số vi khuẩn gây bệnh, và vỏ cây có khả năng chống nấm

Ba loại alkaloid: annonaine, nornuciferine và asimilobine cô lập từ trái Mãng cầu xiêm có tác dụng an thần Hoạt tính này do ở khả năng ức chế sự nối kết của [3H] rauwolscine vào các thụ thể 5-HT1A nằm trong phần tuyến yên của não bộ [5]

6

Dịch chiết ethanol từ cơm của trái Mãng cầu xiêm có tác dụng ức chế được siêu vi khuẩn Herpes Simplex (HSV-1) ở nồng độ 1 mg/ml [6]

Các dịch chiết n-hexane, ethyl acetate và methanol từ trái có những hoạt

tính diệt được ký sinh trùng Leishmania braziliensis và L.panamensis (tác dụng này còn mạnh hơn cả chất glucantime dùng làm tiêu chuẩn đối chiếu) Ngoài ra các acetogenins cô lập được annonacein, annonacin A và annomuricin A có các hoạt tính gây độc hại cho các tế bào ung thư dòng U-

937 [7, 8]

Thử nghiệm tại Đại học Universidade Federal de Alagoas, Maceio-AL,

Ba Tây ghi nhận dịch chiết từ lá bằng ethanol có khả năng diệt được nhuyễn thể (ốc-sò) loài Biomphalaria glabrata ở nồng độ LD50 = 8,75 ppm, và có thêm đặc điểm là diệt được các tụ khối trứng của sên (Phytomedicine Số 8-2001)

Một lectin loại glycoproteine chứa 8% carbohydrate, ly trích từ hạt có hoạt tính kết tụ hồng huyết cầu của người, ngỗng, ngựa và gà, đồng thời ức chế được sự tăng trưởng của các nấm và mốc loại Fusarium oxisoporum, Fusarium solani và Colletotrichum musae (Journal of Protein Chemistry Số 22-2003)

Một số acetogenin cô lập từ các bộ phận của cây Mãng cầu xiêm cho thấy có hoạt tính sinh học mạnh với các tế bào ung thư như: ung thư bàng quang [9], ung thư biểu mô vú [10], bạch cầu, ung thư phổi, ung thư biểu mô mũi, họng, ung thư ruột kết ác tính [11], ung thư gan [12]

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.4.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các bộ phận cây Mãng cầu xiêm Các công trình nghiên cứu đã xác định được sự hiện diện của nhiều hợp chất acetogenin có trong các bộ phận của cây

Năm 1997, C Gleye và các cộng sự đã cô lập được hợp chất

montecristin (1) từ rễ của cây Mãng cầu xiêm [13]

Năm 1998, Geum-Soong Kim và các cộng sự đã cô lập được hai hợp

chất mono-tetrahydrofuran annomuricin E (2) và muricapentocin (3) từ lá của cây Mãng cầu xiêm [14]

O O

OH O

Năm 1998, Christophe Gleye và các cộng sự đã cô lập và đồng thời xác

định cấu trúc của sáu hợp chất acetogenin: cis-panatellin (4), cis-reticulatacin (5), cis-reticulatacin-10-on (6), cis-solamin (7), cis- uvariamicin I (8), cis- uvariamicin IV (9) thuộc loại cis-monotetrahydrofuran từ rễ cây Mãng cầu

xiêm [15]

(4) m = 2; n = 13; R = H; A = cis (5) m = 6; n = 11; R = H; A = cis (6) m = 6; n = 11; R = O; A = cis (7) m = 4; n = 11; R = H; A = cis (8) m = 4; n = 13; R = H; A = cis (9) m = 2; n = 15; R = H; A = cis

Năm 1999, Christophe Gleye và cộng sự đã cô lập được hai hợp chất

cohibin C (10) và cohibin D (11) từ hạt [16] và hợp chất sabadelin (12) từ dịch

chiết methanol của rễ cây Mãng cầu xiêm. [17]

32

35

34

(12)

Năm 2000, M.C Jaramillo và các cộng sự đã cô lập và xác định cấu trúc

các hợp chất annomuricin A (13), annonacin (14) và annonacin A (15) từ vỏ

của trái Mãng cầu xiêm [18]

OH

20 15

11 10 4

20 15

11 10 4

OH

20 15

11 10 4

Năm 2000, De Yu Li và các cộng sự đã cô lập và xác định cấu trúc hợp

chất muricatenol (16) từ hạt của trái Mãng cầu xiêm [19]

CH 3 (CH 2 ) 13

OH

OH

OH (CH 2 ) 4

O OH

O

19 18

(17)

O O

10

O O

19 22

23

(20)

OH O

O O

OH

OH

O O

H OH

(23)

OH O

OH OH

O O

H OH

Năm 2002, Chih-Chuang Liaw và các cộng sự đã phân lập và xác định

được cấu trúc các hợp chất cis – annomontacin (24), muricin H (25), muricin I (26) từ hạt và hợp chất annocatalin (27), cis – corossolon (28) từ lá của của

cây Mãng cầu xiêm Đây là các hợp chất thuộc loại mono-tetrahydrofuran [21]

O O OH O

OH OH

(26)

O O OH

O OH

OH

19 28

O O

32

20

Năm 2012, Ragasa Consolacion Y và các cộng sự đã cô lập và xác định

được cấu trúc của ba hợp chất annoreticuin-9-one (29), cis-annoreticuin (30)

và sabadelin (12) từ cao dichloromethane của hạt trái Mãng cầu xiêm Trong

đó annoreticuin-9-one là một acetogenin có hoạt tính gây độc đối với tế bào

ung thư tuyến tụy, tiền liệt tuyến và ung thư phổi ở người Acetogenin

cis-annoreticuin có hoạt tính chống lại ung thư biểu mô gan ở người [22]

(29)

OH OH

O

O O

O

O O

9

trans

threo erythro

(32)

được cô lập từ lá, rể và trái của cây Mãng cầu xiêm [5, 22]

N

O OH HO

OH O

(38)

HN

O O O

O

(39)

HN

O O O

OH

NH O

O

H

13

N H

O O

H

(42)

N H

OH O

H

(43) 2.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Năm 2013 tác giả Đỗ Ngọc Đài nghiên cứu thành phần hóa học tinh dầu của lá Mãng cầu xiêm ở Bắc Trung Bộ Theo đó, thành phần chính đặc trưng cho hai mẫu tinh dầu ở Nghệ An và Thanh Hóa là: β-pinen (20,6 – 27,6%), germacren D (11,3 – 18,1%), bicyclogermacren (5,8 – 13,7%), α-pinen (7,7 – 9,4%) và limonen (4,8 – 6,4%) [24]

Năm 2015 nhóm tác giả Đỗ Quyên, Nguyễn Thu Trang (Đại học Dược

Hà Nội), Hồ Đắc Hùng (Viện Hàn lâm KH&CN Việt Nam) thực hiện phân lập

và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất từ phân đoạn hexane của lá

Mãng cầu xiêm Theo đó, từ phân đoạn dịch chiết n-hexan của lá cây Mãng

cầu xiêm, nhóm nghiên cứu đã phân lập được 3 hợp chất: sistosterol, sistosterol-3-O-β-D-glucopyranosid (hay còn gọi là daucosterol) và lutein Trong đó, hai phytosterol và lutein đã được phân lập từ một số loài trong tự nhiên nhưng đây là lần đầu tiên phân lập được từ phân đoạn hexane của lá cây Mãng cầu xiêm [25]

β-Ngoài ra, còn có số ít nghiên cứu về các loài khác thuộc cùng họ Na

(Annonaceae) Theo đó, nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Na (Annona squamosa L.) được công bố vào năm 2014 [26] và các hợp chất steroid từ cây Bình Bát (Annona reticulata L.) năm 2012 [27] ở đại học Vinh

2.5 Hoạt tính kháng oxi hóa bằng phương pháp DPPH

2.5.1 Sơ lược về gốc tự do và chất chống oxi hóa

Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớp vỏ ngoài cùng có những electron chưa ghép đôi Gốc tự do có khả năng tồn tại độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại rất ngắn (khoảng một phần triệu đến một phần nghìn giây) Chúng là những phần tử có khả năng phản ứng cao, dễ dàng lấy đi điện tử của của phân tử khác nhằm bền vững hoá lớp vỏ điện tử của mình nhưng đồng thời sinh ra một gốc tự do mới, gốc tự do mới lại tiếp tục phản ứng với phân tử khác và tạo thành phản ứng dây chuyền [28]

14

Các gốc tự do có phạm vi phản ứng rộng, sự chuyển và bổ sung electron

đã hình thành nên liên kết cộng hoá trị giữa hai lớp electron Gốc tự do có thể cho một electron để thực hiện sự khử , hoặc sẽ nhận thêm một electron để thực hiện sự oxi hoá từ các nguyên tử khác [29]

Một số gốc tự do có vai trò quan trọng trong cơ thể, chúng là những chất chuyển hóa trung gian có hoạt tính mạnh Tuy nhiên, khi số lượng gốc tự do vượt quá giới hạn kiểm soát của cơ thể thì chúng sẽ tấn công vào hệ thống các

mô, các base trong nucleic acid, các amino acid trong chuỗi protein, các acid béo chưa bão hòa, gây ra hàng loạt biến đổi cho cơ thể và là trung gian của những căn bệnh mãn tính [30]

Chất chống oxi hóa là một chất ức chế quá trình oxi hóa thậm chí ở nồng

độ tương đối nhỏ và có vai trò sinh lý quan trọng khác nhau trong cơ thể Chúng có vai trò khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng Để làm vậy người ta hay dùng các chất khử (như thiol hay polyphenol) làm chất chống oxi hóa [31]

2.5.2 Nguyên tắc của phương pháp DPPH

Có nhiều phương pháp khác nhau để thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa của một chất Trong đó, phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH là một phương pháp thường được sử dụng cho việc khảo sát khả năng ức chế gốc tự

do ở mức độ in vitro vì đơn giản, nhanh chóng và ổn định

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do ổn định, bền ở nhiệt

độ thường dưới dạng bột màu đen và có màu tím đặc trưng trong dung môi (thường dùng methanol hoặc ethanol) Gốc DPPH có bước sóng hấp thu cực đại ở 517 nm và độ hấp thu của nó giảm tương ứng khi nguyên tử N mang một điện tử lẻ nhận một điện tử hoặc hydro từ các chất chống oxi hóa (dung dịch DPPH từ màu đen tím chuyển sang màu vàng) Do đó, DPPH được sử dụng rộng rãi và là thử nghiệm cơ bản để đánh giá hiệu quả hoạt động làm sạch gốc

tự do của các chất chống oxi hóa dựa trên sự thay đổi độ hấp thu của dung dịch DPPH ở bước sóng 517 nm [32]

N N

15

Do đây là một phương pháp sử dụng gốc tự do hóa học, không thể đánh giá hoạt tính một cách trực tiếp mà cần có một chất kháng oxi hóa đối chứng Kết quả kháng oxi hóa mạnh hay yếu của các mẫu thử sẽ được đánh giá gián tiếp bằng các đối chiếu với chất đối chứng dương này Có nhiều chất đối chứng dương đã được sử dụng bao gồm: trolox, tocopherol, acid gallic, Tuy nhiên, được sử dụng rộng rãi nhất là vitamin C bởi vai trò sinh học quan trọng của nó trong cơ thể

Khả năng khử gốc tự do DPPH của một cao chiết (hoặc chất chống oxi hóa) ở nồng độ xác định được biểu diễn thông qua phần trăm ức chế (I%) được tính theo công thức:

Phần trăm ức chế C S

C

A - A

x 100 A

Trong đó: Acontrol hay Ac là giá trị mật độ quang của dung dịch DPPH

Asample hay As là giá trị mật độ quang của dung dịch mẫu thử + DPPH

Ac luôn lớn hơn As Kết quả hoạt tính kháng oxi hóa của một chất bằng phương pháp DPPH được biểu diễn bằng giá trị IC50 (half maximal Inhibitory Concentration) IC50được định nghĩa là nồng độ của chất mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự

do, tế bào hoặc enzyme IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp

Để xác định IC50, tiến hành khảo sát mẫu thử ở nhiều nồng độ khác nhau

và tính phần trăm ức chế của từng nồng độ Với những mẫu có phần trăm ức chế biến thiên phần trăm ức chế và nồng độ mẫu (với y là phần trăm ức chế và

x là nồng độ mẫu) Tìm phương trình tuyến tính bằng chương trình Microsoft Excel Thay y = 50 vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x, đó chính là nồng

độ ức chế được 50% gốc tự do (IC50)

16

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Địa điểm, thời gian và phương tiện

3.1.1 Địa điểm

Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm Hóa Sinh 1, khoa Khoa Học Tự Nhiên và phòng thí nghiệm Hóa hữu cơ – khoa Sư phạm, trường Đại học Cần Thơ từ tháng 07/2014 - 07/2015

3.1.2 Thu và xử lý mẫu

Mẫu trái Mãng cầu xiêm (Annona muricata L.) tươi được thu hái vào

tháng 7 năm 2014 tại quận Thốt Nốt, thành phố Cần Thơ

Trái tươi sau khi thu hái chỉ lấy phần cơm, được cắt mỏng sau đó đem phơi dưới ánh nắng không gay gắt cho đến khi khô hoàn toàn Mẫu khô được nghiền thành bột, sau đó đem ngâm chiết với dung môi MeOH ở nhiệt

độ phòng nhiều lần, liên tục cho đến kiệt

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị

- Tủ sấy, tủ hút

- Máy cô quay chân không

- Máy soi UV bước sóng 254 và 365 nm

- Cột sắc kí

- Cân phân tích Sartorius bốn số lẻ

- Máy quang phổ hồng ngoại FT – IR Nicolet 6700

- Một số dụng cụ khác như: Phễu chiết, bếp điện, erlen, becher, bình chiết, đũa thủy tinh, ống vi quản, giấy lọc, ống eppendorf,…

3.1.4 Hóa chất

-Các dung môi: n-hexane, ethyl acetate, acetone, methanol,

chlorofom… của hãng Chemsol

- Dung dịch H2SO4 10% trong MeOH, vanillin ,

- Silica gel Merck (0,040 – 0,063 mm)

- Sắc kí bản mỏng tráng sẵn (Merck)

- Na2SO4 dùng để làm khan dung môi

- DPPH Sigma

- Vitamin C

17

3.2 Điều chế các cao chiết

Bột khô của cơm trái Mãng cầu xiêm (4,0 kg) được tận trích bằng MeOH bằng phương pháp ngâm dầm sau mỗi 24 giờ, lọc bã, cô quay phần dịch bằng máy cô quay chân không và thu hồi dung môi Công việc được tiến hành nhiều lần và được lặp đi lặp lại cho đến khi thu được cao MeOH (còn gọi

là cao tổng) có khối lượng 810 g (dạng dầu sệt)

Cao tổng được hòa với một lượng ít nước và tiến hành chiết lỏng – lỏng

với n-hexane Quá trình sau chiết với n-hexane thu được 80 g cao n-hexane

(cao HE – dạng dầu sệt) và phần dịch chiết không tan Tiến hành chiết lỏng – lỏng phần dịch chiết không tan với ethyl acetate (EtOAc) Quá trình sau chiết với EtOAc thu được 28 g cao ethyl acetate (cao EA – dạng dầu sệt) và phần dịch chiết không tan còn lại cô đuổi nước được thu được 693 g cao nước

Hình 3.1: Quy trình chiết phân đoạn các loại cao chiết: Cao tổng MeOH, cao HE, cao EA và cao nước từ cơm trái Mãng cầu xiêm

3.3 Phương pháp thử hoạt tính kháng oxi hóa bằng DPPH

3.3.1 Chuẩn bị dung dịch DPPH và điều kiện phản ứng

Cân chính xác 5,00 mg DPPH rồi định mức đến 5 mL bằng methanol thu được dung dịch DPPH gốc nồng độ 1000 g/mL được dùng cho các thí

18

nghiệm kế tiếp Dung dịch DPPH gốc được trữ lạnh trong bóng tối và được

pha mới mỗi ngày

Dung dịch DPPH được sử dụng trong các mẫu thử luôn ở thể tích là 40

µL, thể tích mỗi mẫu thử được cố định 1mL trong tuýp eppendorf Vậy, nồng

độ DPPH trong các mẫu thử là 40 µM

Hỗn hợp phản ứng được ủ trong bóng tối ở nhiệt độ phòng Sau 30 phút

đo độ hấp thu tại bước sóng 517 nm trên máy Multiskan Spectrophotometer Thermo tại phòng thí nghiệm Sinh học đất – Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng

3.3.2 Khả năng kháng oxi hóa của vitamin C

Cân chính xác 10,0 mg vitamin C rồi định mức đến 10 mL bằng methanol Lắc đều đến khi tan hoàn toàn thu được dung dịch vitamin C nồng

độ 1 mg/mL Dùng micropipet rút 1 mL dung dịch vừa pha cho vào bình rồi định mức đến 10 mL bằng methanol thu được dung dịch gốc vitamin C nồng

độ 100 g/mL được dùng cho các thí nghiệm kế tiếp

Thể tích dung dịch vitamin C dùng trong các mẫu thử tăng dần, ứng với nồng độ tăng dần Thí nghiệm tiến hành được trình bày trong [Bảng 3.1]

Bảng 3.1: Thí nghiệm đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của vitamin C

Mẫu

thử

Thể tích MeOH (µL)

Dung dịch Vitamin C (100 mg/mL) Thể tích

DPPH (µL)

Thể tích (µL)

Nồng độ tương ứng trong mẫu thử (µg/mL)

3.3.3 Đánh giá hoạt tính kháng oxi hóa của các cao chiết

Cân chính xác 100 mg cao chiết rồi định mức đến 10 mL thu được dung dịch cao chiết nồng độ 10 mg/mL Dùng micropipet rút chính xác 1 mL dung dịch vừa pha cho vào bình rồi định mức đến 10 mL bằng methanol thu được dung dịch cao chiết gốc nồng độ 1000 g/mL được dùng cho các thí nghiệm

kế tiếp

Thể tích dung dịch cao chiết dùng trong các mẫu thử tăng dần, ứng với nồng độ tăng dần cuả từng loại cao Thí nghiệm tiến hành được trình bày trong các bảng: [Bảng 3.2], [Bảng 3.3], [Bảng 3.4] và [Bảng 3.5]

Thể tích (µL)

Nồng độ tương ứng trong mẫu thử (µg/mL)

Dung dịch cao (1000 mg/mL) Thể tích

DPPH (µL)

Thể tích (µL)

Nồng độ tương ứng trong mẫu thử (µg/mL)

Dung dịch cao (1000 mg/mL) Thể tích

DPPH (µL)

Thể tích (µL)

Nồng độ tương ứng trong mẫu thử (µg/mL)

Dung dịch cao (1000 mg/mL) Thể tích

DPPH (µL)

Thể tích (µL)

Nồng độ tương ứng trong mẫu thử (µg/mL)

3.4 Định tính thành phần hóa học của các cao chiết

Nhằm đánh giá sơ bộ thành phần hóa học của cao tổng chiết từ cơm trái Mãng cầu xiêm, các phương pháp định tính các nhóm hợp chất tự nhiên đã được tiến hành Các nhóm hợp chất được đánh giá bao gồm: alkaloid, steroid, flavonoid, glycoside, polyphenol [33-35] Mẫu thử được hòa tan trong methanol rồi tiến hành định tính bằng các thuốc thử

3.4.1 Alkaloid

Sử dụng thuốc thử Dragendorff (Potassium bismuth iodide) : Bismuth

nitrate (0,85 g) hòa tan trong 10 mL acid acetic băng và 40 mL nước rồi cho dung dịch chứa 8 g KI trong 20 mL nước vào, khuấy đều, trữ trong chai tối màu Nhỏ vài giọt thuốc thử vào ống nghiệm chứa dịch chiết, nếu có alkaloid

sẽ cho kết tủa đỏ nâu

3.4.2 Flavonoid

Sử dụng phản ứng Cyanidin của Wilstatter (hay phản ứng Shinoda):

Chuẩn bị hai ống nghiệm có chứa sẵn khoảng 2 mL cao chiết hòa trong

methanol Một ống làm đối chứng, ống còn lại cho vài giọt t-butanol, vài hạt

Mg kim loại rồi nhỏ từ từ HCl đậm đặc vào Đun nhẹ sẽ xuất hiện màu ở lớp alcol Nếu dịch chuyển sang màu đỏ, cam hoặc tím chứng tỏ có chứa flavone, flavanone, flavonol, xanthone Nếu cao chiết có chứa isoflavone, isoflavanone,

auron thì dung dịch không đổi màu

3.4.3 Steroid

Sử dụng thuốc thử Salkowski : Cho vào ống nghiệm 1 mL dịch mẫu (cao

tổng hòa tan trong chlorofom), nghiêng ống nghiệm và nhỏ từ từ từng giọt đến hết 1 mL H2SO4

đậm đặc theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính là dung dịch tách làm hai lớp, có vòng ngăn cách màu nâu đỏ giữa 2 lớp, lớp

H2SO4 có màu xanh và lớp CHCl3 có màu đỏ

21

3.4.4 Glycoside

Sử dụng thuốc thử Tollens ( Phản ứng đuờng khử): Cho vào ống nghiệm

khoảng 2 mL dung dịch thử, thêm 3-4 giọt H2SO4 đậm đặc Đun cách thủy trong 5 phút Thêm 5 giọt pyridin, 4 giọt thuốc thử Tollens mới pha Phản ứng dương tính khi có sự tạo thành bạc bám trên thành ống nghiệm hoặc tủa màu đen của Ag kim loại

Tiến hành sắc kí cột nhanh – khô (gọi tắt là sắc kí cột nhanh) cao HE

(khối lượng 70 g) trên silica gel Rửa giải cột với hệ dung môi

n-hexane:EtOAc (100:0  0:100) và cuối cùng là 100% MeOH Theo dõi cột bằng sắc kí bản mỏng, các lọ cho cùng kết quả TLC được gom chung lại và cô đuổi dung môi thu được tổng cộng 12 phân đoạn kí hiệu từ HE1 - HE12 Kết quả được tóm tắt qua [Bảng 3.6]

1 HE1 100% n-hexane 7,53 Không rõ vết

11 HE11 100% EtOAc 5,71 Không rõ vết

3.5.2 Khảo sát phân đoạn HE4

Tiến hành SKC phân đoạn HE4 (khối lượng 0,63 g) trên silica gel Rửa

giải cột với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (100:0  0:100) và cuối cùng là 100% MeOH Các phân đoạn giống nhau được theo dõi qua TLC và tập hợp thành các phân đoạn nhỏ, ký hiệu là HE4-1 đến HE4-6 Kết quả được tóm tắt qua [Bảng 3.7]

1 HE4-1 100% n-hexane 0,09 Không rõ vết

6 HE4-6 100% MeOH 0,07 Không rõ vết

3.5.3 Khảo sát phân đoạn HE4-2

Phân đoạn HE4-2 (khối lượng 120 mg) có kết tinh màu trắng trong dịch màu xanh Tan trong chlorofom Tiến hành SKC tinh chế với hệ dung môi rửa

cột n-hexane:EtOAc (100:0  0:100), thu được tinh thể trắng (33 mg), TLC cho một vết tròn màu tím trong thuốc thử vanillin/H2SO4 10%, kí hiệu là

3.5.4 Khảo phân đoạn HE6

Tiến hành SKC phân đoạn HE6 (khối lượng 0,57 g) trên silica gel Rửa

giải cột với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (100:0  0:100) và cuối cùng là 100% MeOH Các phân đoạn giống nhau được theo dõi qua TLC và tập hợp thành các phân đoạn nhỏ, ký hiệu là HE6-1 đến HE4-7 Kết quả được tóm tắt qua [Bảng 3.9]

1 HE6-1 100% n-hexane 0,04 Không rõ vết

7 HE6-7 100% MeOH 0,023 Không rõ vết

3.5.5 Khảo sát phân đoạn HE6-3

Phân đoạn HE6-3 (khối lượng 97 mg) có kết tinh màu trắng trong dịch màu vàng Tan trong chlorofom Tiến hành SKC tinh chế với hệ dung môi rửa

cột n-hexane:CHCl3 (100:0  0:100), thu được tinh thể trắng (27 mg), TLC cho một vết tròn màu tím trong thuốc thử vanillin/H2SO4 10%, kí hiệu là

3.5.6 Khảo sát phân đoạn HE9

Phân đoạn HE9 (khối lượng 48 mg), nhận thấy có kết tinh màu trắng trong dịch không màu ít tan trong MeOH nên tiến hành lọc rửa bằng MeOH và kết tinh lại nhiều lần trong hệ dung môi CHCl3:MeOH = 5:5 thu được 31 mg

25

một chất, TLC cho một vết tròn màu tím trong thuốc thử vanillin/H2SO4 10%,

kí hiệu hợp chất thu được là TMC01

3.6 Phân lập các chất từ cao ethyl acetate

3.6.1 Khảo sát cao EA

Tiến hành SKC cao EA (khối lượng 23 g) trên silica gel với dung môi

rửa giải ban đầu là n-hexane:EtOAc, tăng dần độ phân cực với các hệ rửa giải

8:2, 7:3, 1:1, 3:7, 100% EtOAc và đến 100% MeOH Các phân đoạn giống nhau được theo dõi qua TLC và tập hợp thành 10 phân đoạn nhỏ, ký hiệu là EA1 đến EA10 Kết quả được tóm tắt qua [Bảng 3.11]

Bảng 3.11: Kết quả khảo sát cao EA

Phân

đoạn Ký hiệu Dung môi rửa giải

Khối lượng (g) Kết quả TLC Ghi chú

7 EA7 100% EtOAc 2,16 Không rõ vết

9 EA9 100% EtOAc 2,08 Không rõ vết

10 EA10 100% MeOH 2,12 Không rõ vết

3.6.2 Khảo sát phân đoạn EA3

Tiến hành SKC phân đoạn EA3 (khối lượng 1,2 g) trên silica gel Rửa

giải cột với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (9:1  0:100) và cuối cùng là 100% MeOH Các phân đoạn giống nhau được theo dõi qua TLC và tập hợp thành các phân đoạn nhỏ, ký hiệu là EA3-1 đến EA3-7 Kết quả được tóm tắt qua [Bảng 3.12]

6 EA3-6 100% EtOAc 0,12 Không rõ vết

7 EA3-7 100% MeOH 0,17 Không rõ vết

3.6.3 Khảo sát phân đoạn EA3-3

Phân đoạn EA3-3 (khối lượng 0,037 g) có kết tinh trắng trong dịch màu tím Tinh thể tan trong CHCl3 Tiến hành SKC tinh chế với dung môi rửa giải

ban đầu là, n-hexane:CHCl3 7:3, 1:1 đến 100% CHCl3 và cuối cùng là MeOH Thu được kết tinh màu trắng sạch 6 mg TLC cho một vết tròn màu vàng nâu với thuốc thử vanillin/H2SO4 10% Kí hiệu là TMC02

Bảng 3.13: Kết quả khảo sát phân đoạn EA3-3

3.6.4 Khảo sát phân đoạn EA8

Tiến hành SKC phân đoạn EA8 (khối lượng 2,3 g) trên silica gel Rửa

giải cột với hệ dung môi n-hexane:EtOAc (7:3  0:100) và cuối cùng là 100% MeOH Các phân đoạn giống nhau được theo dõi qua TLC và tập hợp thành các phân đoạn nhỏ, ký hiệu là EA8-1 đến EA8-6 Kết quả được tóm tắt qua [Bảng 3.14]

5 EA8-5 100% EtOAc 0,48 Không rõ vết

6 EA8-6 100% MeOH 0,19 Không rõ vết

3.6.5 Khảo sát phân đoạn EA8-4

Phân đoạn EA8-4 (khối lượng 0,57 g) có kết tinh màu trắng trong dịch không màu Tinh thể tan trong CHCl3 Tiến hành SKC tinh chế với dung môi

rửa giải ban đầu là, n-hexane:EtOAc 1:1, 3:7 đến 100% EtOAc và cuối cùng là

MeOH Thu được kết tinh màu trắng sạch 21 mg TLC cho một vết tròn màu vàng nâu với thuốc thử vanillin/H2SO4 10% Kí hiệu là TMC5

Bảng 3.15: Kết quả khảo sát phân đoạn EA8-4

Phân

đoạn Ký hiệu Dung môi rửa giải

Khối lượng (g) Kết quả TLC Ghi chú