Gốc tự do là những nguyên tử, nhóm nguyên tử hay phân tử mà lớp vỏ ngoài cùng có những electron chưa ghép đôi. Gốc tự do có khả năng tồn tại độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại rất ngắn (khoảng một phần triệu đến một phần nghìn giây). Chúng là những phần tử có khả năng phản ứng cao, dễ dàng lấy đi điện tử của của phân tử khác nhằm bền vững hoá lớp vỏ điện tử của mình nhưng đồng thời sinh ra một gốc tự do mới, gốc tự do mới lại tiếp tục phản ứng với phân tử khác và tạo thành phản ứng dây chuyền [28].
14
Các gốc tự do có phạm vi phản ứng rộng, sự chuyển và bổ sung electron đã hình thành nên liên kết cộng hoá trị giữa hai lớp electron. Gốc tự do có thể cho một electron để thực hiện sự khử , hoặc sẽ nhận thêm một electron để thực hiện sự oxi hoá từ các nguyên tử khác [29].
Một số gốc tự do có vai trò quan trọng trong cơ thể, chúng là những chất chuyển hóa trung gian có hoạt tính mạnh. Tuy nhiên, khi số lượng gốc tự do vượt quá giới hạn kiểm soát của cơ thể thì chúng sẽ tấn công vào hệ thống các mô, các base trong nucleic acid, các amino acid trong chuỗi protein, các acid béo chưa bão hòa, ... gây ra hàng loạt biến đổi cho cơ thể và là trung gian của những căn bệnh mãn tính [30].
Chất chống oxi hóa là một chất ức chế quá trình oxi hóa thậm chí ở nồng độ tương đối nhỏ và có vai trò sinh lý quan trọng khác nhau trong cơ thể.
Chúng có vai trò khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng. Để làm vậy người ta hay dùng các chất khử (như thiol hay polyphenol) làm chất chống oxi hóa [31].
2.5.2 Nguyên tắc của phương pháp DPPH
Có nhiều phương pháp khác nhau để thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hóa của một chất. Trong đó, phương pháp sử dụng gốc tự do DPPH là một phương pháp thường được sử dụng cho việc khảo sát khả năng ức chế gốc tự do ở mức độ in vitro vì đơn giản, nhanh chóng và ổn định.
DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do ổn định, bền ở nhiệt độ thường dưới dạng bột màu đen và có màu tím đặc trưng trong dung môi (thường dùng methanol hoặc ethanol). Gốc DPPH có bước sóng hấp thu cực đại ở 517 nm và độ hấp thu của nó giảm tương ứng khi nguyên tử N mang một điện tử lẻ nhận một điện tử hoặc hydro từ các chất chống oxi hóa (dung dịch DPPH từ màu đen tím chuyển sang màu vàng). Do đó, DPPH được sử dụng rộng rãi và là thử nghiệm cơ bản để đánh giá hiệu quả hoạt động làm sạch gốc tự do của các chất chống oxi hóa dựa trên sự thay đổi độ hấp thu của dung dịch DPPH ở bước sóng 517 nm [32].
N N
NO2 O2N
NO2
+ RH
N NH
NO2 O2N
NO2
+ R
1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazine
15
Do đây là một phương pháp sử dụng gốc tự do hóa học, không thể đánh giá hoạt tính một cách trực tiếp mà cần có một chất kháng oxi hóa đối chứng.
Kết quả kháng oxi hóa mạnh hay yếu của các mẫu thử sẽ được đánh giá gián tiếp bằng các đối chiếu với chất đối chứng dương này. Có nhiều chất đối chứng dương đã được sử dụng bao gồm: trolox, tocopherol, acid gallic,... Tuy nhiên, được sử dụng rộng rãi nhất là vitamin C bởi vai trò sinh học quan trọng của nó trong cơ thể.
Khả năng khử gốc tự do DPPH của một cao chiết (hoặc chất chống oxi hóa) ở nồng độ xác định được biểu diễn thông qua phần trăm ức chế (I%) được tính theo công thức:
Phần trăm ức chế C S
C
A - A
x 100 A
Trong đó: Acontrol hay Ac là giá trị mật độ quang của dung dịch DPPH.
Asample hay As là giá trị mật độ quang của dung dịch mẫu thử + DPPH
Ac luôn lớn hơn As
Kết quả hoạt tính kháng oxi hóa của một chất bằng phương pháp DPPH được biểu diễn bằng giá trị IC50 (half maximal Inhibitory Concentration). IC50 được định nghĩa là nồng độ của chất mà tại đó nó có thể ức chế 50% gốc tự do, tế bào hoặc enzyme. IC50 là một giá trị dùng để đánh giá khả năng ức chế mạnh hoặc yếu của mẫu khảo sát, mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 sẽ càng thấp.
Để xác định IC50, tiến hành khảo sát mẫu thử ở nhiều nồng độ khác nhau và tính phần trăm ức chế của từng nồng độ. Với những mẫu có phần trăm ức chế biến thiên phần trăm ức chế và nồng độ mẫu (với y là phần trăm ức chế và x là nồng độ mẫu). Tìm phương trình tuyến tính bằng chương trình Microsoft Excel. Thay y = 50 vào phương trình ta sẽ thu được giá trị x, đó chính là nồng độ ức chế được 50% gốc tự do (IC50).
16 CHƯƠNG 3