Đang tải... (xem toàn văn)
Tế bào vật chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E. coli để khuếch đại một lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp dùng cho các phân tích về sauMột virus mang DNA sợi đôi có kích thước khoảng 50 kbỞ dạng phân tử mạch thẳng có hai đầu bổ trợ sợi đơn dài 12 nucleotide
Công nghệ DNA tái tổ hợp Chương 4: Các hệ thống vector VECTOR CHUYỂN GEN Khái niệm Yêu cầu Có vùng Ori, Có vùng promoter Có vị trí nhận biết đơn Chứa các gen làm vô hiệu hóa đoạn DNA không mong muốn gắn vào Đảm bảo sự di truyền bền vững của DNA tái tổ hợp Có gen thị Có nhiều bản Có vùng RBS Ứng dụng Nghiên cứu sự biểu hiện của một đoạn trình tự DNA Đưa gen vào các tế bào vi sinh vật hay các động-thực vật Tạo dòng (cloning) và khuếch đại (amplification) đoạn trình tự của DNA Sản xuất RNA Sản xuất protein từ gen được tạo dòng Giới thiệu 6 loại vector phổ biến thuộc nhóm : plasmid, phage/phagemid , NST nhân tạo I Plasmid vector Thông tin di truyền nhân, tìm thấy nhiều loài vi khuẩn Plasmid DNA mạch vòng, sợi đôi, kích thước 1-≥ 200kb Có khả tự chép để tồn độc lập tế bào Thế hệ thứ Thế hệ thứ I.1 Tạo dòng plasmid DNA plasmid bị cắt bởi enzyme hạn chế Nguyên tắc Biến nạp vào vi khuẩn Gắn in vitro với đoạn DNA ngoại lai tạo các plasmid tái tổ hợp Tạo dòng Phage λ 2.1 Chọn vector λ thích hợp Có hai yếu tố ảnh hưởng đến sự chọn lọc RE Khi DNA dài 105% ngắn 78% so với genome tự nhiên đóng gói Size DNA exotic ~ 60% genome( nhánh trái , phải) cần thiết cho sinh tan phage Giảm Khả sống sót phage 2.2 Những vector cải tiến - Tăng khả thích ứng đoạn DNA ngoại lai khác với RE - Cho phép chọn lựa phương thức tái tổ hợp mong muốn - Cho phép có RNA probe sẵn sàng cho việc chuyển mã DNA ngoại lai gắn vào vector Phát triển vector trình gắn vào cDNA sinh vật bậc cao, hình thức polypeptide dung hợp với β-galactosidase Hình thức hữu ích việc chọn lọc kháng thể loại vector cải tiến hệ gần III Cosmid vector Đăc điểm cosmid 1.2 Tạo dòng cosmid IV Bacteriophage M13 vector Đặc điểm bacteriophage M13 Size : 6500 nucleotide Cloning DNA long Sections Insert size > 350 bp Include: DNA short sections stacked Hình 4.16 Vector M13mp18 (phagemid) Đây vector sử dụng phổ biến nhóm vector M13mp Gen Kích thước sản phẩm Chức 35-40 kD Protein màng NS; vài sao/tế bào; tương tác với sản phẩm gen fip vật chủ (thioredoxin); cần cho lắp ráp 46 kD Endonuclease/topoisomerase đặc trưng chuỗi vị trí; khoảng 103 sao/tế bào; cần cho chép RF 42 kD đoạn cuối M13; cần cho phát sinh hình thái xác M13; 49 kD Protein màng NS; vài sao/tế bào; cần cho lắp ráp 10 kD (87 aa) Protein cấu trúc trình chép; điều hòa biểu gen g2p 12 kD (112 aa) Khoảng đoạn cuối M13 với gen g3p; cần cho lắp ráp phát sinh hình thái 3,5 kD Khoảng đoạn cuối ngược lại M13 với gen g3p/g6p; cần cho lắp ráp kD (50 aa) Protein cấu trúc vỏ: khoảng 2700-3000 sao/virion 10 12 kD (111 aa) Đoạn mang đầu tận N gen 2; khoảng 500 sao/tế bào; cần cho chép RF 7/9 V BAC vector Đặc điểm BAC vector Insert size 300 kb Tạo dòng BAC VI YAC vector Đặc điểm YAC(NST nhân tạo nấm men) Tạo dòng YAC Hình 4.18 Vector pYAC4 Vị trí tạo dòng EcoRI gen sup4 trp1 ura3 marker chọn lọc nhánh trái phải YAC tương ứng TEL hai trình tự telomere CEN4 cung cấp chức phần tâm So sánh số đặc điểm vector tạo dòng Vector Năm đưa Vật chủ Cấu trúc vào sử dụng Kích thước đoạn chèn (kb) Plasmid 1974 E coli Mạch vòng [...]... chuyển mã của DNA ngoại lai gắn vào vector Phát triển các vector trong quá trình gắn vào cDNA của sinh vật bậc cao, dưới hình thức một polypeptide dung hợp với β-galactosidase Hình thức này rất hữu ích trong việc chọn lọc kháng thể 2 loại vector cải tiến của thế hệ gần nhất III Cosmid vector 1 Đăc điểm của cosmid 1.2 Tạo dòng trong cosmid IV Bacteriophage M13 vector 1 Đặc điểm bacteriophage M13 Size... nạp DNA plasmid vào tế bào E coli Tế bào được ủ trong dung dịch CaCl2 để trở thành tế bào khả biến II Bacteriophage λ vector II Bacteriophage λ vector Sinh tan Xâm nhiễm vào vi khuẩn vật chủ DNA tạo vòng ngay (ghép hai đầu kết dính cos) Tiềm tan Ưu điểm của Phage λ Đặc điểm của bacteriophage λ Phage λ chỉ có thể nhận được DNA lạ trong một chừng mực rất hạn chế Khả năng của nó sẽ bị giảm rất... M13 vector 1 Đặc điểm bacteriophage M13 Size : 6500 nucleotide Cloning DNA long Sections Insert size > 350 bp Include: DNA short sections stacked Hình 4.16 Vector M13mp18 (phagemid) Đây là một trong các vector được sử dụng phổ biến của nhóm vector M13mp Gen Kích thước sản phẩm Chức năng 1 35-40 kD Protein màng NS; một vài bản sao/tế bào; tương tác với sản phẩm gen fip của vật chủ (thioredoxin);... 78% (38 ÷ 38,5kb) so với độ dài ban đầu Tạo dòng trong Phage λ 2.1 Chọn vector λ thích hợp Có hai yếu tố ảnh hưởng đến sự chọn lọc RE Khi DNA dài hơn 105% hoặc ngắn hơn 78% so với genome tự nhiên được đóng gói Size DNA exotic ~ 60% genome( nhánh trái , phải) là cần thiết cho sự sinh tan của phage Giảm Khả năng sống sót của phage 2.2 Những vector được cải tiến - Tăng khả năng thích ứng... cấu trúc chính của vỏ: khoảng 2700-3000 bản sao/virion 10 12 kD (111 aa) Đoạn mang đầu tận cùng N của gen 2; khoảng 500 bản sao/tế bào; cần cho sự sao chép của RF 7/9 V BAC vector Đặc điểm BAC vector 1 Insert size 300 kb Tạo dòng trong BAC ... Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào vi khuẩn/ tế bào vật chủ Tế bào vật chủ thường được sử dụng là vi khuẩn E coli để khuếch đại một lượng lớn DNA plasmid tái tổ hợp dùng cho các phân tích về sau Hai phương pháp được dùng để biến nạp Điện biến nạp Hóa biến nạp Điện biến nạp Ưu điểm Nhược : Đòi hỏi thiết bị biến nạp đắt tiền Hóa biến nạp Biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli Tế bào được ủ trong dung...Phân tử DNA vector đã tái tạo lại vòng Khó khăn ? Plasmid chứa các đoạn DNA ngoại lai-thể tái tổ hợp Phương thức dùng để phân biệt 1 Khử hoạt tính bằng chèn đoạn (1a) 1 Khử hoạt tính bằng chèn đoạn 1 Khử hoạt tính bằng chèn đoạn(1b) Vector tái tạo lại vòng sẽ biểu hiện một enzyme hạn chế gây chết sau khi được biến nạp... 3 42 kD 5 bản sao ở một đoạn cuối của M13; cần cho sự phát sinh hình thái chính xác của M13; 4 49 kD Protein màng NS; một vài bản sao/tế bào; cần cho sự lắp ráp 5 10 kD (87 aa) Protein cấu trúc chính trong quá trình sao chép; điều hòa sự biểu hiện của gen g2p 6 12 kD (112 aa) Khoảng 5 bản sao ở cùng đoạn cuối của M13 với gen g3p; cần cho sự lắp ráp và phát sinh hình thái 3,5 kD Khoảng 5 bản sao ở đoạn