Tổng hợp sợi thứ 2 của cDNA trong tạo dòng cDNA Tổng hợp DNA sợi đôi từ các khuôn mẫu sợi đơn trong phát sinh đột biến in vitro Phát sinh đột biến điểm trực tiếp bao gồm Dloops. Tăng chiều dài chuỗi sản phẩm trong mọi phản ứng được xúc tác bởi DNA polymerase trên khuôn mẫu dài.
CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP CHƯƠNG I: CÁC ENZYME DÙNG TRONG TẠO DÒNG PHÂN TỬ ĐHKH HUẾ NỘI DUNG CHÍNH I Các enzyme hạn chế II Các enzyme trùng hợp III Các enzyme gắn IV Các enzyme phân cắt V Các protein liên kết DNA sợi đơn I Các enzyme cắt hạn chế Nguồn gốc Được phân lập từ sinh vật prokaryote Type I Type II Type III Phân loại Các enzyme hạn chế type II Cách gọi tên Chữ thứ tên chi Eco Hai chữ đầu tên loài RI Chủng liên quan + Bậc xác định Ví dụ : EcoRI => Escherichia coli + chủng RY13 , I : bậc xác định vi khuẩn Các enzyme hạn chế type II - Enzyme nhận biết trình tự đặc hiệu gồm : 4,6 cặp base có trình tự đối xứng đảo ngược (palindrome) Vd: Enzyme EcoRI nhận biết chuỗi nucleotide Đầu dínhvà đầu Đầu dính Đầu Cắt vị trí gần đầu 3’ 5’ tạo đầu lồi Cắt vị trí trình tự nhận biết Nối đoạn DNA : có mặt enzyme ligase phage T4 tăng tốc độ gắn Nối đoạn DNA lại: Ngoài enzyme ligase,có thể sử dụng linker hay dùng terminal transferase Đầu dính đầu EcoRI HaeIII Tạo đầu dính đầu Đầu dính đầu 3.4 Alkaline phosphatase ( E.coli ruột bê) IV Các enzyme phân cắt Các nuclease thường sử dụng : 4.1 Dnase I Deoxyribonuclease I 4.2 Nuclease S1 Hoạt tính Phản ứng Nuclease đặc hiệu sợi đơn DNA sợ đơn RNA 5’pdN 5’prN DNA sợi đôi bị đứt Cơ chất 4.3 Exonuclease III Hoạt tính Phản ứng 3’ exonuclease 3’ phosphatase 5’P 3’OH 3’OH 5’P 5’ 3’P Enzyme 3’P 5’ Mg2+ E 5’ 3’OH 3’OH 5’ 4.4 Ribonuclease (Rnase A) 4.5 RNase H V Các protein liên kết DNA sợi đơn • Kết hợp với DNA sợi đơn không kết hợp DNA sợi đôi Trong tạo dòng phân tử • Ứng dụng : - Phát sinh đột biến điểm trực tiếp bao gồm Dloops - Tăng chiều dài chuỗi sản phẩm phản ứng xúc tác DNA polymerase khuôn mẫu dài CẢM ƠN THẦY CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE ! [...]... Thấp (L) Thấp 10 0 50 10 1 II Các enzyme trùng hợp 1 DNA polymerase 1 DNA polymerase I của E.coli Ứng dụng 2 Đoạn Klenow của DNA polymerase I của E.coli 3 DNA polymerase của bacteriophage T4 Ứng dụng 4 Taq DNA polymerase Được sử dụng nhiều trong kỹ thuật PCR 2 RNA polymerase SX RNA làm mẫu dò Xác định trình tự 1 phân tử DNA tạo dòng trong 1 vector SX lượng lớn RNA từ DNA được tạo dòng 3 Enzyme phiên... chống lại sự phân hủy của các enzyme cắt hạn chế 4 Methyl hóa Tất cả các chủng E coli đều chứa 2enzyme methyl hóa DNA là: dam và dcm dam dcm 5 Cắt DNA bằng enzyme cắt hạn chế Các loại đệm dùng trong phản ứng cắt DNA Nhóm đệm Các enzyme hạn chế chia làm 3 nhóm Hoạt độ ion Pha chế dd đệm stock (mM) NaCl Tris.HCl pH 7,5 MgCl2 Dothiothreitol Cao (H) Cao 0 10 10 1 Trung bình (M) Trung bình 50 10 10 1 Thấp (L)... transferase Ứng dụng • Thêm đuôi đồng trùng hợp (homopolymer) đầu so le cho phân tử DNA trong tạo dòng • Đánh dấu đầu 3’OH của DNA trình tự gen III Các enzyme gắn 3 .1 Bacteriophage T4 DNA ligase 3.2 Bacteriophage T4 RNA ligase 3.3 Bacteriophage T4 polynucleotide kinase 3.4 Alkaline phosphatase ( E.coli và ruột bê) IV Các enzyme phân cắt Các nuclease thường sử dụng :