Đang tải... (xem toàn văn)
Mục đích : Kỹ thuật lai Southern Xác định có hay không sự hiện diện của gen ? Xác định số bản sao của gen đó trong genome Nguyên tắc: Dựa vào sự lai phân tử Các thí nghiệm lai trên màng thường được tiến hành bằng cách đánh dấu mẫu dò bằng 32P Tuy nhiên,các phương pháp không dùng đồng vị phóng xạ (ví dụ: digoxigenindUTP) ngày càng được sử dụng phổ biến
Nội dung Tạo dòng genomic DNA eukaryote xây dựng thư viện genomic DNA Thư viện genomic DNA Khái niệm Xây dựng thư viện : giai đoạn RE I Cắt genomic DNA RE RE Genomic DNA Các đoạn DNA RE thường có trình tự nhận biết 4bp 5’…GATC…3’ 3’…CTAG…5’ Không Không ph phả ảii lúc lúc nào cũng thu thu đ đượ ượcc 1 gen gen nguyên nguyên vv ẹ ẹn n n nằ ằm m trên 1 đo đo ạn n DNA DNA * Phản ứng cắt phần genomic DNA * Thông thường Dùng lượng tối thiểu RE + ủ thời gian ngắn ( vừa đủ) cho vị trí nhận biết không bị cắt đồng thời tăng khả gen bảo toàn nguyên vẹn (ngay chứa vị trí nhận biết gen) T Tậ ập ph hợ ợp p các vector vector ch ứa a các đo đoạ ạn n genomic genomic DNA DNA Th Thư vi việ ện n genomic genomic DNA DNA II Tạo dòng đoạn DNA để xây dựng thư viện genome DNA ligase Trong RE RE Vector Năm đưa vào sử dụng Vật chủ Cấu trúc Kích thước đoạn chèn (kb) Plasmid 1974 E coli Mạch vòng [...]... nhiều (khoảng vài picogram) - SM: Chỉ thị kích thư c chuẩn của DNA DNA của bacteriophage λ được phân cắt bằng HindIII hoăăc 1-kb ladder DNA là các chỉ thị kích thư c chuẩn của DNA thông dụng nhất cho Southern blot - PC: đối chứng dương tính (đoạn DNA làm mẫu dò) - Các đường 1-6: các mẫu genomic DNA được cắt bằng enzyme hạn chế SM PC 1 2 3 4 5 6 Hình Hình ảnh điện di của genomic DNA sau khi... kiện tiền lai và lai Các Các tác tác nhân nhân ngăn ngăn ch chặ ặn n lk lk không không đ đặ ặcc hi hiệ ệu u Mẫu dò -DNA không là chuỗi đích: Salmon sperm DNA hoặc thymus DNA T của mẫu dò và DNA Tm m của mẫu dò và DNA ssợ ợii đôi đôi Tối đa phản ứng lai đặc hiệu của mẫu dò với DNA chuỗi đích Tối thiểu các lk không đặc hiệu với màng lai và DNA không phải chuỗi đích Nhiệt độ nóng chảy của DNA sợi đôi ... Tinh sạch đoạn chèn DNA từ agarose gel Cắt bằng EcoRI Điện di agarose gel Đánh dấu *** Biến tính mẫu dò LAI - Biến tính Trung hòa Thẩm tích Cố định DNA ? Phân tách các đoạn cắt hạn chế của genomic DNA Genomic DNA được cắt bằng 1 hoặc 1 vài RE tập hợp các đoạn DNA được phân tách theo kích thư c bằng điện di agarose gel Lượng mẫu: - 2-10µg đối với genomic DNA - Nếu mẫu DNA được tạo dòng trong plasmid... Tm( C) = 81 ,5 C + 16,6 (log10M) + 0,41 (%G + C) - 0,72 (%f ) - 50 0/n Nhiệt độ nóng chảy được dung cho thể lai RNA -DNA: o o 2 Tm ( C) = 79,8 C + 18 ,5 (log10M) + 0 ,58 (%G + C) - 11,8 (%G + C) - 0 ,56 (%f ) - 820/n Trong đó + M là nồng đô phân tử của các cation hóa trị 1 (đặc trưng là Na ) (%G + C) là nồng đô phần trăm của guanine và cytosine (%f) là % của formamide (t/n làm mất sự ổn định của xoắn đôi)... digoxigenin-dUTP Hình 5. 7 Hình ảnh phân tích Southern blot của hai thí nghiệm khác nhau Các băng màu đen là tín hiệu lai giữa DNA đích và mẫu dò *V Sàng lọc thư viện genomic DNA Plasmid Plasmid hoặc hoặc Khuẩn lạc BAC,YAC BAC,YAC Nguồn gốc các vector Sinh tan tế bào bị xâm Virus Virus nhiễm Vết tan (plaque) Chứa các gen chỉ thị cho phép chọn lọc những tế bào vật chủ mang vector Các vector trong tạo dòng Chứa... level Fifth level VII Ứng dụng của thư viện genomic DNA Lập bản đồ vật lý của DNA Sản xuất các dòng mang các đoạn chèn DNA khác nhau Xác định gen gây xơ nang Xác định các gen gây bệnh hoặc các chuỗi DNA quan tâm cho những nghiên cứu xa hơn Sử dụng trong quá trình chromosome walking VIII Phân tích trình tự của đoạn DNA được tạo dòng 1 Phương pháp hóa học Maxam-Gilbert 2 Phương pháp enzyme Sanger 3 Xác... là chiều dài của thể lai (theo base) Áp Áp d dụ ụng ng vvớ ớii các các DNA DNA ssợ ợii đôi đôi dài dài h hơ ơn n 100-200 100-200 nucleotide nucleotide * Cường lực dùng trong các TN lai là số nghịch đảo của giá trị chuẩn C C = Tm – Ti Thông thư ng các các phản ứng lai và các bước rửa đầu tiên được tiến hành ở điều kiện cường lực thấp (~ C cao) và tăng dần ở các bước tiếp theo Chú ý :Tm của các mẫu... hiện huỳnh huỳnh quang quang của của nucleotide nucleotide được được đánh đánh dấu dấu Phân Phân tích tích DNA DNA bằng bằng khối khối phổ phổ Điện Điện di di mao mao quản quản hoặc hoặc lai lai với với các các đoạn đoạn oligonucleotide oligonucleotide được được tổng tổng hợp hợp nhân nhân tạo tạo Hình : Máy phân tích trình tự nucleotide tự động và hình ảnh đi ện di các băng DNA phát huỳnh quang quan... cắt bằng enzyme hạn chế 2 Chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai Gđ: Biến tính Giai đoạn này cần thiết khi phân tích Southern các đoạn DNA có kích th ước lớn DNA được khử purin = dd HCl loãng Hạn chế : khó kiểm soát và dễ làm mất các đoạn DNA nhỏ Gđ: Thẩm tích Màng lai Màng nylon Màng nitrocellulose Cao Thấp (chiếu xạ UV 2000J) 0 (Đun 80 C, chân không) Thời gian tạo liên kết đồng Ngắn Dài hóa trị... đoạn DNA bằng phóng xạ 1 Đánh dấu ở đuôi 2 Đánh dấu bằng dịch chuyển điểm đứt 3 Đánh dấu bằng kéo dài primer 1 Đánh dấu ở đuôi Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level 2 Đánh dấu bằng dịch chuyển điểm đứt 3 Đánh dấu bằng kéo dài primer Click to edit Master text styles Second level Third level Fourth level Fifth level VII Ứng dụng của thư viện genomic DNA Lập ... genomic genomic DNA DNA Th Thư vi việ ện n genomic genomic DNA DNA II Tạo dòng đoạn DNA để xây dựng thư viện genome DNA ligase Trong RE RE Vector Năm đưa vào sử dụng Vật chủ Cấu trúc Kích thư c... DNA phân tách theo kích thư c điện di agarose gel Lượng mẫu: - 2-10µg genomic DNA - Nếu mẫu DNA tạo dòng plasmid phage lượng nhiều (khoảng vài picogram) - SM: Chỉ thị kích thư c chuẩn DNA DNA...RE I Cắt genomic DNA RE RE Genomic DNA Các đoạn DNA RE thư ng có trình tự nhận biết 4bp 5 …GATC…3’ 3’…CTAG 5 Không Không ph phả ảii lúc lúc nào cũng thu