Chương 5 tạo dòng genomic DNA của eukaryote và xây dựng thư viện genomic DNA

Chương Tạo dòng genomic DNA eukaryote xây dựng thư viện genomic DNA Thư viện genomic DNA tập hợp đoạn DNA đại diện cho genome nguyên vẹn (hoặc gần nguyên vẹn) cá thể mà DNA bắt nguồn từ Các đoạn nằm vector tự chép cho phép chúng trì sinh sản với tế bào thể vi sinh vật, vi khuẩn Escherichia coli nấm men Saccharomyces cerevisiae Những thư viện bảo quản nguồn cố định đoạn DNA đại diện cho thể đặc biệt Một phòng thí nghiệm thu thập thư viện genome từ phòng thí nghiệm khác từ nguồn thương mại cách lựa chọn để xây dựng thư viện riêng Một thu được, thư viện dùng chủ yếu để sàng lọc theo phương pháp khác nhằm phân lập (các) trình tự nucleotide quan tâm đặc biệt, để xác định vị trí thứ tự trình tự genome mà từ thư viện xây dựng (physical mapping) Xây dựng thư viện genomic DNA bao gồm bốn giai đoạn (Hình 5.1): Cắt DNA, gắn DNA vào vector, đóng gói dòng tái tổ hợp vỏ protein virus để làm bước trung gian trước xâm nhiễm vào tế bào vật chủ, chuyển cấu trúc vào tế bào vật chủ I Cắt genomic DNA enzyme hạn chế Để đưa toàn gen genome vào thư viện, trước hết genome phải cắt enzyme hạn chế thành đoạn DNA có kích thước thích hợp tùy thuộc vào loại vector nhận chúng Genomic DNA thường cắt enzyme hạn chế có trình tự nhận biết bp, ví dụ MboI nhận biết trình tự 5’-GATC-3’ Tuy nhiên, dễ dàng thu gen nguyên vẹn nằm đoạn DNA Trong thực tế, gen thường bị cắt thành nhiều đoạn DNA vị trí nhận biết enzyme nằm gen Hình 5.1 Xây dựng thư viện genomic DNA Các giai đoạn xây dựng thư viện DNA vector bacteriophage l a, b, c d trình bày khác (nhưng chồng lên nhau) đoạn DNA genome, hợp vector riêng rẽ đại diện dòng riêng biệt thư viện Thông thường, phản ứng cắt phần genomic DNA tiến hành cách dùng lượng tối thiểu enzyme ủ thời gian ngắn cho vị trí nhận biết không bị cắt đồng thời Do vị trí cắt phân bố ngẫu nhiên nên gen bảo toàn nguyên vẹn chứa vị trí nhận biết gen DNA sau phân đoạn có đoạn có kích thước nằm phạm vi mong muốn chọn lọc Các đoạn DNA đưa vào vector thích hợp Tập hợp vector chứa đoạn genomic DNA tạo thành thư viện genomic DNA Mỗi đoạn DNA chứa vector thư viện gọi dòng (clone) Tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA mà chọn vector phage (có thể chứa đoạn DNA dài từ 15-23 kb), cosmid (45 kb) hay BAC (>100 kb) Có thể sử dụng DNA tách từ mô khác để xây dựng thư viện genomic DNA Các thư viện genomic DNA thể chứa đoạn DNA dài ngắn khác thông tin di truyền không thay đổi Ngược lại, thư viện cDNA xây dựng từ mRNA Trong thể có gen hoạt động loại tế bào định, mô khác thu phân tử mRNA khác Vì vậy, thể có nhiều thư viện cDNA khác đặc trưng cho loại tổ chức chuyên hóa (xem chương 6) II Tạo dòng đoạn DNA để xây dựng thư viện genome Các đoạn DNA thu từ phản ứng cắt hạn chế gắn đồng hóa trị in vitro vào vector tạo dòng cách dùng enzyme DNA ligase Trước gắn, vector cắt vị trí đơn, thông thường với enzyme dùng để cắt DNA nguồn, nhằm tạo đầu kết dính bổ trợ cho đầu đoạn chèn DNA Một đôi khi, vector DNA nguồn cắt với tổ hợp hai enzyme khác để ngăn cản loại phân tử tự gắn lại Sự tự tái tạo lại vòng vector giảm thiểu cách xử lý với enzyme alkaline phosphatase để loại nhóm 5’ phosphate khỏi đầu vector Một số lượng lớn vector tạo dòng phát triển cho việc xây dựng thư viện DNA, chọn lựa vector phụ thuộc vào phạm vi kích thước đoạn DNA tạo dòng, ứng dụng Các plasmid vector Các plasmid phân tử DNA mạch vòng đóng cộng hóa trị, siêu xoắn có kích thước vài kilobase (chương 4) Mặc dù plasmid xuất tự nhiên, chủ yếu vi khuẩn, plasmid dùng xây dựng thư viện DNA thường thiết kế có chủ định với cấu trúc nhân tạo Các vector tạo dòng chứa vị trí nhận biết đơn cho enzyme hạn chế mà DNA ngoại lai chèn vào (insertion) Các vị trí cho nhiều enzyme khác tập hợp lại vùng tạo dòng (multiple cloning sites) vùng đa nối (polylinker) Các plasmid mang bổ sung nhiều gen thị (marker gene), gen kháng kháng sinh, cho phép có tế bào chứa plasmid sinh trưởng môi trường chọn lọc, gen cho enzyme β-galactosidase cho phép phân tử tái tổ hợp chứa đoạn chèn DNA phân biệt với thể không tái tổ hợp Nhược điểm plasmid dùng làm vector tạo dòng khả chứa chúng bị giới hạn thích hợp với đoạn DNA ngoại lai có kích thước nhỏ vài kilobase (kb) hiệu suất biến nạp chúng vào tế bào vật chủ tương đối thấp Các bacteriophage λ vector Các bacteriophage virus xâm nhiễm vào vi khuẩn Genome chúng DNA sợi đôi mạch vòng mạch thẳng, bọc vỏ protein làm trung gian cho xâm nhập chúng vào tế bào vật chủ Bacteriophage λ vector tạo dòng có nguồn gốc virus thông dụng dùng xây dựng thư viện Genome bao gồm phân tử DNA sợi đôi mạch thẳng dài khoảng 50 kb, phân tử xâm nhiễm vào E coli tạo vòng cách ghép đầu dính (xem chương 4) Trong chu kỳ sinh tan (lytic cycle), phân tử dạng vòng λ genome chép sau cắt vị trí đặc biệt (vị trí cos) để tạo λ monomer đóng gói đầu protein hoàn chỉnh Cũng có phage λ không vào chu kỳ tan, mà chuyển sang giai đoạn tiềm tan (lysogenic), suốt giai đoạn hợp ổn định nhiễm sắc thể tế bào vật chủ E coli Các gen đòi hỏi cho chức sinh tan tập hợp lại đoạn stuffer, loại bỏ xây dựng vector tạo dòng có nguồn gốc λ để nhận đoạn DNA có kích thước lên đến 20 kb Các vector λ tái tổ hợp bao gồm nhánh trái, nhánh phải đoạn DNA ngoại lai gắn vào hai nhánh Kết thể tái tổ hợp sau đóng gói vỏ protein cách dùng hệ thống đóng gói in vitro cho phép xâm nhiễm vào tế bào vật chủ với hiệu suất cao Đối với genome đặc trưng động vật có vú dài ´ 109 bp, xấp xỉ khoảng ´ 105 thể tái tổ hợp λ mang đoạn chèn có kích thước trung bình khoảng 20 kb đảm bảo xác suất 99% đoạn DNA cần thiết diện thư viện Các cosmid vector Cosmid plasmid vector mang đầu cos λ (chương 4) Vì thế, cosmid đóng gói tiểu thể λ với hiệu suất cao Sau xâm nhiễm vào tế bào vật chủ, DNA tái tổ hợp mạch thẳng tạo vòng đầu cos tiếp nhân lên plasmid lớn Giống plasmid, cosmid tương đối dễ thao tác, nhận đoạn chèn genomic DNA có kích thước khoảng 40-45 kb, lớn khả phage λ 4 Các BAC vector Các BAC vector xem công cụ hữu hiệu việc xây dựng thư viện genome, chúng có ưu điểm sau: - Có khả gắn đại phân tử DNA 100-300 kb - Ít hình thành thể khảm (chimera) - Có hiệu cao tạo dòng thu hồi DNA - Duy trì ổn định DNA gắn vào vector Nhờ ưu điểm nên hệ thống BAC thường dùng để xây dựng đồ vật lý DNA dễ dàng phân lập dòng BAC, dòng phân lập từ lai khuẩn lạc kiểm tra kỹ thuật DNA fingerprinting thông qua phản ứng cắt enzyme hạn chế HindIII Kỹ thuật fingerprinting cung cấp cho thông tin phần trùng lặp (overlapping) không trùng lặp BAC Nhờ vậy, hoàn thiện đồ vật lý có chất lượng cao, phục vụ cho việc phân tích genome chuyển nạp gen sau Các YAC vector Các YAC nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men vector tạo dòng sử dụng phân tích genome Chúng mang đoạn telomere (phần cuối) centromere (phần tâm) nhiễm sắc thể nấm men Cả hai nhân tố cần thiết cho tái nhiễm sắc thể tế bào nấm men: telomere, sau đầu nhiễm sắc thể có khả bị rời gắn vào nhiễm sắc thể khác Nếu centromere, sau nhiễm sắc thể tạo thành không đẩy vào tế bào trình phân chia tế bào Ngoài ra, phải có gốc tái để chép DNA Các nhân tố đặt đoạn DNA đơn, dùng vector để tạo dòng DNA ngoại lai nấm men Ưu điểm YAC nhận đoạn DNA có kích thước lớn Như vậy, tạo dòng vi khuẩn theo phương pháp truyền thống cách dùng bacteriophage plasmid thường bị giới hạn kích thước đoạn DNA tạo dòng (chỉ vài chục kilobase), YAC tạo dòng đoạn DNA dài hàng ngàn kilobase Điều giúp cho việc lập đồ genome hoàn chỉnh dễ dàng nhiều Nhược điểm YAC kỹ thuật thao tác nhiều khó khăn, vấn đề chung DNA từ hai vùng khác genome gốc kết thúc YAC, dẫn đến xuất liên kết sai mà kết tạo dòng khảm III Đóng gói in vitro DNA tái tổ hợp xâm nhiễm vào tế bào vật chủ Trường hợp sử dụng vector mang gen ngoại lai bacteriophage λ cosmid để xây dựng thư viện genome, thể tái tổ hợp trần (naked recombinant) loại vector chuyển vào vi khuẩn Do đó, người ta cần phải đóng gói in vitro DNA chúng đầu rỗng phage λ , sau cho chúng xâm nhiễm vào tế bào vi khuẩn Nguyên lý đóng gói in vitro (in vitro packaging) nhờ vào khả mang đầu cos phage λ hai đầu 5’ 3’ vector tái tổ hợp để đóng gói chúng có mặt đầu rỗng phage protein đóng gói Phương thức đòi hỏi phân tử vector tái tổ hợp phải có chiều dài 38 kb không lớn 52 kb Các đầu phage đóng gói hoàn thiện tiểu thể phage xâm nhiễm in vitro có mặt sản phẩm gen W FII, đuôi phage Tất protein cần thiết cho đóng gói thu từ chủng E coli BHB2688 BHB2690 Các hỗn hợp đóng gói cần chuẩn bị lần bảo quản -80oC Tùy thuộc vào loại vector mà dùng lượng thích hợp chủng E coli cho việc xâm nhiễm Các chủng cho “đói” (starve) trước sử dụng, cách sinh trưởng môi trường tối thiểu sau xử lý với dung dịch CaCl2 0,1 M, cách rửa dung dịch CaCl2 0,1 M sau nhân lên môi trường LB1 Phương thức xử lý cảm ứng tổng hợp λ receptor (protein lamB) bề mặt tế bào tăng đáng kể hấp thụ phage vào tế bào E coli Các tiểu thể phage xâm nhiễm, thu có mặt protein phage hợp phần đuôi phage, dùng để xâm nhiễm vi khuẩn mẫn cảm (susceptible bacteria) Các dòng tái tổ hợp chọn lọc sở tính kháng kháng sinh chúng sau khuếch đại tiếp Sự xâm nhiễm thực cách ủ hỗn hợp tiểu thể phage xâm nhiễm thu sau đóng gói in vitro phân tử DNA tái tổ hợp với tế bào mẫn cảm (sensitive cell) vi khuẩn tiền xử lý Tiếp theo bước khuếch đại thư viện sau chuẩn độ (titration) thể tái tổ hợp Thư viện gen sau xây dựng bảo quản vài năm dạng dịch huyền phù o C, lâu dung dịch stock có bổ sung glycerol (khoảng 30%) -80oC IV Phân tích genomic DNA lai Southern Việc phát xác định chuỗi nucleic acid đặc trưng công việc thường xuyên nghiên cứu sinh học phân tử Nguyên tắc kỹ thuật dựa vào lai phân tử (molecular hybridization), điều kiện thích hợp hai chuỗi nucleic acid đơn tạo thành phân tử lai Phản ứng lai phụ thuộc nhiều vào mức độ tương đồng hai trình tự nucleotide Việc tạo thành phân tử sợi đôi xảy chủ yếu thông qua liên kết hydrogen base G với C, A với T Thành phần phân bố base không giống rõ rệt với phân tử nucleic acid cho kết tính chất lai khác nhau, liên kết hydrogen (hoặc lai phân tử base tương đồng) ghép cặp thích hợp cung cấp công cụ có giá trị để xác định chuỗi liên quan đồng với chuỗi nucleic acid quan tâm (mẫu dò) Trong số kỹ thuật khác sử dụng lai phân tử để phân tích nucleic acid, kỹ thuật sử dụng phổ biến lai mẫu dò nucleic acid đánh dấu với nucleic acid đích cố định vật đỡ rắn, thường màng nitrocellulose nylon Trình tự kỹ thuật lai Southern blot bao gồm bước sau: (1) phân tách đoạn cắt hạn chế genomic DNA điện di agarose gel, (2) chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai, (3) lai mẫu dò đánh dấu đồng vị phóng xạ 32P với nucleic acid cố định màng lai (Hình 5.2) Phân tách đoạn cắt hạn chế genomic DNA điện di agarose gel DNA mang chuỗi đích (chẳng hạn genomic DNA) cắt một vài enzyme hạn chế cho tập hợp đoạn có chiều dài khác phân đoạn theo kích thước điện di agarose gel Ở trường hợp genomic DNA hình ảnh điện di cho vệt dài (smear) gel (Hình 5.3) Lượng DNA dùng cho phản ứng cắt hạn chế tùy thuộc vào mức độ phong phú chuỗi đích (target) có mẫu Trường hợp genomic DNA, ta cần thủy phân lượng tương đối lớn DNA (2-10 m g) Nhưng mẫu DNA tạo dòng plasmid phage cần lượng DNA nhiều (một vài picogram) đủ Ảnh gel nhuộm EtBr xếp thẳng hàng với thước huỳnh quang trước thẩm tích bước quan trọng để đánh giá kích thước băng DNA lai với thị kích thước chuẩn DNA (DNA size-marker) DNA bacteriophage l phân cắt HindIII 1-kb ladder DNA thị kích thước chuẩn DNA thông dụng cho Southern blot Hình 5.2 Sơ đồ kỹ thuật lai Southern blot Các mẫu DNA đích genomic DNA ví dụ cắt EcoRI phân đoạn điện di agarose gel Các vị trí cắt hạn chế liên quan trình tự bổ sung với mẫu dò (đoạn dày) trình bày (A B) DNA plasmid mang đoạn chèn DNA dùng làm mẫu dò (C) cắt điện di để làm đối chứng dương tính Sau biến tính trung hòa, DNA sợi đơn chuyển lên màng lai, phương thức thẩm tích mao dẫn (capillary) phương thức thẩm tích nửa khô (semi-dry) nhờ dòng điện, cố định Để chuẩn bị mẫu dò, đoạn chèn DNA (đoạn dày đậm C) tinh từ vector cách cắt thu hồi sau điện di agarose gel, đánh dấu 32P gây biến tính Tiếp theo, màng lai liên kết DNA lai với mẫu dò, tín hiệu không đặc trưng bị loại bỏ, ủ màng lai với phim X-quang Sau rửa phim, đoạn DNA bổ sung với mẫu dò phát băng phóng xạ tự ghi Trên hình này, nguyên lý đa hình chiều dài đoạn cắt hạn chế mô tả Các DNA tách chiết từ hai mẫu riêng biệt (A B), mẫu B có thêm vị trí EcoRI chuỗi đích Sự khác genome phát kiểu lai khác Nguyên tắc khai thác nhiều ứng dụng sinh học phân tử Hình 5.3 Hình ảnh điện di genomic DNA sau phân cắt enzyme hạn chế SM: Chỉ thị kích thước chuẩn DNA PC: đối chứng dương tính (đoạn DNA dùng để đánh dấu 32P làm mẫu dò) Các đường 1, 2, 3, 4, 6: mẫu genomic DNA cắt enzyme hạn chế Chuyển DNA từ agarose gel lên màng lai Sau điện di gel trước thẩm tích, DNA khử purin (depurination) dung dịch HCl loãng để cắt nhỏ DNA tạo điều kiện dễ dàng để chuyển đoạn DNA có kích thước lớn lên màng Nhìn chung, bước khó kiểm soát làm đoạn DNA nhỏ Vì thế, có cách khắc phục việc đánh giá hình ảnh phóng xạ tự ghi bỏ qua bước Tuy nhiên, khử purin cần thiết phân tích Southern đoạn DNA có kích thước lớn Các loại màng lai sử dụng Southern màng nitrocellulose màng nylon Tuy nhiên màng nylon có sức chịu đựng cao màng nitrocellulose tái sử dụng vài lần nên chúng sử dụng phổ biến Hơn nữa, màng nylon gắn đoạn DNA ngắn ([...]... lại của tạo dòng, mô tả đặc điểm và lai phân tử bằng cách dùng các dòng như là mẫu dò để xác định các dòng xa hơn với thư viện mang chuỗi gần kề từ DNA gốc Chromosome walking thư ng được thực hiện với thư viện của cosmid, l hoặc YAC Chromosome walking cũng cho phép xây dựng một cấu trúc “clone contig” (một chuỗi tuần tự các dòng DNA gối chồng lên nhau cùng với sự hiện diện của vùng liền kề của genomic. .. genomic DNA) Cấu trúc clone contig thư ng tạo thành một phần cần thiết của việc phân tích các chuỗi DNA được tạo ra trong suốt quá trình xây dựng bản đồ vật lý của DNA và xác định các gen gây bệnh bằng tạo dòng vị trí (positional cloning) Cấu trúc clone contig được xây dựng bằng các vector khác nhau, bao gồm l , BAC, YAC… Xác định gen gây xơ nang đã minh họa cho việc sử dụng thư viện genomic DNA để... cách tạo dòng vị trí Các thư viện genomic DNA cũng hữu ích trong việc xác định các gen gây bệnh bằng cách tạo dòng chức năng (functional cloning) Theo hướng này, thông tin về chức năng của gen được khai thác để phân lập gen mong muốn từ thư viện Một oligonucleotide có trình tự dựa trên chuỗi amino acid từng phần được dùng như là một mẫu dò để phân lập dòng cDNA bằng cách sàng lọc thư viện cDNA Dòng cDNA... mồi (a) DNA được biến tính để tạo ra các phân tử sợi đơn (b) Một đoạn mồi oligonucleotide được bổ sung để gắn với sợi DNA khuôn mẫu (c) Enzyme DNA polymerase I xúc tác tổng hợp một bản sao mới của sợi khuôn mẫu bằng cách kéo dài đoạn mồi, trong quá trình đó các [ a -32P]dCTP (các vòng bôi đen) sẽ được đính vào bản sao ở các vị trí có G VII Ứng dụng của thư viện genomic DNA Thư viện genomic DNA có các... để tạo ra các nhóm 5 -OH (b) Tiếp đó, đuôi phosphate của [ g -32P]ATP (vòng tròn đậm trên hình) được chuyển sang gốc 5 -OH nhờ PNK Đây là phản ứng trao đổi các nhóm 5 -PO4 2 Đánh dấu bằng dịch chuyển điểm đứt Phương pháp này dựa vào enzyme DNA polymerase I của E coli có khả năng dịch chuyển điểm đứt của DNA (xem chương 1) Các điểm đứt có thể xuất hiện tự nhiên và cũng có thể do tác dụng của enzyme DNase... trong sàng lọc thư viện genome để phân lập các dòng genomic DNA và cho phép quan sát đặc điểm của chuỗi genome hoàn chỉnh Hướng này được dùng để xác định gen hemophilia A (nhân tố VIII) Các mẫu dò oligonucleotide dựa trên chuỗi amino acid của protein nhân tố VIII của lợn được sử dụng trước để phân lập dòng từ genome (nhân tố VIII của lợn), sau đó nó được dùng như là một mẫu dò cho thư viện DNA người để... nucleotide bị phá hủy trên mỗi sợi đơn DNA Kết quả hàng loạt các đoạn DNA có kích thư c khác nhau được tạo thành Các đoạn DNA tạo ra do bị bẻ gãy được phân ly trên polyacrylamide gel và chỉ có đoạn nào bị gắn 32 P ở đầu 5 mới quan sát được Kích thư c của chúng tương ứng với khoảng cách từ đầu 5 có đánh dấu đến vị trí của các nucleotide bị bẻ gãy trên phân tử DNA Sử dụng các chất hóa học khác nhau... Tuy nhiên, các hướng dựa trên sự biểu hiện nói chung dễ ứng dụng cho thư viện cDNA hơn là thư viện genomic DNA VI Các phương pháp đánh dấu đoạn DNA bằng phóng xạ Mục đích của bước này là sản xuất các đoạn DNA có độ phóng xạ và hoạt tính đặc hiệu cao để làm mẫu dò dùng trong các thí nghiệm lai phân tử Trong trường hợp này dấu phóng xạ thư ng được sử dụng là 32P phát xạ b năng lượng cao Dưới đây là một... DNA polymerase I sẽ được thay bằng DNA Taq polymerase Hình 5. 10 Đánh dấu DNA bằng dịch chuyển điểm đứt (a) Dùng DNase I tạo ra một điểm đứt trên sợi đơn của chuỗi DNA sợi đôi (b) Tiếp đó enzyme DNA polymerase I tổng hợp một bản sao mới của sợi khuôn mẫu khi phân hủy sợi có điểm đứt nhờ hoạt tính exonuclease 5 - 3’ của nó Nếu [ a -32P]dCTP được cung cấp thì nó sẽ gắn vào bản sao mới (các hình tròn bôi... được gắn vào các DNA sợi đơn Sử dụng enzyme DNA polymerase I có thể tổng hợp nên bản sao mới của sợi khuôn mẫu Nếu như một dNTP đã đánh dấu phóng xạ (ví dụ: [ a -32P]dCTP) được gắn vào, thì bản sao DNA mang hoạt họat tính đặc hiệu rất cao sẽ được tạo ra (Hình 5. 11) Cũng có thể dùng kỹ thuật PCR để đánh dấu phóng xạ đoạn DNA trong trường hợp muốn tạo ra một số lượng lớn mẫu dò Lúc này, enzyme DNA polymerase ... DNA tách từ mô khác để xây dựng thư viện genomic DNA Các thư viện genomic DNA thể chứa đoạn DNA dài ngắn khác thông tin di truyền không thay đổi Ngược lại, thư viện cDNA xây dựng từ mRNA Trong thể...Hình 5. 1 Xây dựng thư viện genomic DNA Các giai đoạn xây dựng thư viện DNA vector bacteriophage l a, b, c d trình bày khác (nhưng chồng lên nhau) đoạn DNA genome, hợp vector riêng rẽ đại diện dòng. .. nhiều thư viện cDNA khác đặc trưng cho loại tổ chức chuyên hóa (xem chương 6) II Tạo dòng đoạn DNA để xây dựng thư viện genome Các đoạn DNA thu từ phản ứng cắt hạn chế gắn đồng hóa trị in vitro vào