Nhận dạng các dòng cDNA quan tâm Chứa ít nhất một phần của chuỗi nucleic acid chính xác của dòng cDNA mong muốn. Tiến hành dưới các điều kiện nghiêm ngặt Một lượng không đổi của các nhánh bacteriophage λ được gắn với các lượng khác nhau của cDNA, mục đích là để xác định lượng cDNA tạo ra ít nhất là 5x106 bacteriophage tái tổ hợp.
BÀI THUYẾT TRÌNH CHƯƠNG NỘI DUNG TẠO DÒNG VÀ XÂY DỰNG THƯ VIỆN cDNA I.Tách chiết, tinh sạch, phân tích RNA II.Tổng hợp cDNA(complementary DNA) III.Tạo dòng phân tử cDNA sợi đôi IV.Các phương pháp tạo dòng cDNA khác V Các vector bacteriophage λ dùng tạo dòng cDNA VI.Nhận dạng dòng cDNA quan tâm VII.Xây dựng thư viện cDNA bacteriophage λ vector I Tách chiết, tinh sạch, phân tích RNA Tách chiết RNA tổng số Các Các nhân nhân tố tố ức ức chế chế protein protein của Rnase: Rnase: Các Các phức phức hợp hợp vanadyl-ribonucleoside vanadyl-ribonucleoside Kiểm soát hoạt tính ribonuclease(RNase) hoặc macaloid macaloid + Phân lập RNA poly(A) _tinh mRNA từ RNA tổng số Phân tích RNA Hình Phân tích biểu gen lai Northern • Hình phía điện di RNA tổng số(ở tiểu phần 16S, 18S) agarose gel biến tính formamide • Hình phía tín hiệu phóng xạ thu từ phản ứng lai RNA tổng số với mẫu dò đánh dấu 32 P Lai Dot Lai Dot Kafatos cộng (1979) thực cách : Chấm mẫu nhỏ dung dịch RNA lên màng nitrocellulose màng làm khô, lai với mẫu dò đặc trưng RNA DNA có đánh dấu 32 P ủ với phim X-quang Đơn Đơn giản giản để để nhận nhận biết biết cường cường độ độ biểu biểu hiện của 1 gen gen đặc đặc biệt biệt nào đó trong mô mô đặc đặc trưng trưng hoặc tế tế bào bào nuôi nuôi cấy cấy Khó Khó định định lượng lượng kích kích thước thước chính xác xác II Tổng hợp cDNA III.Tạo dòng phân tử cDNA sợi đôi Plasmid Plasmid của vi vi khuẩn khuẩn cDNA cDNA sợi sợi đôi đôi được phân phân tách tách thành thành các đoạn đoạn có có kích kích thước thước Gắn Gắn khác khác nhau Bacteriophage Bacteriophage λ λ vector vector Bổ sung đuôi đồng trùng Bổ sung đoạn nối nhân hợp tạo Đuôi đồng trùng hợp 1.1 Đuôi dA:dT Thông thường 50-150 50-150 gốc gốc dA dA gắn gắn vào vào DNA DNA vector vector Và Và 1 số số tương tương ứng ứng của gốc gốc dT dT vào vào cDNA cDNA sợi sợi đôi đôi Các bacteriophage λ dùng phổ biến Xây dựng thư viện sàng lọc mẫu dò nucleic acid λgt10 Nhận DNA ngoại lai vùng mã hóa gen ức chế cI Chèn đoạn DNA ngoại lai dài tới 7,6 kb Các bacteriophage λ dùng phổ biến Xây dựng thư viện sàng lọc mẫu dò miễn dịch λgt11 Có vị trí nhận biết đơn EcoRI nằm ngược hướng 53 bp codon kết thúc dịch mã gen lacZ Chèn đoạn DNA ngoại lai dài khoảng 7,2kb cDNA sợi đôi đầu mang liker SalI không cần phải bảo vệ methyl Dùng để tạo dòng định hướng không định Nguồn gốc từ vector λ11 Mang vùng tạo dòng vị trí EcoRI đơn λgt11 Vector λgt18 λgt19 hướng cDNA hóa trước cắt RET Các vị trí SacI XbaI loại bỏ cho vị trí XbaI vùng tạo Vị trí tổng hợp chi đưa vào vector Nguồn gốc từ λgt18 λgt19 Vector λgt20 λgt21 Cho phép tạo dòng định hướng cDNA vào Chỉ mang vị trí cắt hạn chế nhất: NotI, XbaI, SacI, SalI Nguồn gốc từ λgt18 λgt19 Vector λgt22 λgt23 EcoRI vi trí SalI NotI Các protein dung hợp biểu từ plasmid có số lượng lớn Có thể gắn đoạn cDNA dài khoảng 10kb Mang vùng tạo dòng hướng với promoter lacZ E coli Vector λZAP VI Nhận dạng các dòng cDNA quan tâm PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC Phương pháp sàng lọc Lai nucleic acid Lai nucleic acid Lai nucleic acid Các mẫu dò tương đồng • • Chứa phần chuỗi nucleic acid xác dòng cDNA mong muốn Tiến hành điều kiện nghiêm ngặt Các mẫu dò tương đồng phần • • Dùng để phát cDNA có quan hệ họ hàng không giống hệt Nếu mẫu dò sẵn thay đổi vài phương pháp Các mẫu dò oligonucleotide nhân tạo Là đoạn nucleotide trình tự xác định tổng hợp in vitro Phát các kháng nguyên miễn dịch đặc hiệu Các phương pháp xác nhận các dòng cDNA w.trungtamtinhoc.edu.vn Để Để đảm đảm bảo bảo mức mức độ độ chính xác xác của các dòng dòng cDNA cDNA thu thu được cần: cần: Protein phải thể hoạt tính sinh học enzyme xác Sự tương ứng phần chuỗi nucleotide với chuỗi amino acid Sự tương ứng đồ peptide chuỗi polypeptide protein đích thực Sự kết tủa miễm dịch polyypeptide tăng khả chống lại protein quan tâm Kết tủa miễn dịch protein đích thực với kháng thể tăng khả chống lại peptide tổng hợp VII.Xây dựng thư viện cDNA Loại Loại bỏ bỏ linker linker thừa thừa Size Size pt pt cDNA[...]... gắn với với các các lượng lượng khác khác nhau nhau của của cDNA, cDNA, mục đích là là để để 6 6 xác xác định định lượng lượng cDNA cDNA tạo tạo ra ra ít ít nhất nhất là là 5x10 5x10 bacteriophage bacteriophage tái tái tổ tổ hợp hợp 3 3 Phân Phân tích tích các các đoạn đoạn chèn chèn cDNA cDNA 4 4 Tạo Tạo thư thư viện viện cDNA cDNA hoàn hoàn chỉnh chỉnh Điêộ Điêộn n di di trên trên agarose... miễn dịch protein đích thực với kháng thể tăng khả năng chống lại các peptide tổng hợp VII.Xây dựng thư viện cDNA Loại Loại bỏ bỏ linker linker thừa thừa Size Size pt pt cDNA