Chương 4: CÁC VECTOR VÀ SỰ TẠO DÒNG docx

Vector tạo dịng và vector biểu hiện - Vector tạo dịng: chuyển và lưu trữ gene tái tổ hợp trong tế bào chủ.. - Vector biểu hiện: tạo ra sản phẩm của gene tái tổ hợp ở mức phiên mã, dịch m

I Các vector

1 Khái niệm

mang gene

2 Đặc điểm:

- Có khả năng sao chép độc lập

- Có thể thu nhận lượng lớn từ tế bào

gene mã hóa cho enzyme chuyển hóa cơ chất)

- Có những vị trí duy nhất của enzyme giới hạn

Chương 4 CÁC VECTOR VÀ SỰ TẠO DÒNG

I Các vector (tt)

3 Vector tạo dịng và vector biểu hiện

- Vector tạo dịng: chuyển và lưu trữ gene tái tổ hợp trong tế bào

chủ

- Vector biểu hiện: tạo ra sản phẩm của gene tái tổ hợp ở mức

phiên mã, dịch mã, phân tích trình tự điều hòa sự biểu hiện của gene

4 Phân loại:

- Có nhiều loại vector: plasmid, cosmid, phage…

loại vector phù hợp

Plasmid: DNA ngắn, dạng vòng, nằm ngoài nhiễm sắc thể, được tìm

thấy đầu tiên ở vi khuẩn

Plasmid thế hệ thứ I: plasmid tìm thấy trong tự nhiên

Plasmid thế hệ thứ II: plasmid nhân tạo, điển hình là pBR322

Plasmid thế hệ thứ III: plasmid mạnh nhất, có 2 đặc tính cơ bản:

- Kích thước nhỏ  sao chép nhanh chóng

- Có mang polylinker (vị trí chứa các trình tự nhận biết duy nhất của enzyme cắt giới)

Phage: virus xâm nhiễm và làm tan vi khuẩn Hiệu quả xâm nhiễm cao hơn chuyển plasmid vào vi khuẩn, nhưng thao tác phức tạp

Cosmid: vector nhân tạo, có thêm trình tự cos của phage λ.

Các vector là virus của Eukaryote như: retrovirus, SV 40, vaccinia,

adenovirus…

Nhiễm sắc thể nhân tạo của nấm men (YAC): vector tạo dòng những

đoạn DNA có kích thước lớn

II Các tế bào chủ

- Tế bào tiếp nhận vector:

+ Duy trì vector bền vũng trong tế bào

+ Cho phép sao mã (nhân bản sao) vector bên trong tế bào

+ Cho phép biểu hiện gen được mang bởi vector

- Tế bào chủ và vector phải tương thích với nhau về quá trình sao

mã, phiên mã và dịch mã

- Tế bào chủ thường không ở dạng tự nhiên mà là dạng đột biến chứa kiểu gen đáp ứng với vector và mục đích tạo dòng hoặc biểu hiện gen

- Tế bào chủ: tế bào vi khuẩn hoặc tế bào Eukaryote (tế bào động vật, thực vật, nấm men)

III Sự tạo dòng

Mục đích: thu được lượng lớn bản sao một trình tự DNA xác định Các bước cơ bản:

1 Chọn và xử lí vector:

2 Xử lí DNA cần tạo dòng.

3 Tạo vector tái tổ hợp.

4 Chuyển vector tái tổ hợp vào

tế bào chủ

5 Phát hiện dòng cần tìm

1 Chọn và xử lí vector:

Chọn vector phụ thuộc vào: kích thước DNA tạo dòng và mục đích

Sử dụng enzyme cắt hạn chế thích hợp để cắt mở vòng.

So sánh vector theo kích thước DNA mục tiêu

- Plasmid: nhỏ hơn 8kb (trừ plasmid từ F – BAC)

- Phage P1: đến 100kb

- Plasmid từ F (BAC): đến 300kb Vector mang được đoạn gen lớn cần cho việc thiết lập các ngân hàng gen

2 Xử lí DNA cần tạo dòng:

Cần xác định nguồn thu nhận DNA

Sử dụng phương pháp đặc hiệu thu nhận DNA mục tiêu : tách chiết DNA bộ gene; tổng hợp hóa học…

Xử lí DNA mục tiêu với enzyme cắt hạn chế thích hợp : sử dụng enzyme cắt tạo đầu so le hoặc enzyme tạo đầu bằng để tạo đầu tương thích với 2 đầu của vector đã xử lí.

3 Tạo vector tái tổ hợp

Thực hiện phản ứng nối giữa DNA mục tiêu và vector (theo tỉ lệ 3:1 hoặc 2:1).

4 Chuyển vector tái tổ hợp vào tế bào chủ:

Sử dụng bộ máy của tế bào chủ để sao chép vector tái tổ hợp

Phương pháp chuyển gene vào tế bào:

 Biến nạp (transformation):

- Biến nạp: sự tiếp nhận DNA trần bởi tế bào

- Các kĩ thuật sử dụng:

phức hợp DNA-calcium, chuyển vào tế bào qua cơ chế thực bào

cao, tạo lỗ thủng trên màng tế bào, DNA dễ xâm nhập vào bên trong

tế bào

bọc quanh những viên đạn cực nhỏ, hoặc được tiêm thẳng vào tế bào

Tạo tế bào E coli khả nạp (competent cell) và biến nạp DNA

- Đa số tế bào không có khả

năng biến nạp

- Tế bào có thể được xử lý

để trở nên có khả năng

tiếp nhận DNA trần: sự

tạo tế bào khả nạp

(competent cell)

- Nấm men: tạo competent cell bằng xử lý với lithium chloride hoặc lithium acetate; sử dụng xung điện (electroporation);

- Nấm mốc: electroporation, protoplast

-Tế bào thực vật: biến nạp bằng Agrobacterium tumefaciens

electroporation, súng bắn gene

- Tế bào động vật: biến nạp, vi tiêm

Chuyển gen vào tế bào khác vi khuẩn

a) Electroporation

Quá trình chuyển gene vào tế bào

nhờ vector là virus

Ưu điểm: hiệu quả chuyển gene

cao

Virus sử dụng trong quá trình tải

nạp được loại bỏ một phần bộ

gene, gắn thay vào đó đoạn

DNA cần nghiên cứu

Phương pháp chuyển gene vào tế bào (tt)

 Tải nạp (transduction):

Tách chiết thu nhận vector tái tổ hợp và kiểm tra bằng enzyme cắt.

Vector tái tổ hợp sẽ có kích thước lớn hơn vector ban đầu

Sử dụng mẫu dò:

- Kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa bởi gene cần tìm

- Trình tự DNA bổ sung cho gene cần tìm

5 Phát hiện dòng cần tìm

Phương pháp sử dụng kháng thể:

+ Có 1 kháng thể đặc trưng cho protein mã hóa

+ Vector sử dụng là vector cho phép dịch mã DNA thành protein

• Tổng hợp các trình tự DNA ngắn và đánh dấu ở đầu 5’ bằng đồng vị phóng xạ hoặc bằng hóa chất nhờ enzyme polynucleotide kinase

• Tiến hành lai các trình tự DNA ngắn trên với các dòng trong thư viện gene Dòng tái tổ hợp được phát hiện bằng kĩ thuật phóng

xạ hoặc tín hiệu màu

Phương pháp sử dụng trình tự DNA bổ sung cho gene cần tìm

IV Thư viện gene

Dựa vào bản chất của DNA cần tạo dòng, có 2 loại thư viện gene

- Thư viện bộ gene (genomic library): tập hợp tất cả các trình tự DNA cấu thành bộ gene đã được gắn vào vector

Cách tiến hành:

Tách chiết DNA bộ gene  cắt bộ gene thành những đoạn có kích thước xác định  dòng hóa vào vector  chuyển gene vào tế bào chủ 

nuôi cấy trên môi trường và tạo thành các dòng (clone).

Ứng dụng:

- Giải mã bộ gene.

- Tạo dòng các trình tự DNA không mã hóa

-Thư viện cDNA (cDNA library): tập hợp các bản sao của cDNA từ tất cả các mRNA của tế bào.

- Thư viện cDNA mang tính đặc trưng của tế bào rất cao vì chỉ có 1 số gene được phiên mã thành mRNA

-Kích thước của cDNA không lớn  chọn vector dòng hóa dễ dàng.

Cách tiến hành: tách chiết, thu nhận mRNA  cDNA  dòng hóa vào vector  chuyển gene vào tế bào chủ  nuôi cấy trên môi trường

và tạo thành các dòng (clone).

• Bài tập:

Cho gene A (kích thước 300 bp) có trình tự như sau:

Trình bày cách thu nhận và dòng hóa gene vào vector pEGFP-N1?

BamHI

Gene A

Xho

I

EcoRI

HindIII

SalI SalI