chương 5 các vecto và sự tạo dòng

Caực vector & sửù taùo doứng CHệễNG 5 rDNA không phải là nhân bản động vật Kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp là công cụ tìm hiểu cấu trúc, chức năng, và sự điều hòa của các gene và sản phẩm của gene. • Các mục đích của kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp gồm: – Nhận dạng các gene – Tách các gene – Điều chỉnh các gene – Tái biểu hiện các gene ở sinh vật hoặc cơ thể chủ khác • Cho phép các nhà khoa học: – Xác định các gene mã hóa và sản phẩm của chúng (breast cancer, retino-blastoma, và neurofibromatosis) – Điều trị các bệnh do gene (cystic fibrosis, rheumatoid arthritis, vascular disease, và certain cancers) – Sản xuất lượng lớn hormones, vaccines, và các hợp chất sinh học khác mà Y học quan tâm (Insulin, growth hormone, follicle-stimulating hormone) Vector Plasmid Vector tạo dòng là 1 phân tử DNA mang DNA ngoại lai vào tế bào chủ, sao chép trong tế bào vi khuẩn hoặc nấm men để tạo ra nhiều bản sao hoặc tao ra sản phẩm protein của DNA ngoại lai. Đặc trưng chính của các vector tạo dòng: • Có trình tự cho phép sự tự sao chép trong vi khuẩn hay nấm men • Có vị trí để chèn DNA ngoại lai. Hầu hết các vector có trình tự cắt duy nhất của nhiều enzyme cắt giới hạn (MCS) • Một phương pháp để nhận biết tế bào có chứa vector, thường là các marker chọn lọc tính kháng kháng sinh. Các loại vector • Plasmid – DNA dạng vòng tự sao chép nhân đôi trong tế bào vi khuẩn. Khả năng dòng hóa: 0.1-10 kilobases (kb) • Phage – dẫn xuất của bacteriophage lambda; phân tử DNA thẳng có thể được thay thế bằng DNA ngoại lai mà không làm gián đoạn vòng đời của nó. Khả năng dòng hóa: 8-20 Kb • Cosmids – DNA dạng vòng kết hợp các tính năng của plasmid và phage. Khả năng dòng hóa: 35-50 Kb • Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn (BAC) – dựa trên mini-plasmid F của vi khuẩn. Khả năng dòng hóa: 75-300 Kb • Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men (YAC) – một nhiễm sắc thể nhân tạo có chứa telomeres, nguồn gốc của sao chép (ori), centromere của nấm men, và marker để lựa chọn xác định các tế bào nấm men. Khả năng dòng hóa: 100-1000 Kb Plasmid Vectors Điện di trên gel agarose plasmid tự nhiên Plasmid nhân tạo đầu tiên pBR322 (High-Copy-Number) Plasmid tự nhiên ColE1 Plasmid tự nhiên (low copy number) pSC101 The pUC 18 or 19 Cloning Vector (Very high copy number) RE Sites in blue occur only once in the plasmid Lac Z α Origin of Replication Multiple Cloning Site Promotor Site Antibiotic Resistance Gene MCS – Multi Cloning Site  Các vị trí cắt duy nhất  Chèn/cắt đoạn DNA ngoại lai dễ dàng  Subcloning dễ dàng hơn [...]... hạn chính của tạo dòng sử dụng plasmid • Giới hạn tối đa của kích thước DNA tạo dòng là 10 kb • Cần chuẩn bị các tế bào chủ khả nạp • Khơng hiệu quả khi tạo genomic libraries vì các vùng trùng lặp cần thiết để tạo ra trình tự thích hợp • Thích số lượng clone nhỏ để biến nạp • Tạo ra các vùng gene lớn nhưng rời rạc • Nếu bộ gene của E coli chứa 4,639,221 bp, cần bao nhiêu clone để tạo dòng cả bộ genome?... trí cos, ori, và marker chọn lọc Đóng gói in vitro tạo thành 1 plasmid lớn (50 kb) trong E coli • Cosmids được tách chiết từ vi khuẩn và cắt với enzyme cắt giới hạn • DNA ngoại lai cũng được cắt với cùng enzyme cắt giới hạn và trộn với cosmid đã cắt Cosmid tái tổ hợp được đóng gói vào virus và cho nhiễm vào vi khuẩn • rcosmid sắp xếp tạo vòng và sao chép như 1 plasmid Shown above is a 50 ,000 base-pair... tryptophan) • Cũng có E coli ori và marker chọn lọc, nên có thể sao chép trong E coli Sau đó được tách chiết, tinh sạch, nối với DNA ngoại lai và chuyển vào trong nấm men Vector biểu hiện Tạo RNA và protein từ đoạn DNA chèn vào – Chỉ tạo RNA: vector chứa T7 promoter trước vị trí chèn và 1 gene có thể cảm ứng mã hóa cho T7 polymerase Cảm ứng bằng gen ức chế của lac operon và chất cảm ứng tổng hợp IPTG... cho con đường lytic Các đoạn của DNA Lambda bị loại bỏ và một mảnh stuffer được giữ lại • Đoạn stuffer này giữ cho kích thước vector đúng và có mang gen marker Khi DNA ngoại lai được chèn vào vector, marker bị bất hoạt • Ví dụ: Charon 4A Lambda Khi Charon 4A Lambda là còn ngun vẹn, beta-galactosidase phản ứng với X-gal và các khuẩn lạc có màu xanh lam Khi các đoạn DNA ngoại lai chèn vào khu vực stuffer,... 33-48 kb) được dòng hóa, đóng gói vào virus và virus được cho nhiễm vào E.coli Cosmid có thể sao chép trong TB vi khuẩn do đó các TB nhiễm phát triển tạo các khuẩn lạc bình thường DNA chèn được giới hạn sao cho có thể nhồi vào vỏ của phage Khơng ổn định, khó duy trì ori TetR 21 .5 kb cos EcoRI Chỉ Cos site cần thiết cho việc đóng gói vào phage • Cosmids tương tự như phage vector: sử dụng lambda, nhưng loại... Một số vector mới hơn như pUC thiếu nic / bom và khơng thể linh động Asilomar Conference Người ta tin rằng "an tồn" của các chủng vi khuẩn, vi rút và vectơ có thể được thực hiện trong một vài tuần NIH thành lập Ban tư vấn về DNA tái tổ hợp (RAC) Phải mất năm 1 (1976) trước khi dòng "an tồn" E.coli đầu tiên (loại EK2) đã được tạo ra Năm đó, RAC phát hành một bộ ngun tắc đòi hỏi việc sử dụng các vi khuẩn... khơng thể duy trì trong cùng 1 vi khuẩn Hơn 30 nhóm khơng tương thích được biết Plasmid Replicon Copy Number pBR 322 and its derivatives pMB1 15- 20 pUC vectors pMB1 50 0-700 pACYC and its derivatives p15A 10-12 pSC101 and its derivatives pSC101 ~5 ColE1 ColE1 15- 20 Sự an tồn của plasmid Một số plasmid tự nhiên có thể được chuyển giao cho TB khác bằng conjugation Conjugation đòi hỏi ba yếu tố: – Một gen... http://homer.ornl.gov/cbps/afmimaging.htm Các vector khác • Nhiễm sắc thể nhân tạo vi khuẩn – BACs (Bacterial artificial chromosomes) – Là plasmid lớn nhưng có số lượng thấp (có ori và marker chọn lọc) – Có thể điện biến nạp vào E coli – Hữu dụng trong giải trình tự bộ gen vì đoạn chèn có kích thước 100 - 300kb • Nhiễm sắc thể nhân tạo nấm men – YAC (Yeast Artificial Chromosome) – Có thể sao chép trong E.coli và Yeast – Là chromosome... telomeres, và 1 centromere – Có thể nhận 200 kb -1000 kb; hữu dụng trong giải trình tự • Ti plasmids: để chuyển gen vào thực vật • Các vector biểu hiện • Vector con thoi (shuttle vector): có thể sao chép ở 2 lồi khác Yeast Artificial Chromosomes • Một chromosome thẳng, có centromere, telomeres, ARS (trình tự sao chép tự động – autonomously replicating sequence), marker chọn lọc trong nấm men (thường là các. .. clone để tạo dòng cả bộ genome? • Nếu là vector biểu hiện thì các giới hạn liên quan đến biểu hiện protein của eukaryote Bacteriophage lambda (λ) In 1971 Alan Campbell showed that the central third of the genome was not required for lytic growth People started to replace it with E coli DNA http://phage.bocklabs.wisc.edu/Virus.htm Các vector tạo dòng là phage • Vector phage có thể chứa đoạn DNA ngoại . Caực vector & sửù taùo doứng CHệễNG 5 rDNA không phải là nhân bản động vật Kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp là công cụ tìm hiểu cấu trúc, chức năng, và sự điều hòa của các gene và sản phẩm. gene. • Các mục đích của kỹ thuật tạo DNA tái tổ hợp gồm: – Nhận dạng các gene – Tách các gene – Điều chỉnh các gene – Tái biểu hiện các gene ở sinh vật hoặc cơ thể chủ khác • Cho phép các nhà. vaccines, và các hợp chất sinh học khác mà Y học quan tâm (Insulin, growth hormone, follicle-stimulating hormone) Vector Plasmid Vector tạo dòng là 1 phân tử DNA mang DNA ngoại lai vào tế bào