Nghiên cứu giá trị của GP73 trong chẩn đoán ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm virus viêm gan b

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Thanh Huyền NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA GP73 TRONG CHẨN ĐOÁN UNG THƢ GAN TRÊN BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Thanh Huyền NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA GP73 TRONG CHẨN ĐOÁN UNG THƢ GAN TRÊN BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Lê Hữu Song PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Hà Nội - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn công trình nghiên cứu thực thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Lê Hữu Song – Bệnh viện TƯQĐ 108, PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Các số liệu, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa công bố hình thức Tôi xin chịu trách nhiệm kết nghiên cứu Học viên Trần Thị Thanh Huyền LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Hữu Song – Bệnh viện TƯQĐ 108; PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung – Bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS TS BS Phan Quốc Hoàn tạo điều kiện để thực luận văn khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; tới anh chị khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 giúp đỡ động viên suốt thời gian qua Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Sinh học Tế bào lãnh đạo Khoa Sinh học giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Trần Thị Thanh Huyền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tình hình dịch tễ học bệnh ung thƣ gan 1.1.1 Dịch tễ học giới 1.1.2 Dịch tễ học Việt Nam 1.2 Nguyên nhân yếu tố nguy gây ung thƣ gan 1.3 Mối liên quan nhiễm HBV với ung thƣ gan 1.4 Chẩn đoán ung thƣ biểu mô tế bào gan 1.4.1 Khám lâm sàng 1.4.2 Xét nghiệm cận lâm sàng 1.4.3 Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh 1.4.4 Chọc hút tế bào sinh thiết khối u 11 1.5 Tổng quan GP73 11 1.5.1 Đặc điểm sinh học GP73 11 1.5.2 Mức độ biểu protein GP73 13 1.5.3 Điều hòa biểu gen GP73 14 1.5.4 Ý nghĩa GP73 chẩn đoán HCC 15 1.6 Tình hình nghiên cứu dấu ấn phân tử HCC 16 1.7 Các phƣơng pháp đánh giá mức độ biểu gen 18 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 21 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 21 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 22 2.2 Vật liệu thiết bị nghiên cứu 22 2.2.1 Các hoá chất, sinh phẩm 22 2.2.2 Các máy thiết bị sử dụng nghiên cứu 23 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 23 2.3.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm 23 2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu 24 2.3.3 Xác định mức độ biểu gen mARN GP73 24 2.3.4 Định lượng protein GP73 kỹ thuật ELISA 29 2.3.5 Các phương pháp định lượng AFP, sinh hoá, hoá nghiệm 31 2.3.6 Xét nghiệm định lượng HBV-ADN 32 2.3.7 Phân tích xử lý số liệu 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33 3.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu 33 3.1.1 Đặc điểm tuổi giới 33 3.1.2 Đặc điểm số số cận lâm sàng thông thường 33 3.2 So sánh nồng độ HBV–ADN nhóm nghiên cứu 36 3.3 Xác định mức độ biểu GP73 38 3.3.1 Xác định mức độ biểu gen mARN GP73 43 3.3.2 Xác định mức độ biểu gen protein GP73 49 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc tần suất tử vong số bệnh ung thư điển hình giới (Globocan – 2012) .3 Hình 1.2: Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc tần suất tử vong số bệnh ung thư điển hình Việt Nam (Globocan – 2012) .4 Hình 1.3: Các nguyên nhân gây ung thư Hình 1.4: Cấu trúc GP73 sGP73 12 Hình 2.1: Nguyên lí phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman 28 Hình 3.1: So sánh nồng độ HBV-ADN nhóm bệnh gan 36 Hình 3.2: Kết giải trình tự gen GP73 44 Hình 3.3: Hình ảnh tín hiệu huỳnh quang Realtime PCR gen GP73 gen nội chuẩn ABL .44 Hình 3.4: So sánh mức độ biểu mARN GP73 nhóm bệnh nhân nhóm người khỏe mạnh 46 Hình 3.5: So sánh mức độ biểu mARN GP73 nhóm nghiên cứu .47 Hình 3.6: Đường cong ROC mARN GP73 AFP 47 Hình 3.7: Nồng độ protein GP73 49 Hình 3.8: So sánh mức độ biểu protein GP73 nhóm bệnh nhân nhóm người khỏe mạnh 50 Hình 3.9: So sánh mức độ biểu protein GP73 nhóm nghiên cứu .51 Hình 3.10: Đường cong ROC protein GP73 AFP 52 DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu 22 Bảng 2.2: Danh mục thiết bị 23 Bảng 3.1: Đặc điểm tuổi giới nhóm nghiên cứu 33 Bảng 3.2: Đặc điểm số cận lâm sàng nhóm nghiên cứu 33 Bảng 3.3: So sánh nồng độ AFP nhóm nghiên cứu 34 Bảng 3.4: Tính chất khối U gan phân loại mức độ bệnh theo Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) 35 Bảng 3.5: So sánh nồng độ HBV–ADN nhóm nghiên cứu .36 Bảng 6: Nồng độ đo OD độ ARN .44 Bảng 3.7: Kết định lượng tương đối mARN .45 Bảng 3.8: So sánh mức độ biểu mARN GP73 nhóm bệnh gan nhóm người khỏe mạnh .45 Bảng 3.9: So sánh mức độ biểu gen mARN GP73 nhóm nghiên cứu 46 Bảng 3.10: Nồng độ đo OD protein GP73 49 Bảng 3.11: So sánh mức độ biểu protein GP73 nhóm bệnh gan nhóm người khỏe mạnh 50 Bảng 3.12: So sánh mức độ biểu protein GP73 nhóm nghiên cứu 51 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFP : Alpha Feto Protein bp : base pair cADN : complementary ADN dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate ADN : Acid deoxyribonucleic ABL : Abelson ARN : Acid ribonucleic ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch gắn men) GOLM1 : Golgi Membrane Protein GP73 : Golgi protein 73 HBsAg : Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B) HBV : Hepatitis B virus (Virus viêm gan B) HCC : Hepatocellular carcinoma (Ung thư tế bào gan nguyên phát) CHB : Chronic hepatitis (Viêm gan B mạn tính) CH : Healthy control (Nhóm người khỏe mạnh) LC : Liver cirrhosis (Xơ gan) M-MLV : Moloney Murine Leukemia Virus mARN : Messenger ARN PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Real Time PCR : Real Time Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp tính theo thời gian thực) RT- PCR : Reverse transcriptase Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp sử dụng enzyme phiên mã ngược) RT : Reverse transcription (Quá trình phiên mã ngược) ROC curve : Receiver operating characteristic curve – đường cong ROC VGM : Viêm gan mạn VRVGB : Virus viêm gan B 3.3.2.4 So sánh mức độ biểu protein GP73 nhóm nghiên cứu Bảng 3.12: So sánh mức độ biểu protein GP73 nhóm nghiên cứu Chỉ số Nhóm NC Protein (mean±SD) HCC (n=20) (1) 242,65 ± 50,36 LC (n=20) (2) 298,13 ± 116,95 CHB (n=20) (3) 285,08 ± 87,84 HC (n=20) (4) 243,55 ± 126,65 p1-2 = 0,78 p p1-3 = 0,09 p1-4 =0,97 Hình 3.9: So sánh mức độ biểu protein GP73 nhóm nghiên cứu Nhận xét: Mức độ biểu protein GP73 nhóm xơ gan (LC) cao thấp nhóm người khỏe mạnh (HC), khác biệt (p>0,05) 51 3.3.2.5 So sánh giá trị chẩn đoán protein GP73 AFP Hình 3.10: Đƣờng cong ROC protein GP73 AFP Nhận xét: Đường cong ROC vẽ để xác định giá trị cắt tối ưu để xác định độ nhạy độ đặc hiệu protein GP73 AFP Diện tích đường cong AUROC AFP 0,906 (95% CI = 0,815 – 0,996), giá trị điểm cắt AFP = 20,27 có độ nhạy 80%, độ đặc hiệu 100% chẩn đoán HCC Protein GP73 giá trị điểm cắt protein GP73 = 253,46 có độ nhạy 35,3% độ đặc hiệu 35,0% chẩn đoán HCC Phương pháp sử dụng để phát protein GP73 huyết tương phương pháp bán định lượng Western blotting, phương pháp tốn kém, lại tốn thời gian Đã có nhiều nghiên cứu đánh giá mức độ biểu gen GP73 thông qua protein sử dụng phương pháp ELISA Block cộng chứng minh mức độ biểu protein GP73 huyết tăng ung thư gan có HBV [7] Một nghiên cứu khác Marrero cộng nghiên cứu cho mức độ biểu GP73 huyết cao đáng kể bệnh nhân HCC so với bệnh nhân xơ gan với độ nhạy 62% độ đặc hiệu 71% AFP 20 100ng/ml Các tác giả báo cáo độ nhạy độ đặc hiệu GP73 69% 75%, AFP 30% 96% Điều cho thấy ý nghĩa GP73 chẩn đoán HCC bệnh nhân bình thường bệnh nhân có AFP tăng nhẹ [48] 52 Gu cộng phát triển phương pháp Sandwich ELISA để xác định nồng độ protein GP73 Tác giả nghiên cứu tổng số 263 bệnh nhân 155 bệnh nhân bệnh gan (57 bệnh nhân viêm gan mạn tính, 69 bệnh nhân xơ gan, 29 bệnh nhân HCC), 36 bệnh nhân bị bệnh khác 72 người khỏe mạnh, qua trình nghiên cứu tác giả cho thấy nồng độ protein GP73 bệnh nhân bị gan cao gấp lần so với người khỏe mạnh Tuy nhiên, nồng độ protein GP73 không khác biệt đáng kể nhóm bệnh gan Hơn nữa, GP73 không cao đáng kể bệnh nhân bị bệnh khác gan so với người khỏe mạnh [20] Một nghiên cứu khác tác giả Ozkan H cộng nghiên cứu mức độ biểu GP73 nhóm bệnh nhân ung thư gan, xơ gan người khỏe mạnh Tác giả cho thấy nồng độ protein GP73 tìm thấy huyết tất bệnh nhân, nhiên so sánh nhóm với khác biệt ý nghĩa thống kê (p = 0,373), so sánh GP73 với AFP cho thấy GP73 có độ nhạy độ đặc hiệu thấp AFP [52] Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Để đánh giá mức độ biểu protein GP73 sử dụng Kit Elisa để xác định nồng độ protein GP73 huyết tương nhóm bệnh nhân viêm gan nhóm người khỏe mạnh Đây phương pháp phổ biến sử dụng rộng rãi, với ưu điểm nhanh, đơn giản, không đòi hỏi nhiều trang thiết bị đại, đắt tiền Kết nghiên cứu cho thấy mức độ biểu protein GP73 nhóm bệnh gan nhóm chứng người khỏe mạnh có khác không đáng kể (p = 0,219) So sánh nồng độ protein GP73 nhóm bệnh nhân nghiên cứu cho thấy nồng độ protein GP73 nhóm bệnh nhân bệnh gan cao nhóm khỏe mạnh cao nhóm xơ gan (LC), khác biệt ý nghĩa thống kê với p>0,05 Đánh giá giá trị GP73 so với AFP chẩn đoán ung thư gan thấy GP73 có độ nhạy độ đặc hiệu thấp AFP Kết lần khẳng định mức độ biểu gen GP73 có tăng cao nhóm bệnh nhân ung thư gan (mRNA) xơ gan (protein) so với nhóm bệnh gan khác HBV cao so với nhóm khỏe mạnh 53 khác biệt ý nghĩa thống kê, p>0,05 Do vậy, liệu giá trị chẩn đoán GP73 cần phải nghiên cứu thêm để khẳng định vai trò giá trị chẩn đoán HCC 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Qua nghiên cứu tìm hiểu giá trị mARN GP73 protein GP73 nhóm bệnh nhân nhiễm vi rút viêm gan B rút số kết luận sau: Mức độ biểu gen mARN GP73 protein GP73 khác biệt đáng kể nhóm nghiên cứu So sánh với AFP mARN GP73 protein GP73 có giá trị chẩn đoán ung thư gan có HBV dương tính KIẾN NGHỊ Mặc dù GP73 đề xuất dấu ấn phân tử cho chẩn đoán sớm ung thư gan số tác giả nước công bố Tuy nhiên nghiên cứu số lượng bệnh nhân hạn chế Do vậy, để đánh giá xác vai trò GP73 cần phải tiến hành nghiên cứu với quy mô lớn Đồng thời tiếp tục tìm kiếm dấu ấn phân tử khác góp phần cho chẩn đoán sớm ung thư gan 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 12 13 14 15 16 A H S R a A L (2000), "Tumours of the Liver and Intrahepatic Bile Ducts", World Health Organization Classfication of Tumors, IARC press, pp 158-202 al A H e (2012), "Development of Hepatocellular Carcinoma Associated with Anabolic Androgenic Steroid Abuse in a Young Bodybuilder: A Case Report", Case Reports in Pathology, 2012 al E M e (2003), "Cancer risk in patients with hereditary hemochromatosis and in their first-degree relatives", Gastroenterology, 125(6), pp 1733-1741 al F T e (2014), "Alcohol and liver cancer: a systematic review and meta-analysis of prospective studies", Annals of Oncology, 25, pp 1526-1535 Bagnardi V B M., La Vecchia C et al (2001), "A meta-analysis of alcohol drinking and cancer risk", Br J Cancer, 85, pp 1700-1705 Beillard E., Pallisgaard N., van der Velden V H et al (2003), "Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using 'real-time' quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) - a Europe against cancer program", Leukemia, 17(12), pp 2474-86 Block TM C M., Lowman M, Steel LF, Romano PR, Fimmel C, et al (2005), "Use of targeted glycoproteomics to identify serum glycoproteins that correlate with liver cancer in woodchucks and humans", Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp 779-784 Bosch F X., Ribes J., Diaz M et al (2004), "Primary liver cancer: worldwide incidence and trends", Gastroenterology, 127(5 Suppl 1), pp S5-S16 Chen C J., Yang H I., Su J et al (2006), "Risk of hepatocellular carcinoma across a biological gradient of serum hepatitis B virus DNA level", JAMA, 295(1), pp 6573 Clark M F., Adams A N (1977), "Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses", J Gen Virol, 34(3), pp 475-83 Claudio Pelucchi S D S G., Sc.D.; Werner Garavello, M.D.; Cristina Bosetti, Sc.D.; and Carlo La Vecchia, M.D (2006), "Cancer risk associated with alcohol and tobacco use: focus on upper aerdisgetive tract and liver", Health risks, 29(3), pp 193-198 Diseases A A f t S o L (2010), "Management of Hepatocellular Carcinoma: An Update", HEPATOLOGY, Vol 000, No 000, pp 1-35 Donati M., Brancato G., Donati A (2010), "Clinical biomarkers in hepatocellular carcinoma (HCC)", Front Biosci (Schol Ed), 2, pp 571-7 Donato F T A., Gelatti U, Parrinello G, Boffetta P, Albertini A, Decarli A, Trevisi P, Ribero ML, Martelli C, Porru S, Nardi G (2002), "Alcohol and hepatocellular carcinoma: the effect of lifetime intake and hepatitis virus infections in men and women.", Am J Epidemiol., 155(4), pp 323-331 Engvall E., Perlmann P (1971), "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Quantitative assay of immunoglobulin G", Immunochemistry, 8(9), pp 871-4 Fattovich G., Stroffolini T., Zagni I et al (2004), "Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors", Gastroenterology, 127(5 Suppl 1), pp S35-50 56 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 Fimmel C J., Wright L (2009), "Golgi protein 73 as a biomarker of hepatocellular cancer: development of a quantitative serum assay and expression studies in hepatic and extrahepatic malignancies", Hepatology, 49(5), pp 1421-3 Forner A R M., Bruix J (2009), "Alpha-fetoprotein for hepatocellular carcinoma diagnosis: the desmise of abrilliant star", Gastroenterology, 137 Goh C W a K (2006), "Chronic hepatitis B infection and liver cancer", Biomed Imaging Interv J, 2(3) Gu Y., Chen W., Zhao Y et al (2009), "Quantitative analysis of elevated serum Golgi protein-73 expression in patients with liver diseases", Ann Clin Biochem, 46(Pt 1), pp 38-43 Hashem B El-Serag M D., M.P.H (2011), "Hepatocellular Carcinoma", The New England journal of medicine, 365, pp 1118-1127 Hayashi PH D B A (2005), "The progression of hepatitis B- and C-infections to chronic liver disease and hepatocellular carcinoma: epidemiology and pathogenesis.", Med Clin North Am., 89(2), pp 371-389 HB E.-S (2001), "Epidemiology of hepatocellular carcinoma", Clin Liver Dis, 5, pp 87-107 Hu J S., Wu D W., Liang S et al (2010), "GP73, a resident Golgi glycoprotein, is sensibility and specificity for hepatocellular carcinoma of diagnosis in a hepatitis Bendemic Asian population", Med Oncol, 27(2), pp 339-45 Iain H McKillop L W S (2005), "Alcohol and liver cancer", Alcohol, 35, pp 195203 Iftikhar R., Kladney R D., Havlioglu N et al (2004), "Disease- and cell-specific expression of GP73 in human liver disease", Am J Gastroenterol, 99(6), pp 108795 Iloeje U H., Yang H I., Su J et al (2006), "Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating hepatitis B viral load", Gastroenterology, 130(3), pp 678-86 J F., I S., M E et al (2013), "GLOBOCAN 2012 cancer incidence and mortality worldwide: IARC cancerbase", International Agency for Research on Cancer, 11 Jordi Bruix M S (2010), "Management of Hepatocellular Carcinoma: An Update", AASLD PRACTICE GUIDELINE, HEPATOLOGY, Vol 000, No 000, 2010 Kang J E., Hwang S H., Lee J H et al (2011), "Effects of RBC removal and TRIzol of peripheral blood samples on RNA stability", Clin Chim Acta, 412(19-20), pp 1883-5 Kladney R D., Bulla G A., Guo L et al (2000), "GP73, a novel Golgi-localized protein upregulated by viral infection", Gene, 249(1-2), pp 53-65 Kladney R D., Cui X., Bulla G A et al (2002), "Expression of GP73, a resident Golgi membrane protein, in viral and nonviral liver disease", Hepatology, 35(6), pp 1431-40 Kladney R D., Tollefson A E., Wold W S et al (2002), "Upregulation of the Golgi protein GP73 by adenovirus infection requires the E1A CtBP interaction domain", Virology, 301(2), pp 236-46 Ko SC F L., Smith EA, Fenlon N, Koneru AK, Murphy TV (2014), "Estimated Annual Perinatal Hepatitis B Virus Infections in the United States, 2000-2009", J Pediatric Infect Dis Soc Kumada T., Toyoda H., Kiriyama S et al (2010), "Incidence of hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis B virus infection who have normal alanine aminotransferase values", J Med Virol, 82(4), pp 539-45 57 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 La Vecchia C N E., Cavalieri d’Oro L et al (1998), "Liver cirrhosis and the risk of primary liver cancer", Eur J Cancer Prev, 7, pp 315-320 Larsson SC W A (2007), "Overweight, obesity and risk of liver cancer: a metaanalysis of cohort studies", Br J Cancer, 97(1005-1008) Liu Y C C., Marsh GM, Wu F (2012), "Population attributable risk of aflatoxinrelated liver cancer: systematic review and meta-analysis", Eur J Cancer Prev, 48(14), pp 2125-2136 Livak K J., Schmittgen T D (2001), "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method", Methods, 25(4), pp 402-8 LONDON W T A M., K.A (1996), "Liver cancer", Cancer Epidemiology and Prevention, pp 772-793 Luis Jesuino de Oliveria Andrade A D O., Junior, Rosangela Carvalho Melo,1 Emmanuel Conrado De Souza,1 Carolina Alves Costa Silva, and Raymundo Paraná (2009), "Association Between Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma", J Glob Infect Dis., 1(1), pp 33-37 Maitra A., Thuluvath P J (2004), "GP73 and liver disease: a (Golgi) complex enigma", Am J Gastroenterol, 99(6), pp 1096-8 Malaguarnera G., Giordano M., Paladina I et al (2010), "Serum markers of hepatocellular carcinoma", Dig Dis Sci, 55(10), pp 2744-55 Manno M., Camma C., Schepis F et al (2004), "Natural history of chronic HBV carriers in northern Italy: morbidity and mortality after 30 years", Gastroenterology, 127(3), pp 756-63 Mao Y., Yang H., Xu H et al (2010), "Golgi protein 73 (GOLPH2) is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma", Gut, 59(12), pp 1687-93 Mao Y L., Yang H Y., Xu H F et al (2008), "[Significance of Golgi glycoprotein 73, a new tumor marker in diagnosis of hepatocellular carcinoma: a primary study]", Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 88(14), pp 948-51 Marcello Donati G B., Angelo Donati (2010), "Clinical biomarkers in hepatocellular carcinoma", Frontiers in Bioscience S2, pp 571-577 Marrero J A., Romano P R., Nikolaeva O et al (2005), "GP73, a resident Golgi glycoprotein, is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma", J Hepatol, 43(6), pp 1007-12 McMahon B J., Alberts S R., Wainwright R B et al (1990), "Hepatitis B-related sequelae Prospective study in 1400 hepatitis B surface antigen-positive Alaska native carriers", Arch Intern Med, 150(5), pp 1051-4 Mizuguchi T., Katsuramaki T., Nobuoka T et al (2004), "Serum hyaluronate level for predicting subclinical liver dysfunction after hepatectomy", World J Surg, 28(10), pp 971-6 Nguyen V T., Law M G., Dore G J (2008), "An enormous hepatitis B virusrelated liver disease burden projected in Vietnam by 2025", Liver Int, 28(4), pp 525-31 Ozkan H., Erdal H., Tutkak H et al (2011), "Diagnostic and prognostic validity of Golgi protein 73 in hepatocellular carcinoma", Digestion, 83(1-2), pp 83-8 Pilia G., Hughes-Benzie R M., MacKenzie A et al (1996), "Mutations in GPC3, a glypican gene, cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome", Nat Genet, 12(3), pp 241-7 58 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 Sangiovanni A D N E., Fasani P, De Fazio C, Ronchi G, Romeo R, Morabito A, De Franchis R, Colombo M (2004), "Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance.", Gastroenterology, 126(4), pp 1005-1014 Sherlock S., Fox R A., Niazi S P et al (1970), "Chronic liver disease and primary liver-cell cancer with hepatitis-associated (Australia) antigen in serum", Lancet, 1(7659), pp 1243-7 Shi Y., Chen J., Li L et al (2011), "A study of diagnostic value of golgi protein GP73 and its genetic assay in primary hepatic carcinoma", Technol Cancer Res Treat, 10(3), pp 287-94 Van Weemen B K., Schuurs A H (1971), "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates", FEBS Lett, 15(3), pp 232-236 Wang Y W B., Shen F et al (2012), "Body mass index and risk of primary liver cancer: a meta-analysis of prospective studies", Oncologist, 17, pp 1461-1468 WHO (2015), "Hepatitis B" WHO (2015), "Hepatitis C" Willyard C (2007), "Researchers look for 'sweet' method to diagnose cancer", Nat Med, 13(11), pp 1267 Wright L M., Huster D., Lutsenko S et al (2009), "Hepatocyte GP73 expression in Wilson disease", J Hepatol, 51(3), pp 557-64 Wright L M., Yong S., Picken M M et al (2009), "Decreased survival and hepatorenal pathology in mice with C-terminally truncated GP73 (GOLPH2)", Int J Clin Exp Pathol, 2(1), pp 34-47 Wu F S., Zheng S S., Wu L J et al (2006), "[Study on the prognostic value of hepatocyte growth factor and c-met for patients with hepatocellular carcinoma]", Zhonghua Wai Ke Za Zhi, 44(9), pp 603-8 Zhou Y., Yin X., Ying J et al (2012), "Golgi protein 73 versus alpha-fetoprotein as a biomarker for hepatocellular carcinoma: a diagnostic meta-analysis", BMC Cancer, 12, pp 17 Zhu Z W., Friess H., Wang L et al (2001), "Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders", Gut, 48(4), pp 558-64 59 PHỤ LỤC: DANH SÁCH BỆNH NHÂN NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ mRNA GP73 & PROTEIN GP73 STT Họ tên Mã bệnh Tuổi Giới Ct mRNA GP73 Ct ABL Protein GP73 Nguyễn Tiến Đ HCC 45 Nam 40,3328 35,3696 172,977 Nguyễn Ngọc Th HCC 54 Nam 35,2882 32,5286 260,079 Nguyễn Minh H HCC 48 Nam 36,3433 34,0298 214,877 Phùng Văn L HCC 49 Nam 37,6488 35,9701 372,584 Lầu Nhia Ch HCC 47 Nam 35,6916 34,1896 223,447 Phạm Khắc Nh HCC 57 Nam 35,8886 33,2385 243,383 Hoàng Văn T HCC 56 Nam 37,7517 33,914 242,51 Nguyễn Văn B HCC 57 Nam 34,357 33,0295 245,131 Nguyễn Văn Ch HCC 54 Nam 35,9278 34,4054 239,023 10 Vũ Thị H HCC 67 Nữ 34,3397 33,1552 219,154 11 Nguyễn Thái Đ HCC 53 Nam 37,4671 36,4672 133,627 12 Hoàng Trọng Th HCC 51 Nam 34,5965 31,6505 255,666 13 Lê Văn Th HCC 43 Nam 33,2788 31,2502 313,137 14 Ngọ Xuân Th HCC 62 Nam 35,9157 32,195 211,466 15 Nguyễn Công Th HCC 68 Nam 35,246 32,4501 292,243 16 Nguyễn Xuân Ch HCC 70 Nam 33,1443 28,5455 267,168 17 Trần Xuân Ng HCC 62 Nam 37,0926 35,6635 251,267 18 Nguyễn Mạnh T HCC 56 Nam 32,2992 31,3211 362,236 60 19 Nguyễn Trung U HCC 73 Nam 34,1521 32,788 20 Đoàn Văn T HCC 55 Nam 33,4119 29,2444 21 Ngô Nhật L HCC 57 Nam 34,4795 29,5305 22 Nguyễn Văn B HCC 64 Nam 32,9883 30,4297 23 Nguyễn Văn C HCC 35 Nam 33,8143 30,1016 24 Nguyễn Xuân Th HCC 57 Nam 33,3242 29,7738 25 Nguyễn Thị Th HCC 39 Nữ 35,2628 31,8129 26 Lã Hồng S HCC 55 Nam 37,7048 34,3545 27 Nguyễn Duy T HCC 63 Nam 35,5167 31,8848 28 Nguyễn Văn Th HCC 70 Nam 36,7054 32,0375 29 Lai Thế T HCC 69 Nam 33,8843 32,2832 30 Phạm Văn Ngh HCC 67 Nam 34,2221 30,2281 31 Trần Thị Kim L LC 73 Nữ 33,6015 28,4719 32 Lê Văn Qu LC 44 Nam 33,0665 29,0262 33 Khương Trường Th LC 46 Nam 33,7582 31,4764 186,205 34 Nguyễn Xuân T LC 57 Nam 34,4371 32,354 294,049 35 Lê Quang Ph LC 61 Nam 35,8203 32,8655 129,718 36 Đỗ Mạnh H LC 46 Nam 37,8193 36,3892 208,064 37 Nguyễn Văn Ng LC 50 Nam 39,169 37,4682 207,216 38 Ngô Duy H LC 65 Nam 32,765 31,2548 304,93 39 Phạm Ngọc L LC 49 Nam 38,6893 36,4146 382,037 61 269,835 40 Nguyễn Xuân H LC 55 Nam 36,6875 34,8314 275,183 41 Vũ Văn Th LC 58 Nam 39,0293 35,4391 364,113 42 Nguyễn Văn N LC 49 Nam 37,1823 35,4457 397,25 43 Lưu Thị T LC 77 Nữ 39,9355 35,5817 220,87 44 Phan Thanh L LC 31 Nam 37,3541 36,0953 620,348 45 Nguyễn Đình Ch LC 51 Nam 39,9937 39,2328 337,988 46 Nguyễn Khắc Tr LC 41 Nam 35,3664 32,8198 356,613 47 Nguyễn Văn N LC 51 Nam 39,0034 36,2304 399,159 48 Phạm Văn Kh LC 51 Nam 39,4339 36,3685 412,569 49 Đàm Văn Ch LC 46 Nam 35,1402 33,0541 288,636 50 Nguyễn Minh L LC 77 Nam 36,724 34,5452 270,725 51 Nguyễn Thị H LC 66 Nữ 30,233 28,6383 150,267 52 Ngô Thị L LC 60 Nữ 31,0243 29,5532 156,696 53 Nguyễn T Bích H LC 57 Nữ 34,2436 31,4179 54 Lê Thị Th LC 79 Nữ 35,2677 32,1568 55 Nguyễn Duy M CHB 62 Nam 33,0898 30,064 56 Vũ Văn K CHB 77 Nam 33,1777 30,0571 57 Nguyễn Khắc Đ CHB 57 Nam 34,8788 31,5796 58 Dương Phú Kh CHB 51 Nam 36,096 34,4029 294,953 59 Nguyễn Bá M CHB 71 Nam 33,8742 32,2108 196,24 60 Nguyễn Quốc B CHB 56 Nam 38,0634 35,3226 193,722 62 61 Nguyễn Thị L CHB 64 Nữ 35,8292 33,458 268,056 62 Vũ Huy Th CHB 59 Nam 34,9184 32,3166 174,621 63 Phạm Văn Y CHB 52 Nam 36,753 34,3178 203,827 64 Đàm Thuận Ch CHB 35 Nam 36,8755 34,2633 324,139 65 Lê Văn D CHB 47 Nam 36,7451 34,7393 243,383 66 Nguyễn Xuân Ph CHB 52 Nam 36,341 34,7429 213,17 67 Phạm Thị Xuân D CHB 73 Nam 35,7065 34,0474 382,037 68 Phạm Công Kh CHB 57 Nam 35,3324 32,1394 199,605 69 Nguyễn Huy T CHB 39 Nam 37,6618 33,7471 457,177 70 Vũ Thị Th CHB 75 Nữ 36,5465 33,704 310,397 71 Nguyễn Văn H CHB 35 Nam 36,6143 34,9304 360,36 72 Phạm Quang H CHB 68 Nam 36,199 32,8762 429,925 73 Nguyễn Văn A CHB 56 Nam 37,1528 35,4649 239,023 74 Mạc Thị Gi CHB 27 Nữ 40,4628 37,1411 253,025 75 Nguyễn Thị V CHB 66 Nữ 35,0323 32,522 387,729 76 Đào Xuân H CHB 48 Nam 32,8238 30,7207 77 Lê Văn T CHB 76 Nam 34,2441 30,9195 78 Phạm Xuân T CHB 38 Nam 33,0744 30,9672 79 Hoàng Như Ph CHB 63 Nam 32,9209 29,812 80 Trần Viết N CHB 65 Nam 34,8222 32,8341 82 Nguyễn Thị C CHB 61 Nữ 34,4194 31,6034 63 82 Phạm Văn T CHB 33 Nam 35,2534 31,5375 83 Bùi Minh T HC 22 Nam 35,5629 32,3992 84 Nguyễn Thị Minh Th HC 21 Nữ 35,5606 31,9452 85 Vũ Thị H HC 20 Nữ 30,4305 28,3881 749,789 86 Vũ Thị D HC 30 Nữ 30,3137 28,9687 206,368 87 Vũ Thị Ng HC 46 Nữ 31,7421 28,6191 230,347 88 Hoàng Thị H HC 28 Nữ 30,2414 27,6454 208,914 89 Nguyễn Thị H HC 34 Nữ 31,6515 28,7814 182,882 90 Vũ Thị B HC 35 Nữ 31,1118 28,6018 264,505 91 Nguyễn Trọng T HC 29 Nam 31,1203 30,1144 254,785 92 Nguyễn Duy D HC 27 Nam 33,46 32,0867 206,368 93 Chu Thị Thu Tr HC 33 Nữ 30,4632 28,4864 226,03 94 Nguyễn Thị H HC 45 Nữ 30,9328 28,8802 195,4 95 Nguyễn Thị Hải V HC 27 Nữ 31,755 29,2566 156,696 96 Lê Thị V HC 26 Nữ 28,6746 27,9187 176,268 97 Nguyễn Thị Q HC 31 Nữ 31,9949 29,9531 201,292 98 Đỗ Thị Ngọc S HC 33 Nữ 31,1441 28,2433 202,981 99 Nguyễn Thị Nh HC 31 Nữ 30,4327 28,711 338,915 100 Đặng Tùng Tr HC 20 Nam 31,3816 29,0732 276,076 101 Vũ Thị H HC 40 Nữ 33,626 32,2943 232,077 102 Nguyễn Thị Y HC 26 Nữ 32,8732 31,7755 156,696 64 103 Tưởng Xuân Đ HC 20 Nam 32,2051 30,7605 182,882 104 Nguyễn Viết Q HC 20 Nam 32,1163 31,4733 221,728 105 Phạm Đức H HC 20 Nam 31,9036 29,2063 106 Hứa Văn Th HC 22 Nam 32,2317 29,6123 107 Hoàng Xuân Ph HC 20 Nam 32,0545 29,3686 108 Nguyễn Ngọc L HC 21 Nam 33,4253 29,233 109 Hoàng Trung Th HC 22 Nam 32,3219 29,6298 110 AL HC 20 Nam 35,5103 33,4231 111 Đặng Anh T HC 20 Nam 32,4417 29,6755 112 Đặng Ngọc T HC 20 Nam 32,6772 28,8814 113 Đàm Quang Tr HC 21 Nam 30,3391 29,4883 114 Vũ Huy H HC 20 Nam 32,5766 29,3501 115 Phan Trọng Tr HC 20 Nam 31,0471 28,2283 116 Đặng Tòn S HC 21 Nam 33,0617 29,7394 117 Đinh Văn B HC 21 Nam 32,8679 29,7256 118 Nguyễn Văn Ng HC 21 Nam 31,0386 28,4034 119 Đỗ Quang M HC 20 Nam 30,8923 28,8498 120 Danh Hoài Tr HC 20 Nam 32,3606 29,6781 121 Bùi Văn K HC 20 Nam 32,4696 29,3148 122 Lê Xuân A HC 20 Nam 31,3432 29,0894 65 [...]... với AFP Đặc biệt, khi so sánh đường cong ROC cho thấy GP73 < /b> có giá < /b> trị < /b> tiên lượng HCC tốt hơn AFP Với các lý do đó chúng tôi tiến hành nghiên < /b> cứu < /b> đề tài Nghiên < /b> cứu < /b> giá < /b> trị < /b> của < /b> GP73 < /b> trong < /b> chẩn < /b> đoán < /b> ung < /b> thƣ tế b o gan < /b> trên < /b> b nh < /b> nhân < /b> nhiễm < /b> virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B với các mục tiêu như sau: 1 Xác định mức độ biểu hiện gen của < /b> GP73 < /b> trên < /b> các nhóm b nh < /b> nhân < /b> b nh < /b> gan < /b> do HBV: ung < /b> thư < /b> gan,< /b> xơ gan,< /b> viêm < /b> gan < /b> B mãn tính,... ở những b nh < /b> nhân < /b> viêm < /b> gan < /b> cấp mức độ biểu hiện của < /b> GP73 < /b> tăng, nó được thấy trên < /b> cả b nh < /b> nhân < /b> viêm < /b> gan < /b> cấp nhiễm < /b> virus < /b> viêm < /b> gan < /b> và b nh < /b> nhân < /b> không nhiễm < /b> virus < /b> viêm < /b> gan < /b> [32] Kladney cũng đã nghiên < /b> cứu < /b> và quan sát trên < /b> mô hình nhiễm < /b> Adenovirus gây ra mức độ biểu hiện của < /b> GP73 < /b> trong < /b> các tế b o gan < /b> HepG2 và HepG 3B GP73 < /b> được biểu hiện nhanh chóng trong < /b> mô hình nghiên < /b> cứu < /b> này, dựa trên < /b> sự có mặt của < /b> protein... thấy mức độ biểu hiện của < /b> GP73 < /b> ở những b nh < /b> nhân < /b> ung < /b> thư < /b> gan < /b> rất cao Đặc biệt là với những b nh < /b> nhân < /b> ung < /b> thư < /b> gan < /b> nhưng xét nghiệm AFP cứu < /b> của < /b> Mao Y và cộng sự nghiên < /b> cứu < /b> trên < /b> 4.217 người, trong < /b> đó 1.690 người khỏe mạnh, 337 người mang HBV, 512 b nh < /b> nhân < /b> b xơ gan,< /b> 789 b nh < /b> nhân < /b> b HCC, 61 b nh < /b> nhân < /b> có tổn thư< /b> ng gan < /b> ác tính khác và 622 b nh < /b> nhân < /b> mang 14 loại ung < /b> thư < /b> khác nhau,... lý của < /b> cơ thể sống 20 CHƢƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên < /b> cứu < /b> Đề tài nghiên < /b> cứu < /b> trên < /b> 82 b nh < /b> nhân < /b> nhiễm < /b> VRVGB được chia thành 3 nhóm và 40 người khoẻ mạnh làm nhóm chứng Các nhóm b nh < /b> nhân < /b> được chia như sau: 27 b nh < /b> nhân < /b> viêm < /b> gan < /b> B mãn tính, 30 b nh < /b> nhân < /b> ung < /b> thư < /b> gan < /b> nhiễm < /b> VRVGB, 25 b nh < /b> nhân < /b> xơ gan < /b> nhiễm < /b> VRVGB Các mẫu b nh < /b> phẩm máu được thu thập từ các b nh < /b> nhân < /b> điều trị.< /b> .. Ý nghĩa của < /b> GP73 < /b> trong < /b> chẩn < /b> đoán < /b> HCC Mức độ biểu hiện cao của < /b> GP73 < /b> trên < /b> b nh < /b> nhân < /b> HCC so với b nh < /b> nhân < /b> không ung < /b> thư < /b> gan < /b> đã được nhiều tác giả nghiên < /b> cứu < /b> và đánh giá < /b> Vì vậy, nhiều nhà nghiên < /b> cứu < /b> cho rằng mức độ biểu hiện của < /b> GP73 < /b> trong < /b> huyết thanh của < /b> b nh < /b> nhân < /b> HCC cao hơn hẳn, điều đó đưa đến gợi ý rằng GP73 < /b> có thể là một dấu ấn sinh học trong < /b> chẩn < /b> đoán < /b> sớm ung < /b> thư < /b> gan < /b> [24, 61] Nghiên < /b> cứu < /b> của < /b> Marrero... mật trong < /b> gan < /b> b nh thư< /b> ng ở mức độ thấp Tuy nhiên, GP73 < /b> lại biểu hiện mạnh trong < /b> các tế b o gan < /b> và trong < /b> các mẫu huyết tương của < /b> những b nh < /b> nhân < /b> b b nh < /b> gan < /b> và biểu hiện cao nhất trên < /b> b nh < /b> nhân < /b> HCC [31, 43] Theo Kladney và cộng sự nghiên < /b> cứu < /b> cho thấy mức độ biểu hiện của < /b> GP73 < /b> trong < /b> gan < /b> b nh thư< /b> ng, thư< /b> ng chủ yếu từ các tế b o mô đường mật Ngược lại, mức độ biểu hiện của < /b> GP73 < /b> lại biểu hiện cao trong.< /b> .. thấy mức độ biểu hiện của < /b> GP73 < /b> trong < /b> huyết thanh cao hơn đáng kể ở b nh < /b> nhân < /b> HCC so với b nh < /b> nhân < /b> xơ gan < /b> Với độ nhạy và độ đặc hiệu của < /b> GP73 < /b> là 69% và 75%, trong < /b> khi đó của < /b> AFP là 30% và 96% Nồng độ của < /b> GP73 < /b> b nh < /b> nhân < /b> HCC trên < /b> b nh < /b> nhân < /b> HCC là 62 và 71% trong < /b> khi đó AFP chỉ dưới 20 và 100ng/ml, điều đó cho thấy ý nghĩa của < /b> GP73 < /b> trong < /b> chẩn < /b> đoán < /b> HCC ở những b nh < /b> nhân < /b> b nh thư< /b> ng và những b nh < /b> nhân < /b> có AFP... viêm < /b> gan < /b> mạn tính, xơ gan < /b> và thậm chí ung < /b> thư < /b> gan < /b> Nguyên nhân < /b> dẫn đến sự khác biệt đó được nhiều nghiên < /b> cứu < /b> chứng minh là có liên quan chặt chẽ đến kiểu gen, đột biến gen của < /b> HBV, tính chất di truyền học của < /b> b nh < /b> nhân < /b> cũng như quá trình tương tác giữa b gen của < /b> virus < /b> và ADN của < /b> tế b o gan < /b> Viêm < /b> gan < /b> C: cũng giống như viêm < /b> gan < /b> B, viêm < /b> gan < /b> C là một b nh < /b> truyền nhiễm < /b> b i virus,< /b> có thể gây nên cả viêm < /b> gan.< /b> .. gây ung < /b> thư < /b> gan;< /b> các chất mốc trong < /b> lạc, đậu cũng đã được chứng minh có mối liên quan mật thiết với hình thành ung < /b> thư < /b> gan < /b> 1.3 Mối liên quan giữa nhiễm < /b> HBV với ung < /b> thƣ gan < /b> Từ đầu những năm 1970, viêm < /b> gan < /b> B mãn tính đã được cho là có liên quan tới sự phát triển của < /b> ung < /b> thư < /b> biểu mô tế b o gan < /b> (HCC) [55] Nhiễm < /b> virus < /b> viêm < /b> gan < /b> B là nguyên nhân < /b> gây ung < /b> thư < /b> gan,< /b> có đến 80% b nh < /b> nhân < /b> HCC b nhiễm < /b> virus < /b> viêm < /b> gan.< /b> .. độ biệt hóa Đây là tiêu chuẩn chẩn < /b> đoán < /b> b t buộc của < /b> nhóm b nh < /b> nhân < /b> HCC  B nh < /b> nhân < /b> xơ gan:< /b> - B nh < /b> nhân < /b> có đủ hai hội chứng trên < /b> lâm sàng và xét nghiệm: + Hội chứng tăng áp lực tĩnh mạch cửa + Hội chứng suy tế b o gan < /b>  B nh < /b> nhân < /b> viêm < /b> gan < /b> B mãn tính: - Được chẩn < /b> đoán < /b> xác định b ng mô b nh < /b> học với phân loại điểm Knodell RG – Ishak KG (1981) cho điểm từ 0-18 21 Toàn b b nh < /b> nhân < /b> HCC, xơ gan,< /b> viêm < /b> gan