Nghiên cứu giá trị của GP73 trong chẩn đoán ung thư gan trên bệnh nhân nhiễm virus viêm gan B

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Thanh Huyền NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA GP73 TRONG CHẨN ĐOÁN UNG THƢ GAN TRÊN BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Trần Thị Thanh Huyền NGHIÊN CỨU GIÁ TRỊ CỦA GP73 TRONG CHẨN ĐOÁN UNG THƢ GAN TRÊN BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS VIÊM GAN B Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60420114 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Lê Hữu Song PGS TS Hoàng Thị Mỹ Nhung Hà Nội - 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Luận văn công trình nghiên cứu thực thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Lê Hữu Song – Bệnh viện TƯQĐ 108, PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Các số liệu, kết nghiên cứu trình bày luận văn trung thực chưa công bố hình thức Tôi xin chịu trách nhiệm kết nghiên cứu Học viên Trần Thị Thanh Huyền LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, xin bày tỏ lòng kính trọng, biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Hữu Song – Bệnh viện TƯQĐ 108; PGS.TS Hoàng Thị Mỹ Nhung – Bộ môn Sinh học tế bào, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình suốt thời gian thực đề tài Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS TS BS Phan Quốc Hoàn tạo điều kiện để thực luận văn khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108; tới anh chị khoa Sinh học phân tử - Bệnh viện Trung ương quân đội 108 giúp đỡ động viên suốt thời gian qua Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Sinh học Tế bào lãnh đạo Khoa Sinh học giảng dạy tạo điều kiện thuận lợi cho học tập nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân bạn bè ủng hộ, giúp đỡ tạo điều kiện để hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2015 Học viên Trần Thị Thanh Huyền MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ Error! Bookmark not defined CHƢƠNG TỔNG QUAN Error! Bookmark not defined 1.1 Tình hình dịch tễ học bệnh ung thƣ gan.Error! Bookmark not defined 1.1.1 Dịch tễ học giới Error! Bookmark not defined 1.1.2 Dịch tễ học Việt Nam Error! Bookmark not defined 1.2 Nguyên nhân yếu tố nguy gây ung thƣ gan.Error! Bookmark not def 1.3 Mối liên quan nhiễm HBV với ung thƣ gan.Error! Bookmark not defined 1.4 Chẩn đoán ung thƣ biểu mô tế bào gan.Error! Bookmark not defined 1.4.1 Khám lâm sàng Error! Bookmark not defined 1.4.2 Xét nghiệm cận lâm sàng Error! Bookmark not defined 1.4.3 Các phương pháp chẩn đoán hình ảnh Error! Bookmark not defined 1.4.4 Chọc hút tế bào sinh thiết khối u Error! Bookmark not defined 1.5 Tổng quan GP73 Error! Bookmark not defined 1.5.1 Đặc điểm sinh học GP73 Error! Bookmark not defined 1.5.2 Mức độ biểu protein GP73 Error! Bookmark not defined 1.5.3 Điều hòa biểu gen GP73 Error! Bookmark not defined 1.5.4 Ý nghĩa GP73 chẩn đoán HCC Error! Bookmark not defined 1.6 Tình hình nghiên cứu dấu ấn phân tử HCC.Error! Bookmark not defin 1.7 Các phƣơng pháp đánh giá mức độ biểu gen nay.Error! Bookmark CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark not 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân Error! Bookmark not defined 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ Error! Bookmark not defined 2.2 Vật liệu thiết bị nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Các hoá chất, sinh phẩm Error! Bookmark not defined 2.2.2 Các máy thiết bị sử dụng nghiên cứu.Error! Bookmark not d 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3.1 Thu thập mẫu bệnh phẩm Error! Bookmark not defined 2.3.2 Sơ đồ nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.3.3 Xác định mức độ biểu gen mARN GP73.Error! Bookmark not defined 2.3.4 Định lượng protein GP73 kỹ thuật ELISA.Error! Bookmark not define 2.3.5 Các phương pháp định lượng AFP, sinh hoá, hoá nghiệmError! Bookmark n 2.3.6 Xét nghiệm định lượng HBV-ADN Error! Bookmark not defined 2.3.7 Phân tích xử lý số liệu Error! Bookmark not defined CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Error! Bookmark not defined 3.1 Đặc điểm nhóm nghiên cứu Error! Bookmark not defined 3.1.1 Đặc điểm tuổi giới Error! Bookmark not defined 3.1.2 Đặc điểm số số cận lâm sàng thông thường.Error! Bookmark n 3.2 So sánh nồng độ HBV–ADN nhóm nghiên cứu.Error! Bookmark not 3.3 Xác định mức độ biểu GP73 Error! Bookmark not defined 3.3.1 Xác định mức độ biểu gen mARN GP73.Error! Bookmark not define 3.3.2 Xác định mức độ biểu gen protein GP73.Error! Bookmark not define KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 55 TÀI LIỆU THAM KHẢO 56 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc tần suất tử vong số bệnh ung thư điển hình giới (Globocan – 2012) Error! Bookmark not defined Hình 1.2: Biểu đồ phân bố tỷ lệ mắc tần suất tử vong số bệnh ung thư điển hình Việt Nam (Globocan – 2012) Error! Bookmark not defined Hình 1.3: Các nguyên nhân gây ung thư Error! Bookmark not defined Hình 1.4: Cấu trúc GP73 sGP73 Error! Bookmark not defined Hình 2.1: Nguyên lí phản ứng RealTime PCR sử dụng đầu dò Taqman Error! Bookmark not defined Hình 3.1: So sánh nồng độ HBV-ADN nhóm bệnh gan Error! Bookmark not defined Hình 3.2: Kết giải trình tự gen GP73 44 Hình 3.3: Hình ảnh tín hiệu huỳnh quang Realtime PCR gen GP73 gen nội chuẩn ABL Error! Bookmark not defined Hình 3.4: So sánh mức độ biểu mARN GP73 nhóm bệnh nhân nhóm người khỏe mạnh Error! Bookmark not defined Hình 3.5: So sánh mức độ biểu mARN GP73 nhóm nghiên cứu Error! Bookmark not defined Hình 3.6: Đường cong ROC mARN GP73 AFP Error! Bookmark not defined Hình 3.7: Nồng độ protein GP73 Error! Bookmark not defined Hình 3.8: So sánh mức độ biểu protein GP73 nhóm bệnh nhân nhóm người khỏe mạnh Error! Bookmark not defined Hình 3.9: So sánh mức độ biểu protein GP73 nhóm nghiên cứu Error! Bookmark not defined Hình 3.10: Đường cong ROC protein GP73 AFP Error! Bookmark not defined DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1: Danh mục hóa chất sử dụng nghiên cứu Error! Bookmark not defined Bảng 2.2: Danh mục thiết bị Error! Bookmark not defined Bảng 3.1: Đặc điểm tuổi giới nhóm nghiên cứu Error! Bookmark not defined Bảng 3.2: Đặc điểm số cận lâm sàng nhóm nghiên cứu 33 Bảng 3.3: So sánh nồng độ AFP nhóm nghiên cứu Error! Bookmark not defined Bảng 3.4: Tính chất khối U gan phân loại mức độ bệnh theo Barcelona Clinic Liver Cancer (BCLC) Error! Bookmark not defined Bảng 3.5: So sánh nồng độ HBV–ADN nhóm nghiên cứu Error! Bookmark not defined Bảng 6: Nồng độ đo OD độ ARN Error! Bookmark not defined Bảng 3.7: Kết định lượng tương đối mARN Error! Bookmark not defined Bảng 3.8: So sánh mức độ biểu mARN GP73 nhóm bệnh gan nhóm người khỏe mạnh Error! Bookmark not defined Bảng 3.9: So sánh mức độ biểu gen mARN GP73 nhóm nghiên cứu Error! Bookmark not defined Bảng 3.10: Nồng độ đo OD protein GP73 Error! Bookmark not defined Bảng 3.11: So sánh mức độ biểu protein GP73 nhóm bệnh gan nhóm người khỏe mạnh Error! Bookmark not defined Bảng 3.12: So sánh mức độ biểu protein GP73 nhóm nghiên cứu Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AFP : Alpha Feto Protein bp : base pair cADN : complementary ADN dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate ADN : Acid deoxyribonucleic ABL : Abelson ARN : Acid ribonucleic ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay (Kỹ thuật miễn dịch gắn men) GOLM1 : Golgi Membrane Protein GP73 : Golgi protein 73 HBsAg : Hepatitis B surface Antigen (Kháng nguyên bề mặt virus viêm gan B) HBV : Hepatitis B virus (Virus viêm gan B) HCC : Hepatocellular carcinoma (Ung thư tế bào gan nguyên phát) CHB : Chronic hepatitis (Viêm gan B mạn tính) CH : Healthy control (Nhóm người khỏe mạnh) LC : Liver cirrhosis (Xơ gan) M-MLV : Moloney Murine Leukemia Virus mARN : Messenger ARN PCR : Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) Real Time PCR : Real Time Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp tính theo thời gian thực) RT- PCR : Reverse transcriptase Polymerase chain Reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp sử dụng enzyme phiên mã ngược) RT : Reverse transcription (Quá trình phiên mã ngược) ROC curve : Receiver operating characteristic curve – đường cong ROC VGM : Viêm gan mạn VRVGB : Virus viêm gan B TÀI LIỆU THAM KHẢO 10 11 A H S R a A L (2000), "Tumours of the Liver and Intrahepatic Bile Ducts", World Health Organization Classfication of Tumors, IARC press, pp 158-202 al A H e (2012), "Development of Hepatocellular Carcinoma Associated with Anabolic Androgenic Steroid Abuse in a Young Bodybuilder: A Case Report", Case Reports in Pathology, 2012 al E M e (2003), "Cancer risk in patients with hereditary hemochromatosis and in their first-degree relatives", Gastroenterology, 125(6), pp 1733-1741 al F T e (2014), "Alcohol and liver cancer: a systematic review and meta-analysis of prospective studies", Annals of Oncology, 25, pp 1526-1535 Bagnardi V B M., La Vecchia C et al (2001), "A metaanalysis of alcohol drinking and cancer risk", Br J Cancer, 85, pp 1700-1705 Beillard E., Pallisgaard N., van der Velden V H et al (2003), "Evaluation of candidate control genes for diagnosis and residual disease detection in leukemic patients using 'real-time' quantitative reversetranscriptase polymerase chain reaction (RQ-PCR) - a Europe against cancer program", Leukemia, 17(12), pp 2474-86 Block TM C M., Lowman M, Steel LF, Romano PR, Fimmel C, et al (2005), "Use of targeted glycoproteomics to identify serum glycoproteins that correlate with liver cancer in woodchucks and humans", Proc Natl Acad Sci USA, 102, pp 779-784 Bosch F X., Ribes J., Diaz M et al (2004), "Primary liver cancer: worldwide incidence and trends", Gastroenterology, 127(5 Suppl 1), pp S5-S16 Chen C J., Yang H I., Su J et al (2006), "Risk of hepatocellular carcinoma across a biological gradient of serum hepatitis B virus DNA level", JAMA, 295(1), pp 65-73 Clark M F., Adams A N (1977), "Characteristics of the microplate method of enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses", J Gen Virol, 34(3), pp 475-83 Claudio Pelucchi S D S G., Sc.D.; Werner Garavello, M.D.; Cristina Bosetti, Sc.D.; and Carlo La Vecchia, M.D (2006), "Cancer risk associated with alcohol and tobacco use: focus on upper aerdisgetive tract and liver", Health risks, 29(3), pp 193-198 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Diseases A A f t S o L (2010), "Management of Hepatocellular Carcinoma: An Update", HEPATOLOGY, Vol 000, No 000, pp 1-35 Donati M., Brancato G., Donati A (2010), "Clinical biomarkers in hepatocellular carcinoma (HCC)", Front Biosci (Schol Ed), 2, pp 571-7 Donato F T A., Gelatti U, Parrinello G, Boffetta P, Albertini A, Decarli A, Trevisi P, Ribero ML, Martelli C, Porru S, Nardi G (2002), "Alcohol and hepatocellular carcinoma: the effect of lifetime intake and hepatitis virus infections in men and women.", Am J Epidemiol., 155(4), pp 323-331 Engvall E., Perlmann P (1971), "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Quantitative assay of immunoglobulin G", Immunochemistry, 8(9), pp 871-4 Fattovich G., Stroffolini T., Zagni I et al (2004), "Hepatocellular carcinoma in cirrhosis: incidence and risk factors", Gastroenterology, 127(5 Suppl 1), pp S35-50 Fimmel C J., Wright L (2009), "Golgi protein 73 as a biomarker of hepatocellular cancer: development of a quantitative serum assay and expression studies in hepatic and extrahepatic malignancies", Hepatology, 49(5), pp 1421-3 Forner A R M., Bruix J (2009), "Alpha-fetoprotein for hepatocellular carcinoma diagnosis: the desmise of abrilliant star", Gastroenterology, 137 Goh C W a K (2006), "Chronic hepatitis B infection and liver cancer", Biomed Imaging Interv J, 2(3) Gu Y., Chen W., Zhao Y et al (2009), "Quantitative analysis of elevated serum Golgi protein-73 expression in patients with liver diseases", Ann Clin Biochem, 46(Pt 1), pp 38-43 Hashem B El-Serag M D., M.P.H (2011), "Hepatocellular Carcinoma", The New England journal of medicine, 365, pp 1118-1127 Hayashi PH D B A (2005), "The progression of hepatitis B- and C-infections to chronic liver disease and hepatocellular carcinoma: epidemiology and pathogenesis.", Med Clin North Am., 89(2), pp 371389 HB E.-S (2001), "Epidemiology of hepatocellular carcinoma", Clin Liver Dis, 5, pp 87-107 Hu J S., Wu D W., Liang S et al (2010), "GP73, a resident Golgi glycoprotein, is sensibility and specificity for hepatocellular carcinoma of diagnosis in a hepatitis B-endemic Asian population", Med Oncol, 27(2), pp 339-45 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Iain H McKillop L W S (2005), "Alcohol and liver cancer", Alcohol, 35, pp 195-203 Iftikhar R., Kladney R D., Havlioglu N et al (2004), "Disease- and cell-specific expression of GP73 in human liver disease", Am J Gastroenterol, 99(6), pp 1087-95 Iloeje U H., Yang H I., Su J et al (2006), "Predicting cirrhosis risk based on the level of circulating hepatitis B viral load", Gastroenterology, 130(3), pp 678-86 J F., I S., M E et al (2013), "GLOBOCAN 2012 cancer incidence and mortality worldwide: IARC cancerbase", International Agency for Research on Cancer, 11 Jordi Bruix M S (2010), "Management of Hepatocellular Carcinoma: An Update", AASLD PRACTICE GUIDELINE, HEPATOLOGY, Vol 000, No 000, 2010 Kang J E., Hwang S H., Lee J H et al (2011), "Effects of RBC removal and TRIzol of peripheral blood samples on RNA stability", Clin Chim Acta, 412(19-20), pp 1883-5 Kladney R D., Bulla G A., Guo L et al (2000), "GP73, a novel Golgi-localized protein upregulated by viral infection", Gene, 249(1-2), pp 53-65 Kladney R D., Cui X., Bulla G A et al (2002), "Expression of GP73, a resident Golgi membrane protein, in viral and nonviral liver disease", Hepatology, 35(6), pp 1431-40 Kladney R D., Tollefson A E., Wold W S et al (2002), "Upregulation of the Golgi protein GP73 by adenovirus infection requires the E1A CtBP interaction domain", Virology, 301(2), pp 236-46 Ko SC F L., Smith EA, Fenlon N, Koneru AK, Murphy TV (2014), "Estimated Annual Perinatal Hepatitis B Virus Infections in the United States, 2000-2009", J Pediatric Infect Dis Soc Kumada T., Toyoda H., Kiriyama S et al (2010), "Incidence of hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis B virus infection who have normal alanine aminotransferase values", J Med Virol, 82(4), pp 539-45 La Vecchia C N E., Cavalieri d’Oro L et al (1998), "Liver cirrhosis and the risk of primary liver cancer", Eur J Cancer Prev, 7, pp 315-320 Larsson SC W A (2007), "Overweight, obesity and risk of liver cancer: a meta-analysis of cohort studies", Br J Cancer, 97(1005-1008) Liu Y C C., Marsh GM, Wu F (2012), "Population attributable risk of aflatoxin-related liver cancer: 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 systematic review and meta-analysis", Eur J Cancer Prev, 48(14), pp 2125-2136 Livak K J., Schmittgen T D (2001), "Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method", Methods, 25(4), pp 402-8 LONDON W T A M., K.A (1996), "Liver cancer", Cancer Epidemiology and Prevention, pp 772-793 Luis Jesuino de Oliveria Andrade A D O., Junior, Rosangela Carvalho Melo,1 Emmanuel Conrado De Souza,1 Carolina Alves Costa Silva, and Raymundo Paraná (2009), "Association Between Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma", J Glob Infect Dis., 1(1), pp 33-37 Maitra A., Thuluvath P J (2004), "GP73 and liver disease: a (Golgi) complex enigma", Am J Gastroenterol, 99(6), pp 1096-8 Malaguarnera G., Giordano M., Paladina I et al (2010), "Serum markers of hepatocellular carcinoma", Dig Dis Sci, 55(10), pp 2744-55 Manno M., Camma C., Schepis F et al (2004), "Natural history of chronic HBV carriers in northern Italy: morbidity and mortality after 30 years", Gastroenterology, 127(3), pp 756-63 Mao Y., Yang H., Xu H et al (2010), "Golgi protein 73 (GOLPH2) is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma", Gut, 59(12), pp 1687-93 Mao Y L., Yang H Y., Xu H F et al (2008), "[Significance of Golgi glycoprotein 73, a new tumor marker in diagnosis of hepatocellular carcinoma: a primary study]", Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 88(14), pp 948-51 Marcello Donati G B., Angelo Donati (2010), "Clinical biomarkers in hepatocellular carcinoma", Frontiers in Bioscience S2, pp 571-577 Marrero J A., Romano P R., Nikolaeva O et al (2005), "GP73, a resident Golgi glycoprotein, is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma", J Hepatol, 43(6), pp 1007-12 McMahon B J., Alberts S R., Wainwright R B et al (1990), "Hepatitis B-related sequelae Prospective study in 1400 hepatitis B surface antigen-positive Alaska native carriers", Arch Intern Med, 150(5), pp 1051-4 Mizuguchi T., Katsuramaki T., Nobuoka T et al (2004), "Serum hyaluronate level for predicting subclinical liver dysfunction after hepatectomy", World J Surg, 28(10), pp 971-6 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 Nguyen V T., Law M G., Dore G J (2008), "An enormous hepatitis B virus-related liver disease burden projected in Vietnam by 2025", Liver Int, 28(4), pp 525-31 Ozkan H., Erdal H., Tutkak H et al (2011), "Diagnostic and prognostic validity of Golgi protein 73 in hepatocellular carcinoma", Digestion, 83(1-2), pp 83-8 Pilia G., Hughes-Benzie R M., MacKenzie A et al (1996), "Mutations in GPC3, a glypican gene, cause the Simpson-Golabi-Behmel overgrowth syndrome", Nat Genet, 12(3), pp 241-7 Sangiovanni A D N E., Fasani P, De Fazio C, Ronchi G, Romeo R, Morabito A, De Franchis R, Colombo M (2004), "Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance.", Gastroenterology, 126(4), pp 10051014 Sherlock S., Fox R A., Niazi S P et al (1970), "Chronic liver disease and primary liver-cell cancer with hepatitis-associated (Australia) antigen in serum", Lancet, 1(7659), pp 1243-7 Shi Y., Chen J., Li L et al (2011), "A study of diagnostic value of golgi protein GP73 and its genetic assay in primary hepatic carcinoma", Technol Cancer Res Treat, 10(3), pp 287-94 Van Weemen B K., Schuurs A H (1971), "Immunoassay using antigen-enzyme conjugates", FEBS Lett, 15(3), pp 232-236 Wang Y W B., Shen F et al (2012), "Body mass index and risk of primary liver cancer: a meta-analysis of prospective studies", Oncologist, 17, pp 1461-1468 WHO (2015), "Hepatitis B" WHO (2015), "Hepatitis C" Willyard C (2007), "Researchers look for 'sweet' method to diagnose cancer", Nat Med, 13(11), pp 1267 Wright L M., Huster D., Lutsenko S et al (2009), "Hepatocyte GP73 expression in Wilson disease", J Hepatol, 51(3), pp 557-64 Wright L M., Yong S., Picken M M et al (2009), "Decreased survival and hepato-renal pathology in mice with C-terminally truncated GP73 (GOLPH2)", Int J Clin Exp Pathol, 2(1), pp 34-47 Wu F S., Zheng S S., Wu L J et al (2006), "[Study on the prognostic value of hepatocyte growth factor and c-met for patients with hepatocellular carcinoma]", Zhonghua Wai Ke Za Zhi, 44(9), pp 603-8 Zhou Y., Yin X., Ying J et al (2012), "Golgi protein 73 versus alpha-fetoprotein as a biomarker for 66 hepatocellular carcinoma: a diagnostic meta-analysis", BMC Cancer, 12, pp 17 Zhu Z W., Friess H., Wang L et al (2001), "Enhanced glypican-3 expression differentiates the majority of hepatocellular carcinomas from benign hepatic disorders", Gut, 48(4), pp 558-64