Báo cáo thực hành KST SR

Khi soi tiêu bản máu nhuộm Giemsa thấy như sau: bào tương bắt màu xanh da trời, nhân bắt màu đỏ, hạt sắc tố có màu nâu đen và có các thể: a.. – Thể tư dưỡng đang phát triển thể amip: bà

BÁO CÁO THỰC HÀNH MÔN KÝ SINH TRÙNG

QUAN SÁT HÌNH THỂ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT LÀM TIÊU BẢN MÁU NHUỘM GIEMSA



I HÌNH THỂ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT:

1 Ký sinh trùng sốt rét ký sinh ở người:

– Plasmodium falciparum

– Plasmodium vivax

– Plasmodium malariae

– Plasmodium ovale

– Plasmodium knowlesi (mới phát hiện – trên khỉ)

Ở Việt Nam thường gặp: P.vivax và P.falciparum Và khi thực hành chủ yếu soi P.vivax và P.falciparum Khi soi tiêu bản máu nhuộm Giemsa thấy như sau: bào tương bắt màu xanh da

trời, nhân bắt màu đỏ, hạt sắc tố có màu nâu đen và có các thể:

a Thể tư dưỡng (T):

– Thể tư dưỡng non (thể nhẫn): bào tương giống như vòng nhẫn, nhân tròn gọn nằm ở một điểm trên vòng bào tương

– Thể tư dưỡng đang phát triển (thể amip): bào tương phát sinh thành chân giả, ký sinh trùng có hình như một con amip, các chân giả thường nối kiền với nhau tạo thành những không bào nhỏ Trong bào tương xuất hiện hạt sắc tố

– Thể tư dưỡng già: ký sinh trùng lớn lên, không vào dần dần mất đi, chân giả thu gọn lại bào tương thành một khối, các hạt sắc tố tập trung lại thành từng đám trong bào tương

b Thể phân liệt (S):

– Thể phân liệt non: sau khi hình thành thể tư dưỡng già, ký sinh trùng phân chia nhân lúc đầu nhân chia thành 2 sau chia 4 rồi 8 mảnh, bào tương chưa phân chia

– Thể phân liệt già: khi phân chia nhân xong, bào tương phân chia theo số mảnh nhân đã

có, mỗi mảnh nhân có 1 mảnh bào tương kèm theo, thành một ký sinh trùng non Số lượng ký sinh trùng non có thể từ 8-12-18… tùy theo từng loại

c Thể giao bào (G):

– Có giao bào đực và giao bào cái Giao bào đực nhân không gọn, xốp và bào tương bắt màu xanh nhạt

– Các hồng cầu bị ký sinh tùy từng loại mà hồng cầu có biến đổi nhiều ít hoặc không

– P.falciparum thường chỉ thấy có thể nhẫn và thể giao bào ở máu ngoại vi, 3 loại còn lại

có tất cả các thể

II ĐẶC ĐIỂM 4 LOẠI KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TRONG TIÊU BẢN GIỌT ĐÀN:

P.vivax P.falciparum

Xuất hiện máu ngoại vi Tất cả các thể Thường chỉ thấy nhẫn và giao bào

Thể nhẫn

Kích thước 1/3-1/2 đường kính hồng cầu Đôi khi có 2-3 nhân trong một hồng cầu

Nhân tròn, nhỏ, gọn, chắc, bắt màu

đỏ, thường có 1 nhân, đôi khi gặp

2 nhân

Nguyên sinh chất thanh mảnh, phân bố đều, bắt màu xanh da trời

Có thể nguyên sinh chất hình nhẫn, hình chấm phẩy, hình cánh

nhạn…

Kích thước 1/5- 1/4 hồng cầu

(1,5-2 mm), có thể gặp 1-4 thể nhẫn ký sinh trong một hồng cầu

Thể tư dưỡng

(Trophozoite) Thể

amip

Hình thể kì dị, chân giả dài, không bào lớn hoặc có nhiều không bào nhỏ Hạt sắc tố nhỏ

Thường không thấy trong máu ngoại vi

Thể tư dưỡng già

Nhân phát triển kéo dài ra, đôi khi tách làm đôi

Nguyên sinh chất phát triển nhiều lên, thô, xốp, thường đứt đoạn, phân bố không đều, chỗ rộng chỗ hẹp méo mó tạo thành nhiều chân giả ( còn gọi

là thể amip), khoảng không bào thường lớn

Hạt sắc tố hình chấm nhỏ màu nâu đen hoặc màu nâu ánh vàng năm rải rác trên nguyên sinh chất

Nhân phát triển kéo dài ra

Nguyên sinh chất nhiều và dày hơn

Hạt sắc tố hình que, màu nâu ánh vàng rải rác hoặc tập trung thành đám trên nguyên sinh chất

Thể tư dưỡng già

của P.falciparum ít gặp trên tiêu

bản máu ngoại vi, có thể gặp ở bệnh nhân sốt rét ác tính

Thể phân liệt

(Schizonte)

Nhân phân chia 12 - 24 mảnh sắp xếp không đều tập trung thành từng đám

Mỗi mảnh nhân kèm theo một

Nhân ký sinh trùng phân chia từ 12-30 mảnh, sắp xếp không đều nhau, tập trung thành đám

Nguyên sinh chất phân chia kèm

sắc tố mịn, màu nâu đen hoặc nâu ánh vàng rải rác xen kẽ giữa các mảnh nhân ký sinh trùng hoặc tập trung thành đám

nguyên sinh chất Hạt sắc tố hình que màu nâu đen ánh vàng tập trung thành đám hoặc thành tảng

Thể phân liệt ít gặp ở tiêu bản máu ngoại vi, thường gặp trong trường hợp bệnh nhân sốt rét nặng và ác tính

Thể giao bào

(Gametocyte)

Hình tròn hoặc bầu dục, khó phân biệt giao bào non và giao bào trưởng thành

Nhân thường nằm lệch một bên nguyên sinh chất

Nguyên sinh chất dày, to

Hạt sắc tố màu nâu ánh vàng rải rác trên nguyên sinh chất

Giao bào cái thường to hơn giao bào đực, nhân nhỏ hơn, nguyên sinh chất sẫm màu hơn

Đôi khi gặp giao bào chỉ có nhân và hạt sắc tố

Giao bào non hình tròn hoặc hình bầu dục, giao bào đực hình quả chuối hoặc hình liềm

Nhân tròn bắt màu đỏ nằm ở giữa Nguyên sinh chất bắt màu xanh da trời

Hạt sắc tố hình que màu nâu ánh vàng tập trung quanh nhân

Đôi khi có thể thấy dây hồng cầu (rải khăn quàng) hoặc giao bào chỉ

có nhân và hạt sắc tố Giao bào cái nhỏ hơn, hai đầu nhọn hơn, nhân nhỏ hơn, các hạt sắc tố chụm quanh nhân, nguyên sinh chất sẫm màu hơn

Giao bào đực kích thước to hơn, 2 đầu tày hơn, nhân to hơn, nguyên sinh chất sáng màu hơn, hạt sắc tố rải rác trên nguyên sinh chất

Hồng cầu bị ký sinh

Hồng cầu bị trương to, méo

mó, hình bầu dục Trong hồng cầu có những hạt Schuffner nhỏ, nhiều, lấm tấm bắt mầu

đỏ (kích thước khoảng 0,5 mm)

Kích thước hầu như bình thường, không trương to Có thể gặp hồng cầu có nhiều khía hình răng cưa Hồng cầu hơi nhạt màu, rìa hồng cầu màu sẫm hơn Trong hồng cầu

có những hạt Maurer to, thưa thớt, bắt màu đỏ (kích thước khoảng 1 mm)

III ĐẶC ĐIỂM KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT TRONG TIÊU BẢN GIỌT ĐẶC:

Hình thể của ký sinh trùng sốt rét trên tiêu bản giọt đặc cơ bản giống trên tiêu bản giọt đàn

nhưng do hồng cầu bị phá vỡ nên hình thể có thể thay đổi đôi chút và không đẹp bằng ở trên tiêu bản giọt đàn nhưng ký sinh trùng tập trung nhiều hơn

IV NHỮNG HÌNH THỂ DỄ NHẦM VỚI KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT:

Khi soi kính tìm ký sinh trùng sốt rét có thể gặp một số hình ảnh dễ nhầm với ký sinh trùng sốt rét là:

- Tiểu cầu nếu đứng riêng lẻ có thể nhầm với thể tư dưỡng trẻ nếu đứng tập trung dễ nhầm với

thể phân liệt

- Bạch cầu hạt bị nát có thể nhầm với thể tư dưỡng già

- Hồng cầu lưới dễ nhầm với thể tư dưỡng của P.vivax, hồng cầu hạt lưới dễ nhầm với thể phân

liệt

- Cặn thuốc nhuộm giemsa có thể nhầm với nhân của ký sinh trùng

- Các loại vi khuẩn hình cầu hoặc bầu dục có nhân ở giữa có thể nhầm với giao bào, các trực

khuẩn có thể nhầm với thể tư dưỡng của P.falciparum - Các loại nấm mốc mọc trên tiêu bản sau khi nhuộm và một số tế bào thực vật có thể nhầm với giao bào của P.falciparum và P.vivax.

VI HÌNH THỂ CÁC LOẠI PLASMODIUM:

1 Plasmodium falciparum:

2 Plasmodium vivax:

VI HÌNH THỂ MỘT SỐ LOẠI KÝ SINH TRÙNG SỐ RÉT TRÊN TIÊU BẢN NHUỘM GIEMSA:

1 Plasmodium falciparum:

- Giọt đàn:

- Giọt đặc:

Hồng cầu

Bạch cầiu trung tính

Thể giao bào

P.Falciparum

(hình chuối)

Thể tư dưỡng

P.Falciparu

m (hình

Bạch cầu Lympho

Hình ảnh chụp qua kính hiển vi (x100) đã được zoom để nhìn rõ thể tư dưỡng ở giọt

đặc của P.Falciparum

Thể giao bào

P.Falciparu m(Hình

chuối)

Thể tư dưỡng

P.Falciparum

(Hình nhẫn)

Bạch cầu trung tính

Bạch cầu Lympho

Thể tư dưỡng

P.Falciparu

m (Thể

Bạch cầu Lympho

Bạch cầu trung tính

Thể giao bào

P.Falciparum

(Hình chuối)

1 Plasmodium vivax:

- Giọt đàn:

Thể tư dưỡng

P.Vivax

(Hình nhẫn)

Thể tư dưỡng

già P.Vivax

- Giọt đặc:

VII KỸ THUẬT LÀM TIÊU BẢN MÁU NHUỘM GIEMSA ĐỂ CHẨN ĐOÁN KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT:

1 Dụng cụ:

– Lam kính khô, sạch

Thể tư dưỡng P.Vivax (Hình nhẫn)

Thể phân liệt

P.Vivax

Bạch cầu trung tính

Bạch cầu Lympho

– Lam kéo có cạnh nhẵn

– Kim chích máu vô khuẩn

– Bông thấm nước vô khuẩn

– Băng dính cầm máu

– Khay men

– Ống đong các loại: 10ml, 20ml…

– Pipette nhỏ giọt

– Đũa thủy tinh

– Giá nhuộm, giá cài tiêu bản

– Đồng hồ

– Máy sấy tiêu bản

– Dầu soi kính

– Kính hiển vi

– Bút viết

– Bút chì kính mềm

– Găng tay, khẩu trang, trang phục bảo hộ lao động

2 Hóa chất:

– Cồn sát trùng 70º

– Cồn tuyệt đối 96º

– Thuốc nhuộm Giemsa mẹ

– Nước cất hoặc dung dịch đệm

– Các dung dịch điều chỉnh pH: NaHPO4 2%, KH2PO4 2%

 Cách pha dung dich đệm:

– KH2PO4: 0.7

– NaHPO4: 1.0g

Lượng muối trên mỗi loại hòa tan trong 150ml nước cất, dùng đũa thủy tinh khuấy đều cho tan hết Trộn 2 loại dung dịch trên, tiếp tục cho vừa đủ 1000ml Khuấy đều, kiểm tra, điều chỉnh pH=7,2

 Cách pha dung dịch Giemsa nhuộm:

– Giemsa mẹ: 0.3 – 0.4ml

– Dung dịch đệm hoặc nước cất: 9.7ml

Trộn đều Giemsa mẹ và nước cất ta được dung dịch Giemsa 3 – 4% Thời gian nhuộm: 30 –

45 phút

* Nhuộm nhanh: Pha dung dịch Giemsa 10% (1ml Giemsa mẹ + 9ml dung dịch đệm) Thời

gian nhuộm: 15 – 20 phút

3 Người bệnh:

– Nên làm xét nghiệm cho người bệnh trước hoặc trong khi lên cơn sốt và chưa dùng

thuốc đặc hiệu, lúc này khả năng tìm thấy KSTSR ở máu ngoại vi cao hơn.

4 Các bước tiến hành:

– Trường hợp máu được lấy từ tĩnh mạch: Khi tiếp nhận ống máu từ y tá bệnh phòng, tiến hành làm tiêu bản từ ống máu được chống đông bằng EDTA, mà không qua lấy máu mao mạch trực tiếp từ người bệnh được trình bày ở phần tiếp sau đây:

– Lấy máu làm tiêu bản trực tiếp (lấy máu mao mạch)

+ Sát khuẩn ngón tay chích máu bằng cồn 70º, chờ khô

+ Dùng kim vô khuẩn chích vào vị trí sát khuẩn, sâu khoảng 1mm

+ Lau bỏ giọt máu đầu bằng bông khô, sạch

+ Vuốt nhẹ nhàng ngón tay vừa chích từ trên xuống dưới

+ Dùng lam kính sạch áp nhẹ vào giọt máu thứ 2, giọt máu cách đầu lam 2cm

+ Giọt máu thứ 3 cũng lấy bằng cách áp lam tương tự như giọt máu thứ 2, cách giọt máu thứ 2 khoảng 1.5cm

+ Dùng lam kính sạch khác đặt vào trung tâm giọt máu thứ 2 đánh theo hình xoắn ốc từ trong ra ngoài từ 5 – 6 vòng để được giọt máu đặc có đường kính 0.9 – 1.0cm

+ Tiếp theo, lấy lam kính kéo đặt lên phía trước giọt máu còn lại tạo thành góc 30º – 45º, lùi lam kéo về phía sau một chút để giọt máu được lan đều trên cạnh của lam kéo; đẩy từ

từ lam kéo về phía trước, ta được giọt đàn

+ Sát khuẩn tay cho người bệnh

+ Để lam khô tự nhiên

+ Đánh dấu tiêu bản bằng tên, mã số…theo quy định, tránh sai sót, nhầm lẫn

+ Cố định giọt đàn bằng cồn tuyệt đối: nghiêng tiêu bản khoảng 30º, dùng pipette nhỏ giọt lấy cồn phủ lên giọt đàn, cài lên giá, để khô

+ Giọt đặc thì không cố định Nhưng đối với những trường hợp giọt đặc quá dầy hay bẩn mốc thì phải dung giải bằng cách nhỏ nước cất hay Giemsa 1% trong 1- 2 phút, đổ nước, cắm lên giá, hong khô

* Tiến hành nhuộm:

– Xếp tiêu bản lên giá nhuộm, nhỏ dung dịch Giemsa phủ kín lên lam (nồng độ Giemsa

và thời gian nhuộm theo quy định)

– Rửa tiêu bản bằng nước sạch Lưu ý đổ nước nhẹ nhàng vào góc lam để nước sạch dần thay thế Giemsa, tránh rửa mạnh làm trôi bệnh phẩm

– Hong lam khô tự nhiên

* Tiêu chuẩn một tiêu bản nhuộm tốt:

Nhân bạch cầu có màu xanh tím, bào tương của bạch cầu lympho màu xanh lơ Hạt của bạch cầu

ái toan màu hồng đỏ

5 Nhận định kết quả:

* Đọc kết quả: Xác định mật độ KSTSR dưới KHV độ phóng đại 10 x 40 (để kiểm tra tiêu bản),

sau đó đọc dưới độ phóng đại 10 x 100 tìm KSTSR theo chiều ngang tiêu bản, tuần tự tránh bỏ sót, hoặc theo chiều dọc, tránh trùng lên nhau Khi xác định mật độ, ta đếm tất cả các thể của KSTSR

Phương pháp 1: Phương pháp dấu cộng:

Đánh giá như sau:

– 11-100 KSTSR/100 vi trường: (++)

– 1-10 KSTSR/1 vi trường: (+++)

– >10 KSTSR/1 vi trường: (++++)

Phương pháp 2: Phương pháp bạch cầu chuẩn:

Ở người bình thường có khoảng 8000 bạch cầu/m m3 máu

Bước 1: 200 bạch cầu và (>10 KST):

Số KST x 8000

Số bạch cầu đếm được=Số KST /m m

3

máu Bước 2: Đếm 200 bạch cầu và (<10 KST)=> Phải đếm đến 500 bạch cầu:

Số KST x 8000

500 =Số KST /mm

3

máu Bước 3: KST quá nhiều=>Đếm đến 500 KST=> được x bạch cầu:

500 x 8000

x =Số KST /m m

3

máu

* Xác định loại KSTSR dựa trên hình thái và tiêu chuẩn chẩn đoán theo quy định.

Lưu ý: Xác định KSTSR:

- Kháng thuốc: không đếm được thể giao bào(G)

=>Chỉ đếm được thể sinh sản vô tính là thể tư dưỡng (T) và thể phân liệt (S)

- Không kháng thuốc: Đếm được cả 3 thể (tùy loại) T, S, G

6 Những sai xót và xử trí:

– Chích đầu ngón tay không bỏ giọt máu đầu

– Quá trình chích máu nặn bóp nhiều

– Nhầm bệnh phẩm của người này sang người khác

– Quá trình cố định, nhuộm không tốt gây bong tróc, trôi mất bệnh phẩm

– Chẩn đoán sai do không bám sát tiêu chuẩn chẩn đoán

7 Hình ảnh thu được khi thực hành nhuộm Giemsa:

=> Kết luận: Sau khi nhuộm, ta thấy bạch cầu bắt màu tím sẫm (=>bạch cầu bắt chuẩn màu)

Nhuộm chưa đẹp, chưa đạt tiêu chuẩn

Bạch cầu trung tính

Bạch cầu Lympho