Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin b đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (2)

Cấu trúc và cơ chế hoạt động độc đáocho phép chúng dễ dàng kết hợp với màng của tế bào vi khuẩn, nấm và kísinh trùng, hình thành các lỗ trên màng và tiêu diệt các tác nhân đó.. Một công

Lời Cảm ơn Lời đầu tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Lai Thành, chủ nhiệm bộ môn Tế bào - Mô Phôi - Lý sinh, đồng thời là trởng phòng Công nghệ Tế bào Động vật - Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống Thầy đã trực tiếp hớng dẫn tôi trong suốt thời gian nghiên cứu và thực hiện luận văn này Thầy đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi cả trong công việc, cũng

nh trong quá trình tôi thực hiện thí nghiệm tại phòng Công nghệ Tế bào Động vật.

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới toàn thể cán bộ và sinh viên Phòng Công nghệ

Tế bào Động vật - Trung tâm Nghiên cứu Khoa học Sự sống, những ngời luôn bên tôi trong công việc, luôn nhiệt tính giúp đỡ tôi trong quá trình tôi làm việc

và nghiên cứu tại phòng

Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS Bùi Thị Việt Hà, chủ nhiệm bộ môn Vi sinh vật cùng tập thể các anh chị em ở phòng thí nghiệm Vi sinh - Khoa Sinh học - Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, những ngời đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận văn này.

Tôi xin giửi lời cảm ơn tới tập thể các thầy cô giáo trong Khoa Sinh học

- Trờng Đại học Khoa học Tự nhiên, đặc biệt là các thầy cô giáo trong bộ môn

Vi sinh vật học đã truyền đạt cho tôi những kiến thức sinh học trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu vừa qua.

Tôi xin gửi cảm ơn chân thành nhất đến gia đình và toàn thể bạn bè, những ngời đã luôn động viên, ủng hộ và là chỗ dựa tinh thần cho tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn này.

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đề tài QG09.18 đã hỗ trợ nguồn kinh phí cho tôi thực hiện luận văn này.

Hµ Néi, th¸ng n¨m 2011 Häc viªn

TrÞnh Thu H»ng

mRNA Messenger Ribonucleic acidtRNA Transfer ribonucleic acid

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH 3

1.1.1 Chất kháng sinh 3

1.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu CKS 3

1.1.3 Phân loại CKS 5

1.1.4 Cơ chế tác dụng của CKS 6

1.1.4.1 Ức chế tổng hợp thành tế bào 6

1.1.4.2 Phá hủy màng sinh chất 8

1.1.4.3 Ức chế tổng hợp protein 9

1.1.4.4 Ức chế các con đường trao đổi chất 10

1.1.4.5 Ức chế sự tổng hợp acid nucleic 11

1.1.5 Thực trạng kháng kháng sinh của các chủng VSV gây bệnh .12

1.2 PEPTIDE KHÁNG KHUẨN CECROPIN 14

1.2.1 Nguồn gốc của peptide kháng khuẩn 14

1.2.2 Phân bố tự nhiên của peptide kháng khuẩn 15

1.2.3 Cấu tạo của peptide kháng khuẩn 16

1.2.4 Tác động của peptide kháng khuẩn 17

1.2.4.1 Cơ chế tác động 17

1.2.4.2 Sự tác động chọn lọc của peptide kháng khuẩn 22

1.2.5 Ứng dụng của peptide kháng khuẩn 24

1.2.6 Peptide kháng khuẩn cecropin B 24

1.3 CHUYỂN GEN CECROPIN B VÀO TẾ BÀO VÀ CƠ THỂ

ĐỘNG VẬT 26

1.4 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT ĐƯỢC DÙNG ĐỂ CHUYỂN GEN CECROPIN B 28

1.4.1 Nguồn gốc và đặc điểm nguyên bào sợi 28

1.4.2 Ứng dụng của nguyên bào sợi nuôi cấy 30

1.5 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT GÂY BỆNH 31

Chương II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33

2.1 NGUYÊN LIỆU 33

2.1.1 Chủng giống 33

2.1.2 Hóa chất và dụng cụ 33

2.1.2.1 Hóa chất 33

2.1.2.2 Môi trường và dung dịch 34

2.1.2.3 Dụng cụ và vật tư 35

2.1.2.4 Thiết bị 35

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy và cấy chuyển nguyên bào sợi chuột .37

2.2.2 Phương pháp thu môi trường nuôi nguyên bào sợi chuột đã được chuyển gen cecropin B: 38

2.2.3 Phương pháp cô đặc môi trường nuôi nguyên bào sợi chuột đã được chuyển gen cecropin B 39

2.2.4 Phương pháp nhân nuôi và cất giữ vi khuẩn 39

2.2.5 Phương pháp đục lỗ 40

2.2.6 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 42

2.2.6.1 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của chấtkháng sinh 422.2.6.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của peptidececropin B: 432.2.6.3 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của CKSkết hợp với peptide cecropin B: 442.2.6.4 Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của môitrường nuôi cấy nguyên bào sợi chuột chuyển gen cecropin B: 45

Chương III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 47

3.1 ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA MỘT SỐ

CHỦNG VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NGƯỜI VÀ ĐỘNG

VẬT 473.2 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

CỦA PEPTIDE CECROPIN B 493.3 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

CỦA CECROPIN B KẾT HỢP VỚI KHÁNG SINH 523.3.1 Cecropin B gây nhạy cảm với kháng sinh ở chủng vi khuẩnkháng thuốc 523.3.2 Cecropin B làm tăng mức độ nhạy cảm kháng sinh ở chủng

vi khuẩn không kháng thuốc 543.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN

CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT NHẮT TRẮNG CHUYỂN GEN CECROPIN B 57

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60

KẾT LUẬN 60

KIẾN NGHỊ 61

TÀI LIỆU THAM KHẢO 62

DANH MỤC HÌNH ẢNH MINH HỌA

Hình 1 Cấu trúc peptide kháng khuẩn 17 Hình 2 Mô hình hoạt động kháng khuẩn của các peptide kháng khuẩn 18 Hình 3 Cơ chế hoạt động của peptide kháng khuẩn 20 Hình 4 Cơ sở của chọn lọc phân tử tế bào của peptide kháng khuẩn

[54] 23 Hình 5 Cấu trúc của nguyên bào sợi hoạt động [57] 29 Hình 6 Kết quả đánh giá tác động của ampicillin và puromycin đối với

hai chủng vi khuẩn Shigella flexneri (A) và Vibrio cholerae (B) 48 Hình 7 Kết quả thăm dò hoạt tính kháng khuẩn của peptitde cecropin B

với vi khuẩn Escherichia coli 50 Hình 8 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của chất kháng sinh

ampicillin và peptitde cecropin B với vi khuẩn Vibrio cholerae 50 Hình 9 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của peptitde cecropin

B kết hợp với chất kháng sinh ampicillin với hai chủng VSV Vibrio cholerae và Moraxella catarrhalis 53 Hình 10 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của peptitde cecropin B kết

hợp với chất kháng sinh ampicillin với chủng vi khuẩn Vibrio

cholerae 54 Hình 11 Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn của hỗn hợp peptitde

cecropin B và chất kháng sinh trên hai chủng vi khuẩn Salmonella typhi và Escherichia coli 56 Hình 12 Kết quả kiểm tra khả năng kháng khuẩn của môi trường đã nuôi

cấy nguyên bào sợi thai chuột sau chuyển gen 59

MỞ ĐẦU

Từ lâu, vấn đề kháng thuốc kháng sinh của các chủng vi sinh vật đã vàđang đặt ra thách thức đối với toàn nhân loại Chỉ 3 năm sau khi kháng sinhđầu tiên là penicillin được dùng trong điều trị, người ta phát hiện ra loại vi

khuẩn Staphylococcus aureus kháng lại "thần dược" này Tuy nhiên, số lượng

các loại kháng sinh mới ngày càng ít đi và đã bắt đầu thời điểm mà các khángsinh có mặt không đủ để điều trị các bệnh nhiễm khuẩn

Trước tình trạng bế tắc của việc tìm kiếm thuốc kháng sinh, các nhàkhoa học nhận thấy một triển vọng mới đầy hứa hẹn là các peptide khángkhuẩn Hiện nay, các peptide kháng khuẩn được coi như nguồn “kháng sinh

tự nhiên” của sinh giới đã được phát hiện ở nhiều loài sinh vật khác nhau

Thuộc nhóm peptide này, Cecropin đã được phân lập đầu tiên từ nhộng bướm

tằm Hyalophora cecropia bị lây nhiễm vi khuẩn, và sau đó là ở nhiều loại côntrùng 2 cánh

Cecropin là peptide kháng khuẩn có hoạt tính mạnh, nó tác động lên cả

vi khuẩn Gram âm và Gram dương [9] Cấu trúc và cơ chế hoạt động độc đáocho phép chúng dễ dàng kết hợp với màng của tế bào vi khuẩn, nấm và kísinh trùng, hình thành các lỗ trên màng và tiêu diệt các tác nhân đó Gen mã

hóa cho một số cecropin được thiết kế và tổng hợp đã cho thấy hiệu quả chống bệnh ở động vật và thực vật do vi khuẩn gây nên Gen cecropin đã

được sử dụng để tạo ra thực vật biến đổi gen (như khoai tây, thuốc lá) biểuhiện sự tăng cường tính kháng khuẩn hoặc nấm

Họ cecropin gồm có ba nhóm chính là cecropin A, B và D [11] Trong

đó cecropin B được biết đến với hoạt tính kháng khuẩn mạnh Với tính hiệu

quả trong việc kiểm soát mầm bệnh sinh ra do tác nhân vi khuẩn và côn trùng,

cecropin B cũng có thể có hiệu quả trong kiểm soát các mầm bệnh do các tác

nhân này gây nên ở cá, cũng như ở nhiều loài động vật Vì vậy mục đích

chính của nhóm nghiên cứu là thử nghiệm chuyển gen cecropin B vào tế bào

chuột nuôi cấy nhằm đánh giá khả năng tiếp nhận và biểu hiện gen khángkhuẩn này Một công việc quan trọng trong quá trình nghiên cứu là thửnghiệm hoạt tính kháng khuẩn, cũng như các nồng độ kháng khuẩn tối ưu của

cecropin lên một số chủng vi sinh vật gây bệnh trên động vật để làm cơ sở

đánh giá cecropin tái tổ hợp được sản xuất trong tế bào nuôi cấy

Vì thế chúng tôi đã tiến hành “Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật”

Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH

1.1.1 Chất kháng sinh

CKS (Chất kháng sinh - antibiotic) là các hợp chất hóa học do một số

VSV sinh ra mà ngay ở nồng độ thấp cũng có khả năng ức chế hoặc tiêu diệtcác VSV khác (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc ) một cách chọn lọc [1]

Một CKS tác động lên cả vi khuẩn G(+) lẫn vi khuẩn G(-) và nấm đượcgọi là một CKS phổ rộng Các CKS phổ hẹp chỉ tác dụng lên một nhóm VSV,chẳng hạn vancomycin, một glycopeptide

Trước đây, CKS được sử dụng trong điều trị các bệnh nhiễm trùng cónguồn gốc từ VSV (như vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn) Những năm gần đây vớinhững tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhiều CKS đã được tạo ra theo conđường bán tổng hợp (ampicillin) hoặc tổng hợp mới hoàn toàn(chloramphenicol) [41]

Như vậy, CKS là các chất kháng khuẩn tự nhiên, bán tổng hợp, hoặctổng hợp có hiệu quả diệt khuẩn ở nồng độ thấp Mỗi CKS thường chỉ có tácdụng với một nhóm VSV nhất định [4]

Số lượng CKS cách đây 1/4 thế kỷ chỉ khoảng vài trăm loại, nhưng đếnnăm 1993 số lượng này đã lên đến 6.000 Đầu thập kỷ này đã phát hiện thêm2.000 các sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học được tách chiết từVSV Ước tính số lượng thực sự của các chất này phải lên đến trên 15.000chất [30]

1.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu CKS

Người đặt nền móng đầu tiên cho việc nghiên cứu CKS là Alexander

Fleming Năm 1928, khi nuôi cấy tụ cầu vàng Staphylococcus aureus,

Alexander Fleming đã tình cờ để nhiễm một loại nấm mốc màu xanh Loại

nấm này đã tiết ra một chất ức chế sự sinh trưởng của S aureus và do đó tạo

thành một vòng vô khuẩn trong suốt bao quanh khuẩn lạc của nấm mốc

Fleming đã phân lập định tên loại nấm này là Penicillium notatum và đặt tên

chất kháng khuẩn này là penicillin Về sau ông còn phát hiện thêm làpenicillin còn ức chế sự sinh trưởng của hàng loạt vi khuẩn gây bệnh khác,như trực khuẩn gây bệnh bạch cầu, bệnh thận

Sự ra đời của penicillin đã kéo theo sự ra đời của hàng loạt các chấtkháng sinh khác Sau khi phát hiện ra penicillin, các nhà khoa học trên toànthế giới đã tích cực tìm kiếm, nghiên cứu thêm nhiều loại CKS có nguồn gốc

từ VSV

Năm 1944, Abraham Waksman, Schatz và Bugie đã phát hiện rastreptomycin dẫn đến một kỷ nguyên mới trong điều trị bệnh lao và bệnhviêm màng não Đây là một CKS phổ rộng, kháng được cả vi khuẩn G(-) lẫn

vi khuẩn G(+) Tốc độ tìm kiếm CKS ngày càng được đẩy mạnh Những năm

1940 – 1959 được coi là thời kỳ hoàng kim của CKS Hàng loạt CKS đượctách chiết và xác định: actinomicin (Waksman, 1940), chloramphenicol(Erhlich, 1947), chlotetracylin (Dugar, 1948) Ngày nay số lượng CKS đượcphát hiện lên tới trên 15000 chất, trong đó hàng trăm chất được dùng trong yhọc thực tiễn

Cùng với sự phát triển mạnh mẽ của các ngành Vi sinh vật học, Hóasinh học, Di truyền học phân tử và đặc biệt là sự ra đời của Công nghệ sinh

học (1975) đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực nghiên cứu CKS đạt đượcnhững thành tựu lớn lao.

1.1.3 Phân loại CKS

CKS có thể được phân loại theo nhiều cách tùy thuộc vào tiêu chí củacác nhà nghiên cứu Các nhà nghiên cứu dược liệu và các thầy thuốc muốnphân loại theo hoạt tính sinh học của CKS (CKS kháng khuẩn, CKS khángnấm, CKS phổ rộng, CKS phổ hẹp, CKS kháng vi khuẩn G(-), CKS kháng vikhuẩn G(+) ) Các nhà hóa sinh, sinh học phân tử muốn phân loại theo cơchế tác động của CKS Các nhà VSV muốn phân loại theo sản phẩm vi sinhhay con đường sinh tổng hợp Các nhà hóa học muốn phân loại theo các đặctính sinh lý, sinh hóa và nhiều tính chất khác dựa trên việc xác định rõ cấutrúc hóa học

Thông thường CKS được phân loại ra thành một số nhóm quan trọngsau:

- Nhóm β – lactam: về cấu trúc chúng đều có vòng β – lactam Nhómnày bao gồm:

+ Các penicillin: gồm có Penicillin, Ampicillin, Amoxicillin,Cloxacillin

+ Các cephalosporin: có 4 thế hệ I, II, III, IV Thế hệ I, II chủ yếu đểđiều trị các vi khuẩn G(+), thế hệ III, IV chủ yếu để điều trị vi khuẩn G(-).Gồm có: Cefadroxil, Cephalexin, Cefaclor, Cefixim, Ceftriaxon

- Nhóm tetracycline: là các CKS có hoạt phổ rộng, gồm có Tetracyclin,Doxycylin, Clotetracyclin, Minocyclin

- Nhóm Aminosid: có nguồn gốc từ vi sinh, có phổ tác dụng rộng, chủyếu trên vi khuẩn G(-) Gồm các kháng sinh Streptomycin, Neomycin,Paromomycin, Gentamycin

- Nhóm Chloramphenicol (hay Phenicol): Chloramphenicol,Thiamphenicol

- Nhóm Lincosamid: Lincomycin, Clindamycin

1.1.4 Cơ chế tác dụng của CKS

Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác dụng lênnhững vị trí khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng củaVSV Các CKS có thành phần và cấu trúc hóa học đặc trưng nên không cómột cơ chế tác dụng chung của các CKS đối với tất cả các VSV Đặc tính và

cơ chế tác dụng của CKS phụ thuộc vào bản chất hóa học của từng chất, nồng

độ và cấu trúc hiển vi của VSV Các chất có bản chất hóa học khác nhau thì

có ảnh hưởng khác nhau lên VSV, còn các chất có bản chất hóa học gần giốngnhau thì có hoạt phổ tương tự nhau Một số CKS khi ở nồng độ thấp thì không

có tác dụng ức chế mà còn có tác dụng kích thích sinh trưởng của VSV.Ngoài ra cùng một CKS nhưng ở các điều kiện khác nhau thì cơ chế tác dụnglên VSV khác nhau

Mỗi CKS có đích tác dụng và cơ chế tác dụng riêng nhằm ức chế hoặctiêu diệt hoàn toàn VSV kiểm định bằng cách tác động vào một hay nhiềubước của quá trình tổng hợp Có thể phân loại thành các cơ chế tác động sau:

1.1.4.1 Ức chế tổng hợp thành tế bào

Thành tế bào vi khuẩn là cấu trúc bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại ápsuất thẩm thấu Thành phần cấu trúc chủ yếu của thành tế bào là peptidoglican(PG) PG là một đại phân tử cấu tạo bởi các chuỗi polysaccarit bao gồm đơnphân là các dẫn xuất của đường glucose nằm xen kẽ nhau và lặp lại một cáchliên tục (NAG – NAM) Để tạo thành mạng lưới thực sự vững chắc, các chuỗipolysaccarit của PG phải liên kết chéo với nhau thông qua một đoạn peptidengắn giữa các tetrapeptide của tiểu phần NAM Để có thể sinh trưởng và phânchia, tế bào phải tổng hợp các đơn vị PG mới và vận chuyển nó tới đúng vị trísinh trưởng của thành tế bào [34] Phần lớn các tác nhân kháng khuẩn thôngthường đều hoạt động dựa trên sự ức chế quá trình hình thành liên kết chéogiữa các tetrapeptide của tiểu phần NAM Nổi bật nhất giữa các chất này làcác chất kháng sinh β – lactam mà đại diện là penicillin và cephalosporin.Đây là các kháng khuẩn có vùng chức năng là các vòng β – lactam

Các kháng sinh β – lactam ức chế sự hình thành PG mới bằng cách gắnchặt với enzyme transpeptidase cần thiết cho sự hình thành liên kết chéo giữacác chuỗi PG, kìm hãm enzyme này và làm gián đoạn sự tổng hợp thành tếbào của vi khuẩn [45] Trong khi đó tế bào vẫn sinh trưởng bình thường, thểtích tế bào cứ tăng lên mãi mà thiếu thành tế bào nên yếu đi nhanh chóng, vàđến một lúc sẽ phân giải vì không chịu nổi áp suất thẩm thấu Transpeptidaseđược mọi β – lactam ưa gắn vào nên được gọi là protein gắn penicillin PBP(Penicillin Binding Protein)

Tuy nhiên cần chú ý rằng các CKS này chỉ hoạt động ở giai đoạn sinhtrưởng của tế bào vi khuẩn mà không có tác dụng gì khi tế bào đã già hayđang ở trạng trạng thái nghỉ vì khi đó hoạt động sinh tổng hợp PG đã ngừnglại

Các penicillin không thấm được qua thành tế bào của vi khuẩn G(-) nênhiệu quả kháng các vi khuẩn này rất thấp Tuy nhiên các penicillin và cáccephalosporin phổ rộng hoặc bán tổng hợp có thể vượt qua màng ngoài vikhuẩn G(-) nên đã khắc phục được nhược điểm trên Tế bào người không có

PG nên các kháng sinh β – lactam rất ít độc cho người [45]

Các CKS khác như vancomycin hay CKS bán tổng hợp cycloserin ứcchế sự hình thành tế bào theo một cách khác Chúng cản trở trực tiếp sự hìnhthành cầu D – alanin – D – alanin liên kết các tiểu phần NAM của các vikhuẩn G(+) Tuy nhiên các vi khuẩn không có cầu D – alanin – D – alaninkháng tự nhiên với các kháng sinh này

Một CKS ức chế sự tổng hợp thành tế bào theo cách khác là bacitracin.CKS này ngăn cản sự vận chuyển của các đơn vị PG mới từ tế bào chất đến vịtrí sinh trưởng của thành tế bào Cũng như các kháng sinh β – lactam,vancomycin, cycloserin và bacitracin làm gián đoạn sự tổng hợp thành tế bàolàm cho tế bào vi khuẩn bị phân giải do áp suất thẩm thấu [45]

và động vật có thể bị tổn thương bởi amphotericin B vì chúng chứacholesterol là các phân tử có cấu trúc tương tự như ergosterol, mặc dù cáchliên kết của amphotericin B với cholesterol hơi khác so với ergosterol

Màng sinh chất của hầu hết vi khuẩn không chứa sterol nên chúng cókhả năng đề kháng với amphotericin B Tuy nhiên polyen vẫn có khả năngkháng vi khuẩn theo các cơ chế khác Polymycin là một ví dụ, CKS này được

tạo ra bởi vi khuẩn Bacillus polymyxa có khả năng kháng đặc hiệu với vi

khuẩn G(-) Polymycin phá vỡ màng sinh chất của vi khuẩn bằng cách gắnvào phospholipid của màng, làm méo mó bề mặt tế bào và thay đổi cấu trúccủa màng dẫn đến sự rò rỉ ra bên ngoài các nội quan của tế bào, gây chết tếbào

1.1.4.3 Ức chế tổng hợp protein

Protein là thành phần vô cùng quan trọng, không thể thiếu được của tếbào Do đó, việc cung cấp protein một cách liên tục là vấn đề quan trọngmang tính sống còn của tế bào Tất cả các sinh vật trong sinh giới đều có cùngmột kiểu tổng hợp protein từ ribosome dựa trên các thông tin mã hóa từmRNA Các CKS ức chế sự tổng hợp protein có thể tiêu diệt được cả vi khuẩnG(-) và vi khuẩn G(+)

Ribosome của vi khuẩn có sự khác biệt lớn đối với ribosome của sinhvật nhân thực cả về cấu trúc và kích thước Ribosome của vi khuẩn có hằng sốlắng là 70S, gồm hai tiểu phần là 30S và 50S Trong khi đó ribosome của sinhvật nhân thực có hằng số lắng là 80S, gồm hai tiểu phần là 40S và 60S Nhiềutác nhân kháng khuẩn có khả năng nhận biết sự khác biệt này của ribosome để

có thể tác dụng chọn lọc lên quá trình sinh tổng hợp của vi khuẩn mà khôngảnh hưởng đến tế bào nhân thực Tuy nhiên một số CKSn thuộc nhóm này cóthể gây hại cho người và động vật do chúng tác dụng lên ribosome 70S của tythể hoàn toàn giống với ribosome của vi khuẩn

Các tác nhân kháng khuẩn có đích tấn công là tiểu phần 30S củaribosome gồm các aminogicoside và các tetracyclin Aminoglycoside baogồm streptomycin, gentamycin, neomycin, kamacycin, tobramycin, Chúnggắn vào tiểu phần 30S của ribosome, làm biến dạng tiểu phần này và gây ra

sự bắt cặp không chính xác giữa các codon của mRNA và các anticodon củatRNA tương ứng Kết quả là làm cho mã di truyền trên phân tử mRNA bị đọcsai Ví dụ dưới tác dụng của streptomycin, codon UUU mã hóa chophenylalanin bị đọc sai thành AUU mã hóa cho isoleucin Tetracylin phong

bế vị trí gắn của phân tử RANt với RANm ở tiểu phần 30S, ngăn cản sự bổsung các acid amin vào chuỗi polypeptide đang được kéo dài [34]

Các tác nhân kháng khuẩn khác có đích tấn công là tiểu phần 50S củaribosome Chloramphenicol và một số CKS tương tự phong bế vị trí hoạtđộng của enzyme xúc tác cho sự tạo thành liên kết peptide giữa các acid amintrong chuỗi polypeptide đang kéo dài, ngăn cản sự tạo thành acid amin hoànchỉnh Clindamycin và các tác nhân kháng khuẩn macrolit bao gồmerythromycin gắn vào tiểu phần 50S ngăn cản sự dịch chuyển của ribosome từcodon này đến codon kế tiếp Kết quả là quá trình dịch mã bị cản trở và sựtổng hợp protein bị dừng lại

1.1.4.4 Ức chế các con đường trao đổi chất

Hầu hết các CKS loại này đều có cấu trúc tương tự các chất trao đổibình thường của tế bào như acid amin, coemzyme nên được gọi là các chấttrao đổi tác dụng theo kiểu ức chế cạnh tranh Ở nhiều VSV acid para –aminobenzoic (PABA) là cơ chất cho phản ứng enzyme dẫn đến sự tổng hợptetrahydrofolic (THF), một dạng của acid folic đóng vai trò như mộtcoenzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp các purin và purimydin của

từ DHF tổng hợp nên THF nhờ sự có mặt của các coenzyme xúc tác chuyểnPABA thành DHF Kết quả là sự thiếu hụt DHF đã cản trở sự tổng hợp THFgây ức chế sinh trưởng VSV.

Một tác nhân kháng chất trao đổi khác là trimetholprim cũng can thiệpvào quá trình tổng hợp acid nucleic Tuy nhiên thay vì gắn vào enzymechuyển hóa PABA thành DHF, trimetholprim lại gắn vào enzyme chuyểnDHF thành THF Các chất kháng chất trao đổi rất có giá trị trong y học vìchúng ức chế các tế bào vi khuẩn và động vật nguyên sinh mà không tác dụnglên tế bào người và động vật Nguyên nhân là do người không tổng hợp THF

từ PABA như vi khuẩn mà thay vào đó người thu nhận các acid folic đơn giản

từ các chất dinh dưỡng trong chế độ ăn uống rồi chuyển chúng thành THF

1.1.4.5 Ức chế sự tổng hợp acid nucleic

Acid nucleic bao gồm DNA và RNA, là các đại phân tử sinh học khôngthể thiếu đối với sự tổng hợp của tế bào Một số CKS cản trở quá trình saochép DNA và phiên mã ở VSV Các CKS này ảnh hưởng đến quá trình tổnghợp acid nucleic bằng cách ức chế sự tổng hợp các nucleotide, ức chế saochép hoặc làm dừng phiên mã Vì sự khác biệt giữa DNA của tế bàoprokaryote và eukaryote là rất nhỏ nên những CKS ức chế sinh tổng hợp acidnucleic không chỉ tiêu diệt VSV mà nó còn gây độc với cả con người Ví dụactinomycin gắn với DNA ức chế sự tổng hợp DNA và phiên mã không chỉ ởcác tế bào vi khuẩn mà cả với con người

Nhìn chung các CKS này không được dùng để điều trị các bệnh truyềnnhiễm Tuy nhiên chúng có thể được sử dụng để nghiên cứu quá trình saochép của DNA hoặc sử dụng nghiêm ngặt để làm chậm sự phát triển của tếbào ung thư

Các kháng sinh tổng hợp như quinolon và fluoroquinolon có khả năng

ức chế đặc hiệu DNA của tế bào prokaryote mà ít ảnh hưởng đến tế bàoeukaryote Những kháng sinh này ức chế hoạt động của enzyme tháo xoắn sợiDNA mạch kép trong quá trình sao chép DNA của tế bào Ví dụ ciprofloxaxinđược kê đơn trong các trường hợp nhiễm trùng đường hô hấp, nhiễm trùngđường tiết niệu hoặc trong các trường hợp nghi mắc bệnh than

Các kháng sinh khác ức chế hoạt động của RNA polymerase trong quátrình sinh tổng hợp RNA từ DNA mạch khuôn Một số kháng sinh bao gồmrifampin kết hợp mạnh mẽ với RNA polymerase của prokaryote nhưng ít ảnhhưởng đến RNA polymerase của eukaryote Kết quả là rifampin độc với vikhuẩn gây bệnh hơn so với con người Rifampin được sử dụng chủ yếu để

điều trị bệnh lao do vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis gây ra Clofazimin gắn với DNA của vi khuẩn Mycobacterium leprae gây bệnh phong và làm cản

trở quá trình sao chép cũng như phiên mã bình thường của tế bào vi khuẩn

Nó cũng được dùng để điều trị bệnh lao và các bệnh truyền nhiễm khác do

các vi khuẩn họ Mycobacteriaceae gây nên.

Các kháng sinh khác lại hoạt động như các chất trao đổi bằng cách cảntrở chức năng của các acid nucleic Chúng được gọi là các chất tương đồng vìcấu trúc giống với các nucleotide cấu tạo nên các acid nucleic Chính đặcđiểm đó đã cho phép chúng kết hợp được với DNA và RNA của vi khuẩn gâybệnh, làm thay đổi cấu trúc của chúng và dẫn đến làm dừng quá trình saochép, phiên mã, dịch mã Các CKS này thường được dùng để điều trị cácbệnh do virus gây ra

1.1.5 Thực trạng kháng kháng sinh của các chủng VSV gây bệnh

Kháng kháng sinh (hay còn gọi là kháng thuốc) là tình trạng các VSVnhư vi khuẩn, virut, nấm và ký sinh trùng thay đổi cách thức làm cho cácthuốc trị bệnh do chúng gây ra trở nên vô hiệu Vi khuẩn kháng hầu hết khángsinh gọi là vi khuẩn siêu kháng thuốc (superbug) Vấn đề kháng thuốc chẳngcòn mới mẻ, nhưng nó đã trở nên nguy hiểm, cấp bách, đòi hỏi sự nỗ lực hợpnhất nhằm giúp nhân loại tránh quay ngược lại thời kỳ chưa có kháng sinh(năm 1942)

CKS đã được sử dụng rộng rãi trong việc phòng chống bệnh cho câytrồng, vật nuôi và bảo quản lương thực, thực phẩm ngay từ những năm 50 –

60 [51], [55] Đến năm 1980 sản lượng CSK trên thế giới khoảng 25.000 tấn/năm Trong đó sản lượng penicillin các loại là 17.000 tấn, tetracylin 5.000tấn, [17] Đến nay, nhiều vi khuẩn đã kháng với penicillin, do thuốc bị lạmdụng, sử dụng quá mức hay không đúng yêu cầu Một số vi khuẩn không cònnhạy cảm với 8 hoặc 10 kháng sinh khác nhau Bệnh lao, một thời bịstreptomycin khống chế, nay đã trỗi dậy với đại dịch AIDS và giết hại khoảng

3 triệu người hàng năm Hiện nay, muốn tránh được tình trạng kháng thuốc,cần phối hợp cả 2 hay 3 kháng sinh, hoặc phải liên tục có những kháng sinhmới Tiếc rằng từ năm 1970 sáng kiến đã lụi dần

Có nhiều yếu tố gây nên tình trạng kháng kháng sinh Một trong nhữngnguyên nhân kháng thuốc là việc sử dụng ồ ạt kháng sinh trong chăn nuôi đểchữa bệnh và bổ sung với liều lượng thấp các thuốc kháng sinh vào thức ăn đểthúc đẩy tăng trưởng gia súc Năm 1974 Châu Âu đã cấm sử dụng penicillin,tetracylin và nhiều kháng sinh khác để nuôi thúc súc vật Sự xuất hiện ngàycàng nhiều các vi khuẩn đa kháng thuốc và sự thiếu hụt các nhóm kháng sinhmới làm cho chúng ta đang phải đối mặt với thời kỳ “hậu kháng sinh” [50]

Ngày càng có nhiều chủng VSV kháng kháng sinh Báo cáo của WHOcho thấy, mỗi năm trên thế giới ước tính có thêm 440.000 ca nhiễm mới bệnhlao đa kháng thuốc gây ít nhất 15.000 ca tử vong Ở Việt Nam con số này làkhoảng 5.900 ca nhiễm lao đa kháng thuốc gây tử vong ít nhất 1.800 ca mỗinăm Nghiêm trọng hơn là lao siêu kháng đa thuốc đã xuất hiện ở 58 quốc gia.Hiện tượng kháng thuốc điều trị sốt rét, HIV, nhiễm khuẩn bệnh viện, nhiễmkhuẩn thuông thường đang tăng lên nhanh chóng [54].

Với vi khuẩn E coli (gây bệnh tiêu chảy, viêm đường tiết niệu, ) cómức kháng cao tới 90% với kháng sinh Ampicillin, 80% với Cloramphericol

đã ngăn chặn được từ nhiều thập kỷ trước Đồng thời các căn bệnh khác đã có

từ lâu lại đang xuất hiện và có khả năng không có thuốc chữa Đây là vấn đềcủa toàn xã hội Các nhà nghiên cứu trên toàn thế giới đã và đang nỗ lực hếtsức để tìm ra những giải pháp cho vấn đề này

1.2 PEPTIDE KHÁNG KHUẨN CECROPIN

1.2.1 Nguồn gốc của peptide kháng khuẩn

Peptide kháng khuẩn (antimicrobial peptide – AMP) còn được gọi làpeptide bảo vệ vật chủ, là một họ các protein có trọng lượng phân tử nhỏ, hoạttính kháng khuẩn phổ rộng [25] Peptide kháng khuẩn là một thành phần bảo

tồn tiến hóa của các phản ứng miễn dịch bẩm sinh và được tìm thấy trong tất

cả các dạng sống, từ vi khuẩn tới thực vật, từ động vật không xương sống đếnđộng vật có xương sống, kể cả động vật có vú Các Peptide kháng khuẩn cóthể tiêu diệt vi khuẩn G(+) và G(-) (bao gồm cả các chủng kháng được thuốckháng sinh thông thường), mycobacteria (cả Mycobacterium gây bệnh lao),virus, nấm và thậm chí đôi khi cả các tế bào ung thư [58]

Hầu hết các cơ quan trong cơ thể đều sản xuất ra peptide kháng khuẩn.Loại peptide này là hàng rào phòng vệ đầu tiên chống lại sự nhiễm khuẩn,hình thành nên một phần của hệ thống miễn dịch tự nhiên cho hầu hết mọi cơthể sống [14]

Các peptide kháng khuẩn có thể được kích thích sinh ra trong trườnghợp phản ứng lại với các nguy cơ gây bệnh Tầm quan trọng của những hoạtđộng này trong hệ thống phòng vệ có thể thay đổi với các vùng khác nhau củacùng một cơ quan cụ thể, cũng như đối với các cơ quan khác nhau Cho tớihiện tại, hàng trăm loại peptide kháng khuẩn đã được phát hiện, và chứngminh tầm quan trọng của chúng trong hệ thống miễn dịch tự nhiên [25]

1.2.2 Phân bố tự nhiên của peptide kháng khuẩn

Peptide kháng khuẩn lần đầu tiên được phân lập từ vi khuẩn, chúng giếtchết các vi khuẩn khác có thể cạnh tranh chất dinh dưỡng [37] Peptide khángkhuẩn vi khuẩn được gọi là bacteriocins, có hoạt tính rất mạnh so với peptidekháng khuẩn của nhân thực Hoạt tính của chúng có thể có phổ hẹp hoặc rộng,

có thể giết chết vi khuẩn cùng loài hoặc khác loài [26]

Ở thực vật, peptide kháng khuẩn đóng vai trò quan trọng trong chốngnhiễm trùng do vi khuẩn và nấm gây nên Cho đến nay, chỉ có peptide có cấutrúc gấp nếp  được xác định trong thực vật, với hai nhóm được nghiên cứu

nhiều nhất là thionins và defensins Nghiên cứu thực vật chuyển gen cho thấytác động của thionins trong việc chống lại vi khuẩn gây bệnh Chúng có mặt ở

lá, hoa, hạt, củ [26]

Nhiều peptide kháng khuẩn được xác định ở động vật không xươngsống và nó đóng vai trò quan trọng bảo vệ cơ thể khỏi sinh vật gây bệnh Thậtvậy, vai trò của peptide kháng khuẩn và điều chỉnh sự biểu hiện của chúng,

bao gồm các tín hiệu có liên quan, được hiểu rõ nhất ở Drosophila [24].

Peptide kháng khuẩn được tìm thấy ở các tế bào máu dòng lympho, trong tếbào thực bào, và trong một số tế bào biểu mô động vật Một số peptide khángkhuẩn ở động vật không xương sống: cecropin và melittin có cấu trúc xoắn

các peptide dạng kẹp tóc  như tachyplesin và polyphemusin [36] Nhómpeptide phổ biến nhất ở động vật không xương sống là các defesins, có cấutrúc vòng mở rộng với ba hoặc bốn cầu disulfide, defesins chủ yếu kháng lại

vi khuẩn và nấm [26]

Peptide kháng khuẩn được phân lập từ nhiều loài động vật có xươngsống, bao gồm cá, lưỡng cư, động vật có vú và nó có vai trò quan trọng trongviệc bảo vệ cơ thể Hoạt động kháng khuẩn trực tiếp liên quan đến peptidekháng khuẩn ở động vật có xương sống có nhiều mức độ khác nhau phụ thuộcvào điều kiện sinh lý Ngoài ra các peptide kháng khuẩn còn tham gia điềuhòa miễn dịch và kiểm soát viêm nhiễm Chúng được tìm thấy ở những vị tríthường xuyên gặp tác nhân gây bệnh như niêm mạc, da và các tế bào miễndịch Cathelicidins là một nhóm lớn và đa dạng trong các peptide khángkhuẩn ở động vật có xương sống Chúng đặc trưng bởi đầu tận cùng NH2 bảothủ và bị cắt trong quá trình hoàn thiện, hoạt động của chúng chủ yếu phụthuộc vào đầu COOH Do đó, hầu hết cathelicidins được dự trữ ở trạng tháikhông hoạt động trong các tế bào miễn dịch, chủ yếu là trong bạch cầu trung

tính Cấu trúc của cathelicidins trưởng thành rất đa dạng: xoắn gấp nếp

giàu proline/arginine Cathelicidins được phân lập từ nhiều loài động vật

có vú như chuột, thỏ, cừu, ngựa, và con người [26]

1.2.3 Cấu tạo của peptide kháng khuẩn

Peptide kháng khuẩn là một nhóm các phân tử đa dạng và độc đáo,thường có khoảng 12-50 axit amin, tích điện dương, là phân tử lưỡng tính (có

cả tính ưa nước và kị nước) Chúng được chia thành các phân nhóm dựa trên

cơ sở thành phần và cấu trúc các axit amin Những peptide này bao gồm haihoặc nhiều chuỗi giàu arginine, lysine (trong môi trường axit có histidine) vàmột tỷ lệ lớn (thường trên 50%) các phần kỵ nước [38], [58]

Peptide kháng khuẩn có 4 dạng cấu trúc chính: peptide lưỡng tính (cóđầu ưa nước và đầu kỵ nước) – đây là cấu trúc đáng chú ý nhất với 2-4 nếpgấp beta (Hình 1C); peptide lưỡng cực (phân cực và không phân cực) có cấutrúc xoắn alpha (Hình 1E); cấu trúc hỗn hợp và cấu trúc mở rộng (Hình 1A,F) [26]

Hình 1 Cấu trúc peptide kháng khuẩn

(A) Cấu trúc hỗn hợp của β-defesin-2 ở người, (B) Vòng β của thanatin, (C) Nếp gấp β của polyphemusin, (D) Tấm beta của defesin-1 ở thận thỏ, (E) Xoắn α-helic của magarin-2, (F) Cấu trúc mở rộng của indolicidin [26]

Ngoài ra, một số dạng peptide kháng khuẩn không tạo cấu trúc rõ ràng

mà chỉ hình thành cấu trúc ổn định khi phân bố trên màng sinh chất, trong đócác chuỗi axit amin ưa nước và các chuỗi axit amin kỵ nước nằm đối nhautrong một phân tử xoắn, tạo điều kiện cho việc xen vào lớp lipit kép [58]

1.2.4 Tác động của peptide kháng khuẩn

1.2.4.1 Cơ chế tác động

Các phương thức hoạt động kháng khuẩn của peptide kháng khuẩn khá

đa dạng, bao gồm phá vỡ màng, cản trở sự trao đổi chất và nhằm vào cácthành phần trong tế bào chất (Hình 2) [58]

Đích tác động đầu tiên của peptide kháng khuẩn là cấu trúc thành vàmàng tế bào vi khuẩn Thông thường, các peptide kháng khuẩn tích điệndương có ái lực cao với các thành phần tích điện âm trên màng tế bào vikhuẩn, các lypopolysaccaride ở vi khuẩn G(-) và các axit teichoic, axitlipoteichoic, lysylphosphatidylglycerol ở vi khuẩn G(+) Nhờ điện tích vàkích thước phù hợp, Peptide kháng khuẩn chèn vào lớp màng lipid kép, hìnhthành các kênh vận chuyển tự do dẫn đến làm dung giải màng tế bào vi khuẩn[58]

http://www.bbcm.univ.trieste.it/~ antimic/researchAlfa –HelicalPeptides.html

Hình 2 Mô hình hoạt động kháng khuẩn của các peptide kháng khuẩn

(Theo mô hình hoạt động của các peptide kháng khuẩn xoắn anpha, được đề xuất bởi Phòng thí nghiệm Các peptide kháng khuẩn, khoa Hóa sinh học – Lý sinh học

và các Cao phân tử hóa học, trường Đại học Trieste, Italy)[58].

Một số mô hình khác nhau đã được đề xuất để giải thích làm thế nàosau khi tiếp xúc, các peptide kháng khuẩn có thể chèn vào màng tế bào vikhuẩn và tạo thành những lỗ trên màng, làm thay đổi tính thấm của màng.Tính lưỡng tính của peptide kháng khuẩn là chìa khóa quan trọng cho quátrình này, các khu vực kị nước tương tác trực tiếp với các thành phần lipid của

màng tế bào, trong khi vùng ưa nước tương tác với các nhóm đầuphotpholipid hoặc với các lỗ màng [26].

Khi xâm nhập vào tế bào, peptide kháng khuẩn liên kết với các thànhphần quan trọng trong tế bào, kích hoạt giải phóng enzyme tự phân giải, ứcchế tổng hợp DNA, RNA cũng như protein và ức chế hoạt động của một sốenzyme nhất định Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp, cơ chế chính xác cònchưa biết đến [18]

Mô hình “tập hợp” (Hình 3A), peptide kháng khuẩn di chuyển quamàng khi tập hợp với các mixen (vi hạt) – giống như phức hợp của peptide vàlipid Mô hình “lỗ hình xuyến” (Hình 3B) đề xuất rằng peptide kháng khuẩnchèn vuông góc với bề mặt màng với vùng ưa nước liên kết với đầuphotpholipid trong khi vùng kị nước liên kết với lõi lipid Trong quá trìnhnày, màng uốn cong vào trong để tạo thành lỗ với đầu ưa nước đối mặt vớitrung tâm của lỗ Mô hình “thùng-ván thùng” (Hình 3C), Peptide khángkhuẩn chèn vuông góc với bề mặt màng hình thành “ván thùng” trong

“thùng” – có hình bó, với vùng ưa nước của Peptide kháng khuẩn lót bêntrong thành lỗ và vùng kị nước tương tác với lớp kép lipid Trái ngược với cơchế “thùng-ván thùng” và cơ chế lỗ hình xuyến, mô hình thảm đề xuất rằngtập hợp các peptide kháng khuẩn gắn song song với lớp kép lipit, phủ ngoàigiống như tấm thảm [43] (Hình 3D) Ở nồng độ đủ cao, nó hoạt động nhưchất tẩy rửa, gây ra những bất ổn trên màng dẫn đến hình thành các lỗ trênmàng

Tất cả các peptide kháng khuẩn đều phải tương tác với màng tế bào,một số peptide không gây tổn thương màng tế bào nhưng vẫn giết chết vikhuẩn thông qua ức chế quá trình tổng hợp axit nucleic, tổng hợp protein,

Hình 3 Cơ chế hoạt động của peptide kháng khuẩn

Màng vi khuẩn là lớp kép lipid vàng với peptide là các hình trụ, vùng ưa nước màu

đỏ và vùng kị nước màu xanh Cơ chế giải thích quá trình tương tác của peptide kháng khuẩn với màng tế bào vi khuẩn: (A) mô hình “tập hợp”; (B) mô hình “lỗ hình xuyến”; (C) mô hình “thùng-ván thùng” và (D) mô hình “thảm” Cơ chế hoạt động của peptide không phá hủy màng: (E) ngăn cản quá trình tổng hợp mRNA; (F) ngăn cản quá trình tổng hợp protein; (G), (H): tác động vào hoạt động của

enzyme; (I): ngăn cản quá trình hình thành các thành phần cấu trúc tế bào ví dụ

như thành tế bào.

Peptide kháng khuẩn buforin II ở ếch di chuyển qua màng vi khuẩn và

gắn vào cả DNA và RNA trong tế bào chất vi khuẩn E.coli [26] Tương tự

peptide xoắn  như pleurocidin – một peptide kháng khuẩn có nguồn gốc từ

cá, và dermaseptin từ da ếch gây ức chế tổng hợp DNA và RNA mà không

gây mất ổn định màng tế bào E.coli (Hình 3E) Ức chế tổng hợp axit nucleic

cũng được chứng minh ở các nhóm Peptide kháng khuẩn khác như defesin(cấu trúc gấp ) ở người, và indolicidin (cấu trúc mở rộng) ở bò [52]

Hơn nữa, một số eptide kháng khuẩn can thiệp vào quá trình tổng hợpprotein (Hình 3F) Hoạt tính ức chế hoạt động của enzyme: pyrhocidin đi vào

tế bào đích, liên kết với DNAK – một protein liên quan đến quá trình gấpprotein Cụ thể, peptide ức chế hoạt động ATPase của DNAK, ngăn chặncuộn gấp protein dẫn đến tích tụ protein không biến đổi và tế bào chết (Hình3G) [29], [42]

Peptide kháng khuẩn cũng ngăn cản quá trình hình thành các thànhphần của tế bào như thành peptidoglycan (Hình 3I) Vi khuẩn tổng hợp nêncác lantibiotic mersacidin ngăn cản quá trình chuyển glycoside của lipid II,bước cần thiết trong tổng hợp peptidoglycan [26] Nisin, một lantibiotic khác,cũng liên kết với lipid II do đó ức chế tổng hợp thành tế bào Ngăn cản tổnghợp peptidoglican cũng là đích tác động của vancomycin, nhưng nisin tươngtác với các phân tử riêng biệt trong lipid II do đó chúng vẫn hoạt động chốnglại vi khuẩn kháng vancomycin [15], [31]

Cơ chế hoạt động của từng peptide kháng khuẩn khác nhau tùy thuộcvào tế bào đích, nồng độ và tính chất vật lý của màng tương tác Cũng có khả

nhiều cơ chế ví dụ như gây bất ổn màng kết hợp với ức chế các quá trình bêntrong tế bào Tính phức tạp của cơ chế này cùng với tác động đa đích chính lànguyên nhân chủ yếu cho việc rất khó khăn để tạo đột biến kháng lại cácpeptide kháng khuẩn [26].

Peptide kháng khuẩn còn được chứng minh là có một số chức năngđiều hòa miễn dịch, có thể tham gia vào việc khắc phục nhiễm trùng Chẳnghạn hepcidine ở người có khả năng thay đổi biểu hiện gen của vật chủ, nóhoạt động như các chemokine và kích thích sản xuất chemokine, ức chế cảmứng lipopolysaccharide để sản xuất cytokine gây viêm, do đó đẩy mạnh chữalành vết thương và điều chỉnh các phản ứng của tế bào đáp ứng miễn dịchthích ứng

1.2.4.2 Sự tác động chọn lọc của peptide kháng khuẩn

Các peptide kháng khuẩn luôn ưu tiên tương tác với vi khuẩn hơn với tếbào động vật, nhờ đó chúng tiêu diệt các vi sinh vật mà không gây độc đáng

kể đến tế bào chủ Có nhiều yếu tố liên quan chặt chẽ đến tác động chọn lọcnày, trong đó điện tích màng đóng góp nhiều nhất [21], [35]

Màng tế bào vi khuẩn rất giàu axit photpholipit, như photphoatidylglyceron và caridolipin, do đó nó tích điện âm và có ái lực mạnh với cácđiện tích dương của các peptide kháng khuẩn Sự tương tác này chủ yếu là lựctương tác tĩnh điện [35]

Ngược lại, phần bên ngoài của màng tế bào động vật có vú bao gồmchủ yếu là các chất béo có đầu tích điện âm ẩn sâu vào bên trong lớp màngsinh chất [21] Mặt khác, bề mặt ngoài màng được cấu tạo từ photpholipittrung tính, vì vậy sự tương tác kị nước giữa lớp này với mặt kị nước của cácpeptide kháng khuẩn đóng vai trò quan trọng trong sự kết hợp giữa peptide

kháng khuẩn với màng tế bào Tuy nhiên sự tương tác đó tương đối yếu so vớitương tác tĩnh điện, do vậy các peptide kháng khuẩn sẽ ưu tiên tương tác vớimàng vi khuẩn (Hình 4) [54].

Hình 4 Cơ sở của chọn lọc phân tử tế bào của peptide kháng khuẩn [54]

Ngoài ra, cholesterol thường phân bố rộng ở màng tế bào động vật giúpmàng ổn định, nhưng không có ở màng vi khuẩn Sự có mặt của cholesterolcũng làm giảm hoạt động của các peptide kháng khuẩn [59] Bên cạnh đó, khảnăng bị các nhân tố lạ xuyên màng của tế bào vi khuẩn là dễ dàng hơn nhiều

so với tế bào động vật bình thường, nên màng vi khuẩn dễ bị tấn công bởi cácpeptide kháng khuẩn tích điện dương [35] Tương tự như vậy, tế bào động vật

có khả năng điều hòa nồng độ ion làm giảm hoạt động của hầu hết các peptidekháng khuẩn trong khi vi khuẩn không có khả năng đó [59]

1.2.5 Ứng dụng của peptide kháng khuẩn

Các peptide kháng khuẩn có khả năng tiêu diệt vi khuẩn, nhưng hầunhư không độc với tế bào động vật, nhờ đó có thể sử dụng trong liệu phápchữa trị Nhờ hoạt động kháng khuẩn cũng như hoạt động miễn dịch hiệu quảcao, các peptide kháng khuẩn được coi như nguồn “kháng sinh tự nhiên” củasinh giới cần được khai thác trong bối cảnh nguồn thuốc kháng sinh tự nhiênđang dần cạn kiệt [44]

Ngoài ra, gen mã cho peptide kháng khuẩn còn được ứng dụng như mộtnguồn nguyên liệu quan trọng để tạo nên các sinh vật chuyển gen có khả năngkháng lại mầm bệnh Việc sử dụng thuốc trừ sâu và các tác nhân kháng khuẩnkhông còn là biện pháp tốt do giá thành cao và ảnh hưởng xấu tới môi trườngcũng như sức khỏe con người Việc tạo ra các giống cây trồng, vật nuôichuyển gen kháng khuẩn phần nào sẽ giúp giải quyết được những vấn đề trên.Thông qua các kỹ thuật sinh học phân tử, các nhà khoa học hy vọng rằng sẽ

có thể cải biến các peptide kháng khuẩn thành những dạng mới có tính bềnvững trong môi trường có nồng độ muối cao [12], [13]

1.2.6 Peptide kháng khuẩn cecropin B

Cecropin là một họ của peptide kháng khuẩn, được phân lập từ giai

đoạn nhộng của loài sâu bướm khổng lồ Hylaphora cecropia trong nghiên

cứu của Boman và cộng sự năm 1981 [13] Cecropin dạng trưởng thành gồm35-37 axit amin, tích điện dương và tác động lên cả vi khuẩn G(-) và G(+) [9]

Họ cecropin bao gồm ba nhóm chính là cecropin A, B, D [11]

Cecropin A là một peptide kháng khuẩn dạng thẳng, chứa 37 axit amin,

có cấu trúc chủ yếu là xoắn và gấp nếpCecropin A tiêu diệt vi khuẩnchủ yếu bằng cách phá hủy màng tế bào, trục dọc của cấu trúc và trục

ngang của cấu trúcđịnh hướng song song với bề mặt màng, từ đó xâmnhập và phá vỡ màng tế bào vi khuẩn [48], [49].

Cecropin B là một peptide kháng khuẩn nhỏ gồm 35 axit amin, khánglại cả vi khuẩn G(-) và G(+) Cấu trúc thứ cấp của cecropin B bao gồm mộtchuỗi xoắn tận cùng amino lưỡng tính liên kết với một chuỗi xoắn lớn tậncùng cacboxyl kị nước bởi vùng khớp nối [16]

Cecropin D chứa 36 axit amin và kỵ nước hơn so với cecropin A và B,

nó xuất hiện sau cecropin A và B khi cơ thể bị nhiễm khuẩn Cecropin D

chống lại cả vi khuẩn Gram âm và Gram dương, đặc biệt là Bacillus

megaterium [47].

Hoạt tính của cecropin chủ yếu do cấu trúc của hai vùng NH2 và COOHquy định Thay đổi cấu trúc của một trong hai vùng này có thể làm thay đổiđáng kể phổ hoạt động Một số nghiên cứu gần đây cho thấy cecropin đượcdùng như chỉ thị phân tử để phân biệt các loài vi khuẩn khác nhau [32] Bêncạnh việc sử dụng trực tiếp như các chất có hoạt tính kháng khuẩn, cecropinbiểu hiện trong một số động thực vật chuyển gen làm tăng khả năng chốngchịu với vi sinh vật gây bệnh

Hoạt tính kháng khuẩn của chúng đối với vi khuẩn G(-) thường hiệuquả hơn so với vi khuẩn G(+) Một số loại cecropin còn có khả năng gây ảnhhưởng tới chu kì nhiễm bệnh của virus HIV bằng cách ức chế biểu hiện cácgen của HIV–1, qua đó cản trở quá trình nhân lên của virus này [10].Cecropin làm giảm số lượng tế bào vi khuẩn thông qua việc phân hủy màng tếbào chất Chúng cũng phân hủy liposome tích điện âm và trung hòa điệnnhưng không phân hủy liposome dương cũng như tế bào hồng cầu [56]

Hoạt tính kháng ung thư của cecropin đã được công bố từ nhữngnghiên cứu của các nhà khoa học trường đại học Bradford (Hoa Kì) năm

1994 Những thử nghiệm in vitro cho thấy cecropin B có hoạt tính làm tan

bào đối với các dòng tế bào ung thư vú và buồng trứng ở người Kết quả

nghiên cứu trong điều kiện in vivo cho thấy cecropin B giúp kéo dài thời gian

sống sót của những con chuột bị ung thư cổ trướng ác tính Báo cáo mới nhấtnăm 2008 được công bố cho thấy cecropin B có khả năng ức chế sự tăng sinhcủa các tế bào ung thư bàng quang, phá hủy cấu trúc màng tế bào và gây chếtđối với các tế bào ung thư [22], [38]

1.3 CHUYỂN GEN CECROPIN B VÀO TẾ BÀO VÀ CƠ THỂ ĐỘNG VẬT

1.3.1 Khái quát về kỹ thuật chuyển gen

Kỹ thuật chuyển gen khởi đầu được dùng để nghiên cứu các cơ chếphân tử của việc biểu hiện và điều hòa gen trong những nghiên cứu củaVaheri và Pagano năm 1965 Các tác giả này đã chuyển các phân tử ADN trầnvào tế bào với mong muốn tìm hiểu ảnh hưởng của đoạn chuyển vào lên tếbào Từ cột mốc này, các nhà khoa học đã phát triển nhiều hệ thống chuyểngen có hiệu quả Chức năng của nhiều đoạn gen lần lượt được giải đáp nhờ kỹthuật chuyển gen Thêm vào đó, các vấn đề về điều hòa chức năng gen, điềuhòa phiên mã và dịch mã, sự biểu hiện và vai trò các protein trong tế bào ngàycàng được sáng tỏ Sự ra đời và phát triển của công nghệ DNA tái tổ hợp đãtạo ra các vector biểu hiện cả trong tế bào nhân sơ và nhân chuẩn (vector conthoi) Nhờ đó, các vector được nhân dòng trong nhân sơ và biểu hiện ở nhiềuloại tế bào nhân chuẩn khác nhau [5, 6] Gần đây, kỹ thuật chuyển gen đãđược ứng dụng trong liệu pháp gen chữa trị các bệnh di truyền, ung thư và cácbệnh liên quan đến virus

Động vật chuyển gen là những sinh vật được thay đổi vật liệu di truyềnmột cách có chủ ý bằng công nghệ sinh học hiện đại DNA ngoại lai được đưavào động vật sử dụng công nghệ DNA tái tổ hợp, sau đó chúng đi vào dòngmầm và tạo ra cơ thể có nguyên liệu di truyền bị biến đổi Khi di truyền họcphân tử còn chưa phát triển, cách duy nhất để nghiên cứu hoạt động, chứcnăng của gen là thông qua việc quan sát các đặc điểm di truyền hoặc nhữngđột biến biểu hiện thành kiểu hình Những hiểu biết về sinh học phát triển và

kỹ thuật di truyền cho phép nhanh chóng phát triển các phương pháp tạo độngvật chuyển gen Vi tiêm DNA ngoại lai là kỹ thuật tạo động vật chuyển genđầu tiên đã được chứng minh thành công ở động vật có vú, được áp dụng ởchuột [19] và sau đó đến thỏ, cừu, lợn, chim và cá [55] Hai kỹ thuật sau đóđược phát triển là chuyển gen qua tinh trùng [33] và chuyển gen thông qua tếbào gốc [20] Từ năm 1981, khi động vật chuyển gen đầu tiên được tạo ra[19], công nghệ tạo động vật chuyển gen và ứng dụng của nó ngày càng đượcphát triển rộng rãi

Chuyển gen ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu vàtrong công nghiệp với các mục đích khác nhau Nhờ công nghệ chuyển gen

mà các nhà khoa học đã tạo ra những gia súc có năng suất và chất lượng cao.Ứng dụng quan trọng đối với vật nuôi chuyển gen là sản xuất protein dượcliệu trong sữa

Gia cầm chuyển gen cung cấp trứng mang các protein tái tổ hợp Chúngđang là niềm hy vọng cho con người trong công nghệ dược phẩm và thựcphẩm

Công nghệ chuyển gen ở cá tạo nên những vật nuôi tăng trưởng nhanh,chống chịu tốt hoặc sử dụng trong việc xác định chất lượng môi trường nước

1.3.2 Những ứng dụng chuyển gen cecropin

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu chuyển genCecropin B vào thực vật cũng như động vật để tạo ra cơ thể chuyển gen vớiđặc tính kháng khuẩn

Bệnh do vi khuẩn gây nên đã gây thiệt hại lớn trong nông nghiệp, đặcbiệt là ở một số loại cây trồng quan trọng như lúa, rau và trái cây Các nhàkhoa học trên thế giới đã và đang cố gắng chuyển gen cecropin vào các câytrồng này để kiểm soát các tác nhân gây bệnh cây trồng [40]

Gen cecropin đã được chuyển vào cây lúa để kiểm soát bệnh bạc lá ởcây lúa Ở cây thuốc lá, gen cecropin được chuyển vào để kháng vi khuẩn

Pseudomonas syringane pv tabaci gây bệnh đốm lá.

Đối với động vật, nghiên cứu chuyển gen cecropin đã được tiến hànhtrên một số đối tượng Trong đó đạt được nhiều thành tựu đáng kể nhất lànghiên cứu chuyển gen cecropin ở một số loài cá Đặc biệt ở cá ngựa vằn, gencecropin B được chuyển vào đã tăng khả năng đề kháng với các bệnh do vikhuẩn gây nên [46]

1.4 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT ĐƯỢC DÙNG ĐỂ CHUYỂN GEN CECROPIN B

1.4.1 Nguồn gốc và đặc điểm nguyên bào sợi

Ở giai đoạn phát triển phôi sớm, các tế bào gốc trung mô tách ra khỏitrung bì, phân bố rộng rãi ở ngoại bì và nội bì và biệt hóa thành các dạng tếbào của mô liên kết trong đó có nguyên bào sợi [57]

Nguyên bào sợi có tế bào chất phân nhánh bao quanh một nhân hìnhelip gồm một hoặc hai hạch nhân Nguyên bào sợi hoạt động có mạng lưới nội

chất có hạt hoạt động mạnh (Hình 5) Trong khi đó, các nguyên bào khônghoạt động có kích thước nhỏ so với nguyên bào sợi hoạt động [57].

Hình 5 Cấu trúc của nguyên bào sợi hoạt động [57]

Hình thái nguyên bào sợi thay đổi tùy theo vị trí và hoạt động củachúng Trong một số điều kiện thích hợp, các tế bào biểu mô có thể trở thànhcác nguyên bào sợi, gọi là sự chuyển trạng thái biểu mô–trung mô Ngược lại,trong một số trường hợp, nguyên bào sợi có thể chuyển thành tế bào biểu môgọi là sự chuyển trạng thái trung mô – biểu mô Quá trình này được phát hiệntrong nhiều giai đoạn phát triển phôi như trong sự phát triển tế bào thần kinh[57]

Trong cơ thể, nguyên bào sợi có chức năng tổng hợp collagen, sợi lướielastin, laminin, decorin, fibronectin, glycosaminoglycan và glycoprotein củachất nền ngoại bào Chúng tổng hợp các protein đệm tạo nên sự bền vững và

toàn vẹn của mô khi vết thương đã liền Ðồng thời nguyên bào sợi là nguồncung cấp quan trọng một số yếu tố tăng trưởng kích thích liền vết thương nhưTGF–β (Transforming Growth Factor–β), PDGF (Platelet–Derived GrowthFactor), KGF (Keratinocyte growth factor) [23].

1.4.2 Ứng dụng của nguyên bào sợi nuôi cấy

Nguyên bào sợi có vai trò quan trọng trong sự hình thành và tồn tại của

mô liên kết, hỗ trợ sự phát triển của các loại tế bào khác và tham gia vào quátrình hàn gắn vết thương Do vậy, tế bào này được sử dụng rộng rãi trongnghiên cứu

Trong nghiên cứu cơ bản, nguyên bào sợi là loại tế bào dễ phân lập vànuôi cấy Chúng được sử dụng để nghiên cứu chức năng của gen, sự điều hòabiểu hiện gen, đột biến, tìm hiểu vai trò các phân tử trong các con đường hóa

sinh… Khi nuôi cấy in vitro, nguyên bào sợi vẫn giữ khả năng tiết ra các nhân

tố sinh trưởng, đồng thời có độ bám dính tốt nên nguyên bào sợi nguyên phátđược sử dụng làm lớp tế bào nuôi trong nuôi cấy tế bào gốc Trong nhữngnăm gần đây, nguyên bào sợi là loại tế bào được sử dụng trong nhân bản vôtính và trong giải biệt hóa tế bào Nguyên bào sợi “bất tử” có sự đồng nhất vềhình thái và tính chất, tăng sinh mạnh mà không gặp phải giới hạn về già hóanên được ứng dụng trong nghiên cứu thử nghiệm chuyển gen [28]

Trong nghiên cứu ứng dụng, với vai trò to lớn trong quá trình hàn gắnvết thương, các nguyên bào sợi được ứng dụng để cấy ghép tự thân cho cácbệnh nhân bị tổn thương về da như bỏng, viêm loét do bệnh đái tháo đường.Các nguyên bào sợi và các tế bào sừng thu nhận từ mẫu da sinh thiết của bệnh

nhân được nuôi cấy in vitro, sau đó chúng được cấy ghép trở lại cho người

bệnh Điều này sẽ tránh khỏi những vấn đề về thải loại miễn dịch [27], [53]