Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)

Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)Đánh giá khả năng kháng khuẩn của cecropin B đối với một số chủng vi khuẩn gây bệnh trên động vật (luận văn thạc sĩ)

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - - TRỊNH THU HẰNG ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA CECROPIN B ĐỐI VỚI MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN ĐỘNG VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội - 2011 Luận văn thạc sỹ - Khoa Sinh học MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH 1.1.1 Chất kháng sinh 1.1.2 Sơ lƣợc lịch sử nghiên cứu CKS 1.1.3 Phân loại CKS 1.1.4 Cơ chế tác dụng CKS 1.1.4.1 Ức chế tổng hợp thành tế bào 1.1.4.2 Phá hủy màng sinh chất 11 1.1.4.3 Ức chế tổng hợp protein 12 1.1.4.4 Ức chế đường trao đổi chất 13 1.1.4.5 Ức chế tổng hợp acid nucleic 14 1.1.5 Thực trạng kháng kháng sinh chủng VSV gây bệnh 15 1.2 PEPTIDE KHÁNG KHUẨN CECROPIN 17 1.2.1 Nguồn gốc peptide kháng khuẩn 17 1.2.2 Phân bố tự nhiên peptide kháng khuẩn 18 1.2.3 Cấu tạo peptide kháng khuẩn 19 1.2.4 Tác động peptide kháng khuẩn 20 1.2.4.1 Cơ chế tác động 20 1.2.4.2 Sự tác động chọn lọc peptide kháng khuẩn 25 1.2.5 Ứng dụng peptide kháng khuẩn 27 1.2.6 Peptide kháng khuẩn cecropin B 27 1.3 CHUYỂN GEN CECROPIN B VÀO TẾ BÀO VÀ CƠ THỂ ĐỘNG VẬT 29 1.4 GIỚI THIỆU VỀ NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT ĐƢỢC DÙNG ĐỂ CHUYỂN GEN CECROPIN B 31 1.4.1 Nguồn gốc đặc điểm nguyên bào sợi 31 1.4.2 Ứng dụng nguyên bào sợi nuôi cấy 33 1.5 ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC MỘT SỐ CHỦNG VI SINH VẬT GÂY BỆNH 34 Chƣơng II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 36 2.1 NGUYÊN LIỆU 36 2.1.1 Chủng giống 36 2.1.2 Hóa chất dụng cụ 36 2.1.2.1 Hóa chất 36 2.1.2.2 Môi trường dung dịch 37 2.1.2.3 Dụng cụ vật tư 38 2.1.2.4 Thiết bị 38 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.2.1 Phƣơng pháp nuôi cấy cấy chuyển nguyên bào sợi chuột 40 2.2.2 Phƣơng pháp thu môi trƣờng nuôi nguyên bào sợi chuột đƣợc chuyển gen cecropin B: 41 2.2.3 Phƣơng pháp cô đặc môi trƣờng nuôi nguyên bào sợi chuột đƣợc chuyển gen cecropin B 42 2.2.4 Phƣơng pháp nhân nuôi cất giữ vi khuẩn 42 2.2.5 Phƣơng pháp đục lỗ 43 2.2.6 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn 45 2.2.6.1 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn chất kháng sinh 45 2.2.6.2 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn peptide cecropin B: 46 2.2.6.3 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn CKS kết hợp với peptide cecropin B: 47 2.2.6.4 Phƣơng pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn môi trƣờng nuôi cấy nguyên bào sợi chuột chuyển gen cecropin B: 48 Chƣơng III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50 3.1 ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN GÂY BỆNH TRÊN NGƢỜI VÀ ĐỘNG VẬT 50 3.2 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA PEPTIDE CECROPIN B 52 3.3 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CECROPIN B KẾT HỢP VỚI KHÁNG SINH 55 3.3.1 Cecropin B gây nhạy cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn kháng thuốc 55 3.3.2 Cecropin B làm tăng mức độ nhạy cảm kháng sinh chủng vi khuẩn không kháng thuốc 57 3.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT NHẮT TRẮNG CHUYỂN GEN CECROPIN B 60 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO 65 MỞ ĐẦU Từ lâu, vấn đề kháng thuốc kháng sinh chủng vi sinh vật đặt thách thức toàn nhân loại Chỉ năm sau kháng sinh penicillin đƣợc dùng điều trị, ngƣời ta phát loại vi khuẩn Staphylococcus aureus kháng lại "thần dƣợc" Tuy nhiên, số lƣợng loại kháng sinh ngày bắt đầu thời điểm mà kháng sinh có mặt không đủ để điều trị bệnh nhiễm khuẩn Trƣớc tình trạng bế tắc việc tìm kiếm thuốc kháng sinh, nhà khoa học nhận thấy triển vọng đầy hứa hẹn peptide kháng khuẩn Hiện nay, peptide kháng khuẩn đƣợc coi nhƣ nguồn “kháng sinh tự nhiên” sinh giới đƣợc phát nhiều loài sinh vật khác Thuộc nhóm peptide này, Cecropin đƣợc phân lập từ nhộng bƣớm tằm Hyalophora cecropia bị lây nhiễm vi khuẩn, sau nhiều loại côn trùng cánh Cecropin peptide kháng khuẩn có hoạt tính mạnh, tác động lên vi khuẩn Gram âm Gram dƣơng [9] Cấu trúc chế hoạt động độc đáo cho phép chúng dễ dàng kết hợp với màng tế bào vi khuẩn, nấm kí sinh trùng, hình thành lỗ màng tiêu diệt tác nhân Gen mã hóa cho số cecropin đƣợc thiết kế tổng hợp cho thấy hiệu chống bệnh động vật thực vật vi khuẩn gây nên Gen cecropin đƣợc sử dụng để tạo thực vật biến đổi gen (nhƣ khoai tây, thuốc lá) biểu tăng cƣờng tính kháng khuẩn nấm Họ cecropin gồm có ba nhóm cecropin A, B D [11] Trong cecropin B đƣợc biết đến với hoạt tính kháng khuẩn mạnh Với tính hiệu việc kiểm soát mầm bệnh sinh tác nhân vi khuẩn côn trùng, cecropin B có hiệu kiểm soát mầm bệnh tác nhân gây nên cá, nhƣ nhiều loài động vật Vì mục đích nhóm nghiên cứu thử nghiệm chuyển gen cecropin B vào tế bào chuột nuôi cấy nhằm đánh giá khả tiếp nhận biểu gen kháng khuẩn Một công việc quan trọng trình nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, nhƣ nồng độ kháng khuẩn tối ƣu cecropin lên số chủng vi sinh vật gây bệnh động vật để làm sở đánh giá cecropin tái tổ hợp đƣợc sản xuất tế bào nuôi cấy Vì tiến hành “Đánh giá khả kháng khuẩn cecropin B số chủng vi khuẩn gây bệnh động vật” Chƣơng I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 GIỚI THIỆU VỀ CHẤT KHÁNG SINH 1.1.1 Chất kháng sinh CKS (Chất kháng sinh - antibiotic) hợp chất hóa học số VSV sinh mà nồng độ thấp có khả ức chế tiêu diệt VSV khác (vi khuẩn, nấm men, nấm mốc ) cách chọn lọc [1] Một CKS tác động lên vi khuẩn G(+) lẫn vi khuẩn G(-) nấm đƣợc gọi CKS phổ rộng Các CKS phổ hẹp tác dụng lên nhóm VSV, chẳng hạn vancomycin, glycopeptide Trƣớc đây, CKS đƣợc sử dụng điều trị bệnh nhiễm trùng có nguồn gốc từ VSV (nhƣ vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn) Những năm gần với tiến khoa học kỹ thuật, nhiều CKS đƣợc tạo theo đƣờng bán tổng hợp (ampicillin) tổng hợp hoàn toàn (chloramphenicol) [41] Nhƣ vậy, CKS chất kháng khuẩn tự nhiên, bán tổng hợp, tổng hợp có hiệu diệt khuẩn nồng độ thấp Mỗi CKS thƣờng có tác dụng với nhóm VSV định [4] Số lƣợng CKS cách 1/4 kỷ khoảng vài trăm loại, nhƣng đến năm 1993 số lƣợng lên đến 6.000 Đầu thập kỷ phát thêm 2.000 sản phẩm trao đổi chất có hoạt tính sinh học đƣợc tách chiết từ VSV Ƣớc tính số lƣợng thực chất phải lên đến 15.000 chất [30] 1.1.2 Sơ lược lịch sử nghiên cứu CKS Ngƣời đặt móng cho việc nghiên cứu CKS Alexander Fleming Năm 1928, nuôi cấy tụ cầu vàng Staphylococcus aureus, Alexander Fleming tình cờ để nhiễm loại nấm mốc màu xanh Loại nấm tiết chất ức chế sinh trƣởng S aureus tạo thành vòng vô khuẩn suốt bao quanh khuẩn lạc nấm mốc Fleming phân lập định tên loại nấm Penicillium notatum đặt tên chất kháng khuẩn penicillin Về sau ông phát thêm penicillin ức chế sinh trƣởng hàng loạt vi khuẩn gây bệnh khác, nhƣ trực khuẩn gây bệnh bạch cầu, bệnh thận Sự đời penicillin kéo theo đời hàng loạt chất kháng sinh khác Sau phát penicillin, nhà khoa học toàn giới tích cực tìm kiếm, nghiên cứu thêm nhiều loại CKS có nguồn gốc từ VSV Năm 1944, Abraham Waksman, Schatz Bugie phát streptomycin dẫn đến kỷ nguyên điều trị bệnh lao bệnh viêm màng não Đây CKS phổ rộng, kháng đƣợc vi khuẩn G(-) lẫn vi khuẩn G(+) Tốc độ tìm kiếm CKS ngày đƣợc đẩy mạnh Những năm 1940 – 1959 đƣợc coi thời kỳ hoàng kim CKS Hàng loạt CKS đƣợc tách chiết xác định: actinomicin (Waksman, 1940), chloramphenicol (Erhlich, 1947), chlotetracylin (Dugar, 1948) Ngày số lƣợng CKS đƣợc phát lên tới 15000 chất, hàng trăm chất đƣợc dùng y học thực tiễn Cùng với phát triển mạnh mẽ ngành Vi sinh vật học, Hóa sinh học, Di truyền học phân tử đặc biệt đời Công nghệ sinh học (1975) tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực nghiên cứu CKS đạt đƣợc thành tựu lớn lao 1.1.3 Phân loại CKS CKS đƣợc phân loại theo nhiều cách tùy thuộc vào tiêu chí nhà nghiên cứu Các nhà nghiên cứu dƣợc liệu thầy thuốc muốn phân loại theo hoạt tính sinh học CKS (CKS kháng khuẩn, CKS kháng nấm, CKS phổ rộng, CKS phổ hẹp, CKS kháng vi khuẩn G(-), CKS kháng vi khuẩn G(+) ) Các nhà hóa sinh, sinh học phân tử muốn phân loại theo chế tác động CKS Các nhà VSV muốn phân loại theo sản phẩm vi sinh hay đƣờng sinh tổng hợp Các nhà hóa học muốn phân loại theo đặc tính sinh lý, sinh hóa nhiều tính chất khác dựa việc xác định rõ cấu trúc hóa học Thông thƣờng CKS đƣợc phân loại thành số nhóm quan trọng sau: - Nhóm β – lactam: cấu trúc chúng có vòng β – lactam Nhóm bao gồm: + Các penicillin: gồm có Penicillin, Ampicillin, Amoxicillin, Cloxacillin + Các cephalosporin: hệ I, II, III, IV Thế hệ I, II chủ yếu để điều trị vi khuẩn G(+), hệ III, IV chủ yếu để điều trị vi khuẩn G(-) Gồm có: Cefadroxil, Cephalexin, Cefaclor, Cefixim, Ceftriaxon - Nhóm tetracycline: CKS có hoạt phổ rộng, gồm có Tetracyclin, Doxycylin, Clotetracyclin, Minocyclin - Nhóm Aminosid: có nguồn gốc từ vi sinh, có phổ tác dụng rộng, chủ yếu vi khuẩn G(-) Gồm kháng sinh Streptomycin, Neomycin, Paromomycin, Gentamycin - Nhóm Chloramphenicol (hay Phenicol): Chloramphenicol, Thiamphenicol - Nhóm Lincosamid: Lincomycin, Clindamycin 1.1.4 Cơ chế tác dụng CKS Cơ chế tác dụng CKS cách thức mà CKS tác dụng lên vị trí khác tế bào, qua ảnh hƣởng đến sinh trƣởng VSV Các CKS có thành phần cấu trúc hóa học đặc trƣng nên chế tác dụng chung CKS tất VSV Đặc tính chế tác dụng CKS phụ thuộc vào chất hóa học chất, nồng độ cấu trúc hiển vi VSV Các chất có chất hóa học khác có ảnh hƣởng khác lên VSV, chất có chất hóa học gần giống có hoạt phổ tƣơng tự Một số CKS nồng độ thấp tác dụng ức chế mà có tác dụng kích thích sinh trƣởng VSV Ngoài CKS nhƣng điều kiện khác chế tác dụng lên VSV khác Mỗi CKS có đích tác dụng chế tác dụng riêng nhằm ức chế tiêu diệt hoàn toàn VSV kiểm định cách tác động vào hay nhiều bƣớc trình tổng hợp Có thể phân loại thành chế tác động sau: 1.1.4.1 Ức chế tổng hợp thành tế bào Thành tế bào vi khuẩn cấu trúc bảo vệ tế bào vi khuẩn chống lại áp suất thẩm thấu Thành phần cấu trúc chủ yếu thành tế bào peptidoglican (PG) PG đại phân tử cấu tạo chuỗi polysaccarit bao gồm đơn phân dẫn xuất đƣờng glucose nằm xen kẽ lặp lại cách liên tục (NAG – NAM) Để tạo thành mạng lƣới thực vững chắc, chuỗi polysaccarit PG phải liên kết chéo với thông qua đoạn peptide ngắn tetrapeptide tiểu phần NAM Để sinh trƣởng phân Moraxella catarrhalis - - - - (+): Có vòng kháng khuẩn, (++): Vòng kháng khuẩn rộng, (-) : Không có vòng kháng khuẩn Nhƣ số bảy chủng vi khuẩn thử nghiệm, có năm chủng có biểu vòng kháng hai loại chất kháng sinh, với hai nồng độ 0,05 0,1 mg/ml Trong số đó, chủng Shigella flexneri nhạy cảm so với bốn chủng lại, thể việc chất kháng sinh tạo vòng kháng khuẩn với đƣờng kính lớn chủng vi khuẩn (Hình 6A) Còn hai chủng vi khuẩn Vibrio cholerae Moraxella catarrhalis vòng kháng khuẩn với hai loại chất kháng sinh thử nghiệm, hai nồng độ kháng sinh thử nghiệm (Hình 6B) Nhƣ nói hai chủng vi khuẩn không nhạy cảm với chất kháng sinh, hay ta xem chúng chủng vi khuẩn kháng hai loại kháng sinh ampicillin puromycin Shigella flexneri Vibrio cholerae A B Hình Kết đánh giá tác động ampicillin puromycin hai chủng vi khuẩn Shigella flexneri (A) Vibrio cholerae (B) 51 ĐC: Đối chứng, (1): Puromycin 0,05 mg/ml , (2): Ampicillin 0,05 mg/ml , (3): Ampicillin 0,1 mg/ml , (4): Puromycin 0,1 mg/ml 3.2 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA PEPTIDE CECROPIN B Để xác định đƣợc mức độ nhạy cảm chủng vi khuẩn thử nghiệm với peptide cecropin B, tiến hành thăm dò nồng độ tối thiểu (MIC) mà cecropin B có biểu hoạt tính kháng khuẩn Theo báo cáo Alison J Moore cs đƣợc công bố năm 1996 nồng độ ức chế tối thiểu cecropin B E coli từ 12,5 – 25 µM/ml, số chủng vi khuẩn khác nồng độ ức chế tối thiểu cecropin B cao nhiều, khoảng từ 50 µM/ml (đối với Pseudomonas aeruginosa NCTC10332) đến 100 µM/ml (đối với Staphylococcus epidermidis NCTC 11047) [39] Dựa công bố này, tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cecropin B nồng độ 20, 30 40 µM/ml với bảy chủng vi khuẩn thử nghiệm độ nhạy cảm với kháng sinh Mỗi lỗ đĩa thạnh đƣợc bơm vào 50µl dung dịch cecropin B nồng độ khác đệm phosphat lỗ đối chứng Kết thu đƣợc nồng độ cecropin B 20 µM/ml, chủng vi khuẩn có vòng kháng khuẩn đĩa thạch Ở nồng độ cecropin B 30 µM/ml, có chủng Escherichia coli có vòng kháng khuẩn (Hình 7) sáu chủng vi khuẩn lại không xuất vòng kháng khuẩn Ở nồng độ cecropin B 40 µM/ml, tất chủng vi khuẩn thử nghiệm cho vòng kháng khuẩn rõ ràng (Bảng 5) Nhƣ ta nói nồng độ kháng khuẩn tối thiểu cecropin B chủng Escherichia coli 30 µM/ml với sáu chủng vi khuẩn lại 40 µM/ml thử nghiệm đĩa thạch 52 (1) (3) (2) Hình Kết thăm dò hoạt tính kháng khuẩn peptitde cecropin B với vi khuẩn Escherichia coli (1): Đối chứng, (2): Cecropin 20 µM/ml, (3): Cecropin 30 µM/ml Vòng kháng khuẩn xuất lỗ có nồng độ cecropin 30 µM/ml (1) (2) (3) Hình Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn chất kháng sinh ampicillin peptitde cecropin B với vi khuẩn Vibrio cholerae 53 (1): Đối chứng, (2): Ampicillin 0,1 mg/ml, (3): Cecropin B 40 µM/ml Bảng Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn peptide cecropin B bảy chủng vi khuẩn thử nghiệm Nồng độ cecropin B 20 30 40 Escherichia coli - + ++ Shigella flexneri - - + Salmonella typhi - - + Klebsiella sp - - + Bacillus subtilis - - + Vibrio cholerae - - + Moraxella catarrhalis - - + (µM/ml) Vi khuẩn (+): Có vòng kháng khuẩn, (++): Vòng kháng khuẩn rộng, (-) : Không có vòng kháng khuẩn Ta thấy hai chủng vi khuẩn Vibrio cholerae Moraxella catarrhalis hai chủng kháng hai loại kháng sinh ampicillin puromycin, nhƣng hai chủng lại có vòng kháng khuẩn thử nghiệm với peptide kháng khuẩn cecropin B Nhƣ thấy khả tiêu diệt vi khuẩn cecropin B hiệu quả, đặc biệt chủng vi khuẩn kháng kháng sinh Điều có ý nghĩa to lớn, mà ngày xuất nhiều vi khuẩn kháng kháng sinh Với kết này, tiếp tục đánh giá tác dụng diệt khuẩn thử nghiệm phối hợp kháng sinh với peptide cecropin B nồng độ khác 54 3.3 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CECROPIN B KẾT HỢP VỚI KHÁNG SINH Những thăm dò khả tiêu diệt vi khuẩn chất kháng sinh peptide kháng khuẩn cecropin B thử nghiệm xác định đƣợc nồng độ ức chế tối thiểu với cecropin nồng độ kháng nhƣ nồng độ ức chế tối thiểu kháng sinh ampicilin puromycin chủng vi khuẩn thử nghiệm Trong điều trị bệnh thực tế, bác sĩ thƣờng sử dụng phối hợp thuốc kháng sinh nhằm tăng hiệu kháng khuẩn đồng thời giảm lƣợng kháng sinh sử dụng, giảm tác động bất lợi cho thể Trong nghiên cứu này, thử nghiệm phối hợp cecrpin kháng sinh số nồng độ khác nhằm tìm đƣợc ngƣỡng tối thiểu cecropin kháng sinh đủ đảm bảo khả tiêu diệt vi khuẩn Nếu có kết tốt khả ứng dụng không mặt tăng khả kháng khuẩn mà giảm thiểu tác dụng phụ không mong muốn mà chất kháng sinh gây nên thể vật chủ Kết thăm dò ban đầu cho thấy, hai chủng vi khuẩn có khả kháng kháng sinh Vibrio cholerae Moraxella catarrhalis Cả bảy chủng vi khuẩn thử nghiệm nhạy cảm với cecropin B nhiên nồng độ khác có Escherichia coli nồng độ thấp 30 µM/ml cecropin B lại mức cao 40 µM/ml cecropin B Từ kết trên, tiến hành thử nghiệm kết hợp cecropin kháng sinh với nồng độ thấp nồng độ tối thiểu sử dụng loại riêng rẽ 3.3.1 Cecropin B gây nhạy cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn kháng thuốc Đầu tiên tiến hành thử nghiệm phối hợp cecropin B với kháng sinh nồng độ mà hai chủng vi khuẩn kháng kháng sinh Vibrio 55 cholerae Moraxella catarrhalis bắt đầu có tính kháng Đó nồng độ cecropin 30 µM/ml kết hợp với ampicillin 0,1 mg/ml Kết thu đƣợc khả quan hai chủng vi khuẩn có biểu nhạy cảm với ampicillin 0,1 mg/ml phối hợp với cecropin nồng độ 30 µM/ml thể vòng kháng khuẩn rõ nét (Hình 9) Kết cho thấy hiệu rõ ràng việc sử dụng cecropin B kết hợp với chất kháng sinh sử dụng chất kháng sinh cecropin với nồng độ tƣơng ứng chƣa tạo vòng kháng khuẩn Vibrio cholerae Moraxella catarrhalis (2) (4) (1) (3) (1) (3) (4) (2) Hình Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn peptitde cecropin B kết hợp với chất kháng sinh ampicillin với hai chủng VSV Vibrio cholerae Moraxella catarrhalis (1): Đối chứng, (2): Ampicillin 0,1 mg/ml, (3): Cecropin B 30 µM/ml, (4): Cecropin B 30 µM/ml + Ampicillin 0,1 mg/ml Để thăm dò nồng độ diệt khuẩn tối thiểu kết hợp cecropin B với chất kháng sinh, thay đổi nồng độ chất kháng sinh thay đổi nồng độ cecropin B Kết giảm nồng độ chất kháng sinh, nhƣ giảm nồng độ cecropin B không tạo đƣợc vòng kháng khuẩn (Hình 10) 56 Nhƣ nồng độ diệt khuẩn tối thiểu sử dụng kết hợp cecropin B chất kháng sinh hai chủng kháng kháng sinh Vibrio cholerae Moraxella catarrhalis Cecropin B 30 µM/ml + Ampicillin 0,1 mg/ml (1) (2) (4) (3) Hình 10 Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn peptitde cecropin B kết hợp với chất kháng sinh ampicillin với chủng vi khuẩn Vibrio cholerae (1): Đối chứng, (2): Ampicillin 0,1 mg/ml, (3): Cecropin B 30 µM/ml, (4): Cecropin B 20 µM/ml + Ampicillin 0,1 mg/ml 3.3.2 Cecropin B làm tăng mức độ nhạy cảm kháng sinh chủng vi khuẩn không kháng thuốc Tiếp theo tiến hành thử nghiệm chủng vi khuẩn không kháng kháng sinh Với chủng thử nghiệm chất kháng sinh, cecropin B, kết hợp cecropin B với chất kháng sinh so sánh kích thƣớc vòng kháng khuẩn thu đƣợc Kích thƣớc vòng kháng khuẩn cho thấy 57 hiệu tiêu diệt vi khuẩn loại chất kháng sinh, cecropin B việc sử dụng kết hợp cecropin B với chất kháng sinh Bằng phƣơng pháp đục lỗ, kiểm tra tính kháng khuẩn chất kháng sinh ampicillin 0,1 mg/ml, puromycine 0,1 mg/ml, Cecropin B 40 µM/ml phối hợp cecropin B 40 µM/ml với hai chất kháng sinh ampicillin 0,1 mg/ml puromycine 0,1 mg/ml Mỗi dung dịch thử nghiệm đƣợc cho vào lỗ đĩa thạch đƣợc nuôi vi khuẩn, với 50 µl dịch thử nghiệm / lỗ Kết thu đƣợc đƣờng kính vòng kháng khuẩn chất kháng sinh cecropin B sử dụng riêng rẽ cho vòng kháng khuẩn với kích thƣớc bé Còn sử dụng kết hợp chất kháng sinh với cecropin B cho vòng kháng khuẩn với đƣờng kính lớn nhiều sử dụng chúng cách riêng rẽ (Hình 11) Ở chủng vi khuẩn Escherichia coli, lỗ đục thử nghiệm cecropin B cho đƣờng kính vòng kháng khuẩn 11 mm, lỗ đục thử nghiệm kháng sinh ampicillin puromycine có đƣờng kính lần lƣợt 14 15 mm, lỗ thử nghiệm kết hợp cecropin B với hai kháng sinh cho đƣờng kính vòng kháng khuẩn lên tới 18 mm (Bảng 6) Nhƣ lần ta lại thấy đƣợc hiệu việc sử dụng kết hợp cecropin B với chất kháng sinh 58 Escherichia coli Salmonella typhi (4) (3) (4) (5) (1) (5) (1) (2) (2) (3) Hình 11 Kết kiểm tra tính kháng khuẩn hỗn hợp peptitde cecropin B chất kháng sinh hai chủng vi khuẩn Salmonella typhi Escherichia coli (1): Đối chứng, (2): Cecropin B 40 µM/ml, (3): Ampicillin 0,1 mg/ml, (4): Puromycine 0,1 mg/ml, (5): Cecropin B 40 µM/ml + Ampicillin 0,1 mg/ml + Puromycine 0,1 mg/ml Bảng Đường kính vòng kháng khuẩn thí nghiệm (Đơn vị đo: mm; Đường kính lỗ đục: mm) Dịch thử nghiệm Đối CB 40 Ampi 0,1 Puro 0,1 CB 40 chứng µM/ml mg/ml mg/ml µM/ml + Ampi 0,1 mg/ml + Puro 0,1 Chủng vi khuẩn Escherichia coli mg/ml 11 14 59 15 18 Shigella flexneri 13 17 19 24 Salmonella typhi 11 14 16 19 Klebsiella sp 11 14 15 18 Bacillus subtilis 11 14 16 19 (CB: Cecropin B, Ampi: Ampicillin, Puro: Puromycine) 3.4 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY NGUYÊN BÀO SỢI CHUỘT NHẮT TRẮNG CHUYỂN GEN CECROPIN B Hiện nay, với tiềm peptide kháng khuẩn, nhiều nhà khoa học tìm cách tạo sinh vật có khả tạo peptide kháng khuẩn tái tổ hợp với mục đích đƣa vào ứng dụng thực tế đời sống Tuy nhiên, peptide tái tổ hợp cần phải kiểm tra hoạt tính Tại số phòng thí nghiệm khoa Sinh học, trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên thành công việc đƣa gen cecropin B vào vi khuẩn tế bào động vật Việc kiểm tra hoạt tính loại cecropin đƣợc thực Trong giới hạn đề tài này, thử nghiệm đánh giá khả kháng khuẩn tế bào chuột nuôi cấy đƣợc chuyển gen cecropin B có khả biểu xuất tiết môi trƣờng Quần thể tế bào sau chuyển gen đƣợc xác định có mang gen chuyển kỹ thuật PCR tạo đƣợc sản phẩm có hoạt động chức thông qua gen báo cáo GFP kiểm tra dƣới kính hiển vi huỳnh quang Những quẩn thể tế bào đƣợc nuôi cấy môi trƣờng kháng sinh môi trƣờng đƣợc thu ngày thứ 5, 13 21 sau chuyển gen đƣợc ký hiệu tƣơng ứng F1, F2 F3 Môi trƣờng đƣợc cô đặc 10 lần để tăng nồng độ cecropin 60 Chúng thử nghiệm với ba chủng vi khuẩn để thử nghiệm hoạt kháng khuẩn chủng Bacillus subtilis không kháng kháng sinh hai chủng Vibrio cholerae, Moraxella catarrhalis có kháng kháng sinh có độ nhạy cảm tốt với cecropin Với môi trƣờng ký hiệu F1, ba chủng vi khuẩn thử nghiệm cho vòng kháng khuẩn, với ba lần thí nghiệm lặp lại Tuy nhiên vòng kháng khuẩn ba chủng vi khuẩn có đƣờng kính tƣơng đối nhỏ (khoảng – 10 mm) Với môi trƣờng ký hiệu F2 F3, lần thử nghiệm không cho vòng kháng khuẩn ba chủng vi khuẩn (Hình 12) Bacillus subtilis Vibrio cholerae (4 ) (1) (3 ) (2) (4) (1 ) (2) (3) 61 Moraxella catarrhalis Hình 12 Kết kiểm tra khả kháng khuẩn môi trường nuôi cấy nguyên bào sợi thai chuột sau chuyển gen (1): Môi trường F1, (2): Môi trường F2, (3): Môi trường F3, (4): Đối chứng Kết chứng minh gen cecropin B hội nhập đƣợc vào hệ gen nguyên bào sợi chuột nuôi cấy mà đƣợc biểu thành peptide kháng khuẩn cecropin Qua trình thí nghiệm, số lƣợng mẫu cho biểu gen hạn chế Điều khả hoạt động vector việc chèn gen vào hệ gen chƣa cao hoạt động ảnh hƣởng đến phát triển phôi cá Ngoài ra, khả kháng khuẩn thấp lƣợng cecporin đƣợc tiết hạn chế, nồng độ peptide môi trƣờng mức thấp 62 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ trình nghiên cứu với kết rút số kết luận nhƣ sau: Trong bảy chủng vi khuẩn gây bệnh xác định đƣợc có chủng kháng với kháng sinh ampicillin puromycin Vibrio cholerae Moraxella catarrhalis Nồng độ kháng khuẩn tối thiểu (MIC) cecropin E.coli 30 µM/ml chủng lại 40 µM/ml Cecropin B làm tăng mức độ nhạy cảm vi khuẩn với kháng sinh ampicilin puromicin tạo nhạy cảm chủng kháng thuốc Đã phát khả kháng khuẩn mức thấp môi trƣờng nuôi cấy nguyên bào sợi chuột chuyển gen cecropin B 63 KIẾN NGHỊ Với kết thu đƣợc xin đƣa số hƣớng nghiên cứu nhƣ sau: Tiếp tục nghiên cứu để đánh giá khả kháng khuẩn cecropin B chủng vi khuẩn gây bệnh khác, đặc biệt chủng vi khuẩn kháng kháng sinh Tiếp tục nghiên cứu để đánh giá khả kháng khuẩn môi trƣờng nuôi cấy nguyên bào sợi chuột chuyển gen cecropin B Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn môi trƣờng với chủng vi khuẩn gây bệnh khác Đồng thời thử nghiệm nhiều môi trƣờng nuôi cấy nhiều hệ nguyên bào sợi chuyển gen để đánh giá biểu thành peptide kháng khuẩn gen cecropin B đƣợc chuyển vào tế bào 64 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình Vi sinh học công nghiệp, Nxb khoa học kỹ thuật Hà Nội Nguyễn Thị Bích Đào (2011), Thử nghiệm phương pháp chuyển gen qua tinh trùng để chuyển gen Cecropin vào cá ngựa vằn, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Lý Thị Thanh Hà (2008), Nghiên cứu đặc điểm sinh học, khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập Trùng Khánh – Cao Bằng, Luận văn Thạc sĩ Khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiến sỹ Sinh học Nguyễn Mộng Hùng, Quyền Đình Thi, Đỗ Lê Thăng, Nguyễn Huỳnh Minh Quyên, Nguyễn Chí Thành (2007), Công nghệ sinh học phân tử Nguyên lý ứng dụng DNA tái tổ hợp (Dịch từ nguyên tiếng Anh- Molecular Biotechnology Principles and applications of recombinant DNA), NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2007), Công nghệ sinh học người động vật, NXB Giáo dục, Tp Hồ Chí Minh Hoàng Thị Thanh Phƣơng (2011), Thử nghiệm phương pháp vi tiêm để chuyển gen Cecropin vào hợp tử cá ngựa vằn, Khóa luận tốt nghiệp, Trƣờng Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Vũ Văn Vụ, Nguyễn Mộng Hùng, Lê Hồng Điệp (2006), Công nghệ sinh học, Tập 2, NXB Giáo dục, Hà Nội 65 ... ƣu cecropin lên số chủng vi sinh vật gây b nh động vật để làm sở đánh giá cecropin tái tổ hợp đƣợc sản xuất tế b o nuôi cấy Vì tiến hành Đánh giá khả kháng khuẩn cecropin B số chủng vi khuẩn gây. .. 50 3.1 ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH CỦA MỘT SỐ CHỦNG VI KHUẨN GÂY B NH TRÊN NGƢỜI VÀ ĐỘNG VẬT 50 3.2 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA PEPTIDE CECROPIN B 52... TÍNH KHÁNG KHUẨN CỦA CECROPIN B KẾT HỢP VỚI KHÁNG SINH 55 3.3.1 Cecropin B gây nhạy cảm với kháng sinh chủng vi khuẩn kháng thuốc 55 3.3.2 Cecropin B làm tăng mức độ nhạy cảm kháng