giới thiệu về kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

ĐỊNH NGHĨA• Sự cố định tế bào vi sinh vật là quá trình gắn tế bào vi sinh vật vào phase riêng biệt tách khỏi phase tự do của dung dịch, nhưng vẫn có khả năng trao đổi chất với các phân t

KỸ THUẬT CỐ ĐỊNH TẾ

BÀO VI SINH VẬT

Ths Bùi Hồng Quân09.09.25.24.19/09.17.27.26.25Email: buihongquan@hui.edu.vn

Website: www.buihongquan.tk

GBD giữ gìn màu xanh cho quê hương, xây dựng tương lai từ chất lượng cuộc sống

ĐỊNH NGHĨA

• Sự cố định tế bào vi sinh vật là quá trình gắn tế bào vi sinh vật vào phase riêng biệt tách khỏi phase tự do của dung dịch, nhưng vẫn có khả năng trao đổi chất với các phân tử cơ chất có mặt trong phase tự do nói trên

• Cố định vi sinh vật là việc gắn tế bào vi sinh vật vào chất mang không hòa tan trong nước Tế bào sau khi

cố định có thể sử dụng nhiều lần, không lẫn vào sản phẩm và có thể chủ động ngừng phản ứng mong muốn

PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP

• Trên bề mặt chất mang

• Trong lòng chất mang

• Không mang chất mang

• Một số phương pháp khác: gel lạnh sâu, cố định liên hợp, nhờ photopolymer

CHẤT MANG CỐ ĐỊNH TẾ BÀO

• Vai trò:

– Đóng vai trò quyết định lựa chọn phương pháp– Quyết định tính hiệu quả của quá trình cố định

YÊU CẦU

• Điểm quan tâm đầu tiên khi lựa chọn chất mang làphải rẻ tiền Điều này liên quan đến hiệu quả kinh tếcủa quy trình công nghệ, đặc biệt là khi quy trình đóứng dụng vào quy mô công nghiệp

• Chất mang phải có tính chất cơ lý bền vững, ổn định Nhờ đó mà chất mang mới chịu được các điều kiện môi trường như khuấy trộn, áp lực trong quy trình sản xuất

• Về mặt hóa học chất mang phải bền vững, không tan trong môi trường phản ứng

• Chất mang không được làm mất hay ức chế hoạt tính enzyme của vi sinh vật

YÊU CẦU

• Chất mang phải có tính kháng khuẩn cao, bền vững với

sự tấn công của vi sinh vật

• Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học

• Chất mang phải được chọn lọc sao cho cố định vi sinh vật dễ dàng

• Chất mang có thể sử dụng nhiều lần

• Chất mang phải an toàn cho môi trường sống

• Chất ang phải có độ trương tốt, có diện tích bề mặt tiếp xúc lớn Tính chất này của chất mang vừa tăng khả năng cố định vi sinh vật vừa tăng khả năng tiếp xúc của

cơ chất với enzyme, nhờ đó làm tăng hoạt tính enzyme

và số lần tái sử dụng

• Chất mang có thể có cấu trúc siêu lỗ, lỗ xốp, dạng hạt, dạng màng, dạng phim mỏng

PHÂN LOẠI

• Polysaccharide: cellulose, alginate, carrageenan…

• Protein: collagen, keratin…

• Hữu cơ tổng hợp: polysaccharide, polyvinylacetate…

• Vô cơ tự nhiên: than hoạt tính, zeolit, silicate…

• Vô cơ tổnh hợp: silicagel, Al2O3…

ƯU ĐIỂM CỦA TẾ BÀO CỐ ĐỊNH

• Mật độ tế bào cao

• Sản phẩm sạch

• Có thể tái sử dụng nhiều lần

• Chịu được sự tác động bên ngoài

• Điều chỉnh được kích thước khối vi sinh vật cố định phù hợp với môi trường phản ứng, reactor

• Enzyme của tế bào vẫn xúc tác phản ứng hóa sinh, không tan trong nước

• Kích thước thiết bị nhỏ, gọn

• Quá trình sản xuất liên tục, tế bào vi sinh vật không bị rửa trôi

• Sử dụng được nhiều loại cơ chất, quy trình thiết kế đơn giản hơn

• Chất lượng sản phẩm đồng đều

• Tế bào cố định được bảo vệ ít bị ức chế bởi cơ chất và sản phẩm cuối

NHƯỢC ĐIỂM CỦA TẾ BÀO CỐ ĐỊNH

• Hoạt lực thấp hơn tế bào tự do

• Trong môi trường phản ứng sử dụng tế bào cố định, không thể không tránh khỏi hiện tượng rửa trôi tế bào

ra khỏi chất mang Các tế bào này sẽ lẫn vào sản phẩm, dẫn đến khó khăn trong việc chiết tách, tinh sạch sản phẩm, gây tốn kém chi phí

• pH hoạt động tối ưu bị chuyển dịch sang kiềm hay acid so với tế bào bình thường

• Tế bào cố định cũng đòi hỏi về dinh dưỡng đầy đủ để

có thể hoạt động bình thường, thực hiện trao đổi chất

• Cơ chất muốn vào trong tế bào để thực hiện trao đổi chất tạo ra sản phẩm phải qua chất mang, thành tếbào, màng tế bào…Các chất này ảnh hưởng đến sựthẩm thấu vào và ra của cơ chất và sản phẩm

CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN

TẾ BÀO CỐ ĐỊNH

• Bản thân chất mang polymer ngăn cản sự khuếch tán

tự do của các phân tử theo hướng tới enzyme cũng như đi khỏi enzyme từ đó ảnh hưởng tới hiệu quả xúc tác của enzyme

• Nếu cố định trên chất mang có phân tử lượng cao: giảm đáng kể hoạt tính của chúng trên bề mặt so với các chất mang có phân tử lượng thấp

• Các tính chất lý hoc của chất mang: tính kỵ nước, háo nước, hòa tan, bền cơ học…đều ảnh hưởng nhất định đến khả năng cố định

• Bản chất hóa học của chất mang cũng ảnh hưởng đáng kể tới khả năng hấp phụ lên cơ chất

Ảnh hưởng của sự khuếch tán cơ

chất, sản phẩm và các phân tử khác

• Tốc độ khuếch tán cơ chất, sản phẩm và các chất khác phụ thuộc vào các yếu tố:

– Kích thước lỗ gel của chất mang polymer

– Trọng lượng phân tử của cơ chất

– Sự chênh lệch nồng độ giữa vùng môi trường

vi mô xung quanh vi sinh vật và dung dịch tự do

– Những giới hạn khuếch tán có thể được thể hiện ở 2 dạng hàng rào khuếch tán bên ngoài và bên trong

Ảnh hưởng của sự khuếch tán cơ

chất, sản phẩm và các phân tử khác

• Rào khuếch tán bên ngoài xuất hiện là do có sự tồn tại của lớp mỏng dung môi bao xung quanh hạt polymer

• Các chất khuếch tán vào lớp này nhờ sự kết hợp của khuếch tán phân tử thụ động và sự đối lưu

• Độ dày của lớp phụ thuộc vào tốc độ khuấy trộn dung dịch xung quanh các hạt chứa tế bào cố định

• Việc gia tăng tốc độ pha trộn sẽ làm giảm rào khuếch tán bên ngoài

• Trong bất kỳ quy trình công nghệ nào, tốc độ khuấy đảo đóng vai trò hết sức quan trọng

Ảnh hưởng của vi sinh vật

• Thành phần hóa học, cấu tạo màng ế bào, kích thước, hình dạng…của những loài vi sinh vật khác nhau sẽảnh hưởng khác nhau đến việc lựa chọn kỹ thuật cố định tế bào đó vào chất mang

• Bản chất hay hình dạng loài vi sinh vật sẽ quyết định kiểu liên kết và độ bền kiểu liên kết hình thành giữa

tế bào vi sinh vật và chất mang

• Trạng thái sinh lý cũng như hoạt tính của loài vi sinh vật ảnh hưởng đến liên kết và độ bền của những liên kết đó

– Không gây biến tính

– Cho phép dễ dàng kiểm soát được số lượng tế bào

cố định

– Các tế bào không bị rửa trôi khỏi chất mang trong quá trình sử dụng hoặc bảo quản

PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI SINH VẬT TRÊN BỀ MẶT CHẤT MANG

• PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT CỘNG HÓA TRỊ

• PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ

PHƯƠNG PHÁP LIÊN KẾT CỘNG

HÓA TRỊ

• Định nghĩa: bản chất liên kết cộng hóa trị là nối tế bào với chất mang thông qua “cầu nối” Cầu nối này phải có kích thước không lớn lắm và có hai đầu, một đầu nối polymer, đầu kia nối tế bào

• Chất mang: cellulose, dẫn xuất của cellulose, agarose, silicagel, bentonit…

• Cách tiến hành:

– Theo một giai đoạn: chất mang có khả năng liên kết trực tiếp tế bào Việc gắn sẽ hiệu quả hơn nếu diện tích của tế bào và chất mang có dấu ngược nhau

– Theo hai giai đoạn: hoạt hóa chất mang Thường được ứng dụng để cố định enzyme

PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ

• Định nghĩa: ??? Trong quá trình cố định vi sinh vật bằng cách hấp phụ có các liên kết sau được hình thành:

– Liên kết tĩnh điện Van der walls: giữa tế bào và bềmặt chất mang tạo nên một sự chênh lệch điện thếgiữa bề mặt chất mang và bề mặt tế bào giúp tếbào và chất mang gắn liền nhau

– Liên kết mao quản: chất mang có các mao quản, khi được ngâm trong các huyền phù vi sinh vật sẽhình thành các lực mao quản kéo huyền phù vi sinh vật vào trong long chất mang

– Liên kết ion: bề mặt chất mang và vi sinh vật cómang các ion trái dấu, nhờ vậy tế bào vi sinh vật liên kết chất mang

PHƯƠNG PHÁP HẤP PHỤ

• Chất mang:

– Chất mang không có cấu trúc xốp: thủy tinh – Chất mang không có cấu trúc lỗ xốp: than hoạt tính

– Chất mang có điện tích: nhựa trao đổi ion

• Cách tiến hành:

– Phương pháp cổ điển

– Phương pháp cổ điển có cải tiến

– Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứa chất mang

PHƯƠNG PHÁP CỐ ĐỊNH TẾ BÀO VI

SINH VẬT TRONG CẤU TRÚC GEL

• Định nghĩa:

– Polymer tạo màng lưới bao xung quanh tế bào

– Mạng lưới này có lỗ nhỏ tới mức không cho tế bào chui ra khỏi mạng, nhưng đồng thời đủ lớn cho cơ chất

và sản phẩm tạo ra có thể ra vào dễ dàng

• Các phương pháp:

– Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong ion gel

– Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong covalent gel

– Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cryogel

– Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong covalent gel

non-CỐ ĐỊNH TẾ BÀO KHÔNG CHẤT MANG

• Cố định tế bào vi sinh vật bằng liên kết chéo giữa các tế bào vi sinh vật

• Vai trò của các tác nhân:

– Tính thẩm thấu nhanh vào tế bào vi sinh vật – Phản ứng được với thành tế bào vi sinh vật

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO KHÔNG CHẤT MANG

• Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật bằng màng chắn membrane:

• Ví dụ tế bào vi khuẩn A.xylinum trong mạng

lưới cellulose, tế bào nấm men cố định trong mạng lưới cellulose

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT

MANG ALGINATE

• Tính chất tạo gel của dung dịch alginate:

– Một trong những tính chất quan trọng của alginate là khả năng tạo gel ở những điều kiện nhất định

– Khi cho kết hợp cation hóa trị II và III, thường dung nhất là Ca2+ sẽ xuất hiện vùng nối giữa các mạch phân tử alginate và tạo gel theo mô hình “hộp trứng”

CỐ ĐỊNH TẾ BÀO TRÊN CHẤT

MANG ALGINATE

• Phương pháp cố định sử dụng chất mang alginate:

– Alginate được ứng dụng làm chất cố định tế bào do

có những đặc điểm: alginic acid là polyanion nên dễ dàn khâu mạch tạo gel trong dung dịch CaCl2 và KCl, alginic acid có khả năng bao xung quanh tế bào – Phương pháp cố định tế bào dung chất mang alginate phổ biến là phương pháp bẫy tế bào trong lòng chất mang

– Hỗn hợp huyền phù của tế bào vi sinh vật và chất mang alginate được nhỏ vào dung dịch đa diện để thực hiện phản ứng tạo mạng lưới gel

– Qua đó, tế bào vi sinh vật sẽ được cố định trong hệ thống mạng lưới vừa được hình thành

– Tính chất tạo gel của carrageenan:

– Một trong những tính chất quan trọng nhất

là khả năng tạo gel

– Carrageenan hình thành gel trong điều kiện làm lạnh dung dịch nóng chứa một số loại cation, đặc biệt là K+ và Ca2+

để thực hiện phản ứng tạo mạng lưới gel

• Tế bào vi sinh vật sẽ được cố định trong hệ thống mạng lưới vừa đựơc hình thành