Quá trình thủy phân trùn quế thu enzyme protease

Quá trình thủy phân trùn quế thu enzyme protease

MỤC LỤC TỔNG QUAN 1.1 Trùn quế 1.2 Protease VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.2 Hóa chất – dụng cụ - thiết bị : 2.3 Phương pháp phân tích sử dụng 2.3.1 Xác định hàm lượng Protein phương pháp Biure 2.3.2 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp Anson cải tiến 2.3.3 Tinh sắc kí lọc gel 2.3.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE 11 2.4 2.4.1 Sơ đồ thí nghiệm 12 2.4.2 Tiến trình thí nghiệm 14 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 15 Quy trình thí nghiệm 12 3.1 Đo độ ẩm mẫu ban đầu 15 3.2 Xác định hàm lượng protein mẫu sau tự phân mẫu ban đầu 15 3.3 Xác định hoạt tính protease mẫu sau tự phân mẫu ban đầu 16 3.4 Lọc gel 18 3.5 Điện di 20 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………… 19 TÀI LIỆU THAM KHẢO 20 Danh mục hình Hình 1: Trùn quế………………………………………………………………………….4 Hình 2: Phản ứng tạo phức Cu2+ - protein……………………………………………… Hình3 Sắc ký lọc gel…………………………………………………………………… Hình4 Đồ thị miêu tả mối liên hệ hoạt tính hoạt tính riêng…………………….17 Hình6 Kết điện di………………………………………………………………… 18 Danh mục bảng Bảng 1: Một số serine protease thông dụng nay…………………………………….5 Bảng Thành phần đổ gel……………………………………………………………….12 Bảng Hàm lượng protein dịch trùn tự phân mẫu ban đầu……………………15 Bảng4 Kết phân tích hoạt tính enzyme…………………………………………… 16 TỔNG QUAN 1.1 Trùn quế Trùn Quế có tên khoa học Perionyx excavatus, chi Pheretima, họ Megascocidae Chúng thuộc nhóm trùn ăn phân, thường sống môi trường có nhiều chất hữu phân hủy, tự nhiên tồn với phần thể lớn khả cải tạo đất trực tiếp số loài trùn địa phương sống đất Phân loại khoa học: Giới (regnum) Animalia Ngành (phylum) Annelida Lớp (class) Clitellata Phân lớp (subclass) Oligochaeta Bộ (ordo) Haplotaxida Họ (familia) Megascolecidae Chi (genus) Perionyx Loài (species) P excavatus Trùn Quế giống trùn hoá, nhập nội đưa vào nuôi công nghiệp với quy mô vừa nhỏ Đây loài trùn mắn đẻ, xuất rải rác vùng nhiệt đới, dễ bắt tay, dễ thu hoạch Chúng sử dụng rộng rãi việc chuyển hóa chất thảm Philippines, Australia số nước khác Trùn quế thích sống nơi ẩm thấp, ấm áp, yên tĩnh Chúng sợ ánh sáng, nhiệt độ cao, tiếng động, hóa chất bảo vệ thực vật, muối, vôi Nhiệt độ thích hợp 20 - 30°C, ẩm độ 75-80%, pH 7,0 - 7,5 Ở nhiệt độ khoảng 30°C ẩm độ thích hợp trùn Quế sinh trưởng sinh sản nhanh Kích thước Trùn Quế trưởng thành từ 10 – 15 cm, nước chiếm khoảng 80 – 85%, chất khô khoảng 15 – 20% Hàm lượng chất (tính trọng lượng chất khô) sau: Protein: 68 –70% Lipid: – 8%, Chất đường: 12 –14 % Tro 11 – 12% Do có hàm lượng Protein cao nên Trùn Quế xem nguồn dinh dưỡng bổ sung quý giá cho loại thức ăn gia súc, gia cầm, thủy hải sản… Ngoài ra, Trùn Quế dùng y học… Phân trùn loại phân hữu sinh học có hàm lượng dinh dưỡng cao, thích hợp cho nhiều loại trồng, không gây tình trạng "sốc" phân, yêu cầu trữ dễ dàng, đặc biệt thích hợp cho loại hoa kiểng, làm giá thể vườn ươm nguồn phân thích hợp cho việc sản xuất rau Hình 1: Trùn quế 1.2 Protease Protease nhóm enzyme ứng dụng rỗng rãi nhiều lĩnh vực khác công nghiệp chế biến thực phẩm, y học, nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng Người ta thu nhận protease từ nhiều nguồn khác thực vât, động vât vi sinh vật Phân loại protease Protease nhóm xúc tác phản ứng thủy phân liên kết peptide protein Năm 1960, Hartley phân loại enzyme thủy phân protein theo nhóm dựa theo tên hóa học amino acid tham gia vào tâm vị trí xúc tác Aspartic peptidase protease chứa nhóm carboxyl (-COOH) trung tâm hoạt động, tác động lên liên kết peptide tạo phức hợp trung gian liên kết không cộng hóa trị enzyme chất Các nhóm carboxyl thuộc mạch bên R aspartic, glutamic nhóm carboxyl đầu C chuỗi polypeptide Aspartic peptidase thường hoạt động vùng pH acid bị ức chế đặc hiệu pepstatin Cysteine peptidase: enzyme thuộc nhóm có nhóm thiol (-SH) cysteine trung tâm hoạt động, tác động lên nhóm –CO liên kết peptide tạo phức hợp trung gian thiolacyl-enzyme Các cysteine peptidase thường hoạt động mạnh vùng pH trung tính, chúng hoạt động nhóm thiol trạng thái không bị bao vây Do chất cysteine, acid ascorbic thường có tác dụng làm bền hoạt hóa enzyme Cystatin, leupeptin chất ức chế thuận nghịch E64 chất ức chế không thuận nghịch cho nhóm cysteine peptidase thông dụng Kim loại peptidase protease trung tâm hoạt động có chứa ion kim loại trực tiếp tham gia phản ứng, chúng tác động lên liên kết peptide tạo phức hợp trung gian liên kết không cộng hóa trị giống nhóm aspartic peptidase Nhóm kim loại peptidase hoạt động mạnh vùng pH trung tính bị giảm hoạt tính tác dụng EDTA Serine peptidase: protease có nhóm hydroxyl (–OH) serin trung tâm hoạt động Các peptidase serine thường hoạt động vùng pH rộng từ trung tính đến kiềm, nhóm -OH serine tác động lên nhóm –CO liên kết peptide tạo phức hợp trung gian acyl-enzyme Các enzyme thuộc nhóm thông dụng trypsin chymotrypsin Bảng 1: Một số serine protease thông dụng Enzyme Vị trí cắt Nguồn thu Trypsin Chymotrypsin Elastase Plasmin Thrombin V8-protease (Glu-C) Lys-C Subtilisin Arg, Lys Tyr,Trp,Phe Gly, Ala, Val Arg, Lys Arg Aps, Glu Lys Tyr, Phe, Leu Đầu C amin Hệ thống tiêu hóa động vật số loại khác Hệ thống tiêu hóa động vật số loại khác Hệ thống tiêu hóa động vật số loại khác Máu Máu Staphylococcus aureus V8 Lysobacter enzymogenes Các chủng bacillus khác Hệ thống tiêu hóa động vật Carboxypeptidase A VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu Trùn quế dùng thí nghiệm dạng trùn đông lạnh, mua địa 139/39/2c Trịnh Đình Trọng, phường Phú Trung, quận Tân Phú, Tp.Hồ Chí Minh 2.2 Hóa chất – dụng cụ - thiết bị :                       Hóa chất : Acetone : 50ml Dệm phosphate pH Thuốc thử biure Dd casein 1% Dd TCA 5% Dd NaOH 0.5 N Thuốc thử Folin Dụng cụ : Ống nghiệm : 20 ống Becher 100ml : Erlen 250ml : Erlen 100 : Pipet 1ml, 5ml, 10ml Bình nước cất, phễu, bóp caosu, đũa khuấy Ống ly tâm : Thiết bị : Máy xay sinh tố Máy đo độ ẩm Máy đo quang Máy ly tâm Tủ ủ Tủ sấy Thiết bị lọc gel Thiết bị chạy điện di 2.3 Phương pháp phân tích sử dụng 2.3.1 Xác định hàm lượng Protein phương pháp Biure 2.3.1.1 Nguyên tắc Các chất chứa từ hai lien kết peptide ( -CO-NH-) trở lên cho phản ứng Biure: môi trường kiềm mạnh, liên kết peptide phản ứng với CuSO4 tạo thành phức chất có màu từ tím đỏ tới xanh Vì cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ protein ( nồng độ protein cao màu sắc đậm) đo cường độ màu máy quang phổ suy nồng độ protein dung dịch 2.3.1.2 Hình 2: Phản ứng tạo phức Cu2+ - protein Cách tiến hành Albumin 1% ống nghiệm tỉ lệ albumin (ml)/nước cất (ml) Pha dung Nước cất dịch protein chuẩn Albumin 0 10 Nước cất 10 10 Lấy 1ml Thời gian: 20 phút Phản ứngBiure nhiệt độ phòng 4ml thuốc thử biure Đo độ hấp thụ Bước sóng 540nm OD 2.3.2 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp Anson cải tiến 2.3.2.1 Nguyên tắc Dùng enzyme protease để thủy phân chất protein, cụ thể dung dịch Casein, sản phẩm tạo thành peptide mạch ngắn hay acid amine Trong loại acid amine, tyrosin chiếm đa số Định lượng mẫu, cụ thể tyrosin tryptophan hòa tan phản ứng màu với thuốc thử Folin Dựa vào đồ thị chuẩn Tyrosin để định lượng sản phẩm enzyme xúc tác tạo nên Hoạt tính protease theo định nghĩa số µmol tyrosin sinh thủy phân casein 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease phút điều kiện chuẩn ( 35.50C, pH 7.6) 2.3.2.2 Cách tiến hành Chuẩn bị 12 ống nghiệm sạch, khô để làm ống thử thật, ống thử không,có dán nhãn Ống nghiệm Dung dịch hóa chất Thử thật Thử không Dung dịch casein 1% (ml) 5 Dung dịch TCA 5% (ml) 10 Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 10 Lắc giữ 35,5oC 20 phút Dung dịch TCA 5% (ml) Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên Chuẩn bị ống nghiệm khác, cho vào ống thứ 5ml dịch lọc ống thử thật cho vào ống thứ 5ml dịch lọc ống thử không Cho thêm vào ống 10ml NaOH 0.5N 3ml thuốc thử Folin, lắc 10 phút Đo độ hấp thu bước sóng 660nm Tính ΔOD = ODTT – ODTK 2.3.2.3 Tính kết Định nghĩa đơn vị Anson: đơn vị Anson lượng enzyme tối thiểu điều kiện thí nghiệm ( 35,5oC: pH 7,6 … ) thủy phân casein phút tạo thành sản phẩm hòa tan TCA, phản ứng với thuốc thử Folin cho ta độ hấp thu OD bước sóng 660nm tương ứng với µM tyrosine đường chuẩn Hđ Protease = 𝜇𝑀 𝑇𝑦𝑟𝑜𝑠𝑖𝑛∗𝑉∗𝐿∗𝑉1 𝑡∗𝑚∗𝑣 Với: Hđ Protease : hoạt độ enzyme protease ( UI/g) V1: thể tích pha loãng ban đầu : 100 ml V : tổng thể tích hỗn hợp ống thử thật ống thử không (ml) v : thể tích dịch lọc đem phân tích (ml) t : thời gian thủy phân (phút) m : khối lượng mẫu enzyme đem xác định hoạt tính (g) L: độ pha loãng enzyme µM tyrosine: lượng µM tyrosine v (ml) suy từ đường chuẩn 2.3.3 Tinh sắc kí lọc gel 2.3.3.1 Nguyên tắc Phương pháp dựa vào kích thước phân tử Mẫu nạp vào đầu cột chứa nhiều hạt có lỗ làm từ polymer không tan có tính hydrat hóa cao dextran, agarose hay polyacrylamide Những phân tử có kích thước nhỏ lọt vào bên lỗ gel bị trì hoãn, di chuyển chậm qua cột, phân tử lớn di chuyển bên hạt gel nên di chuyển nhanh tách khỏi cột sớm phân tử nhỏ Hình3 Sắc ký lọc gel Tiến hành Xác định loại gel Xác định hoạt tính- hoạt tính riêng peak bước sóng 660 nm lọc gel Tính toán loại gel cần ngâm Xác định peak 2.3.3.2 Ngâm gel Các phân đoạn sau lọc so màu bước sóng 540 nm Nhồi cột Đưa mẫu vào cột Thu mẫu qua cột 10 2.3.4 Phương pháp điện di SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide) 2.3.4.1 Nguyên tắc Dựa vào di chuyển phân tử có mang điện tích điện trường Điện di protein gel tiến hành xử lý gel SDS Phân tử protein có điện tích tự chứa nhóm acide base Nếu phân tử protein có điện tự chứa nhóm acid base Nếu phân tử protein không đạt điểm đẳng điện ảnh hưởng điện trường ngoài, chúng di chuyển sang cực Các protein khác có trị số điện tích tự khác Vì thế, tốc độ di chuyển chúng điện trường điều kiện định pH, lực ion nhiệt độ khác Do đó, hỗn hợp loại protein tách thành vùng riêng biệt phân đoạn riêng biệt 2.3.4.2 Chuẩn bị gel điện di Gel polyarcylamine thường đặt đứng, để chế gel cần sử dụng thủy tinh có kết cấu chuyên dụng để tạo khuôn Rửa thủy tinh nước, để khô lau lại ethanol Ráp thủy tinh theo hướng dẫn hang sản xuất kẹp khuôn giá đỡ Pha gel điện di với thành phần (cho mmieengs gel) bảng TEMED có tác dụng làm đông gel, thành phần pha vào sau Sau nhẹ nhàng trộn hỗn hợp gel vừa pha đổ vào khôn kính lắp sẵn Đổ gel chạy (running gel) trước tới vạch khuôn kính Thêm isopropanol lên lớp gel chạy vừa đổ, isopropanol có tác dụng làm phẳng hút bọt khí lớp gel chạy Đợi khoảng 30 phút cho gel đông Rửa lớp isopropanol đổ vào gel nước cất nhiều lần Để khô Đổ gel gom (stacking gel) tới mép đông Tháo kính khỏi khuôn kính Lắp kính có gel vào khung điện cực, đổ đệm điện di đầy khung điện cực 11 Bảng Thành phần đổ gel Mono solution 4X Running gel buffer (pH8.8) H2O APS 10% TEMED 2.3.4.3 Running gel 2,5 ml Stacking gel 0,325 ml 4X Stacking gel buffer (pH 6.8) 1,875 ml 3,125 ml 25 l l 0,625 ml 1,525 ml 12,5 l l Chuẩn bị mẫu Hút mẫu cần điện di 100 l vào tube 1,5 ml có bổ sung 20 l Load buffer 6X Đun sôi cách thủy phút, để nguội 2.3.4.4 Tiến hành điện di Nhẹ nhàng lấy lượt khỏi điện di Bơm mẫu vào giếng với lượng 20 l Thang chuẩn Protein Ladder với lượng 13-15 l Đóng nắp hộp điện di, tiến hành chạy điện di với dòng điện ổn định, thường 100V – 200V, 30 – 90 phút Sau lấy gel ra, cho gel vào hộp có chứa dung dịch nhuộm protein (Staining solution) Lắc nhẹ 10 – 30 phút cho Staining solution thấm vào gel Chuyển gel sang dung dịch rửa màu (Destaining solution) Thay dung dịch rửa vài lần với thời gian khoảng 15 phút/lần miếng gel có màu suốt xuất nhiều vạch xanh lơ gel 2.4 Quy trình thí nghiệm 2.4.1 Sơ đồ thí nghiệm 12 Trùn quế (đông lạnh) Rã đông, xay nhuyễn Xác định độ ẩm, hàm lượng chất khô Xác định hàm lượng protein, họa tính enzyme Pha thành dung dịch trùn 13% Tự phân với nước -60oC - t= 18;24;30;36h Ly tâm (4000 vòng/phut/), 10 phút Dịch enzyme thô Xác định hàm lượng protein, họa tính enzyme Tủa acetone - Tỷ lệ 1:2 Xác định hàm lượng protein, họa tính enzyme Ly tâm thu tủa enzyme - 4000 vòng/phút - t=10 phút Hòa tan tủa với đệm - đệm pH phosphate Lọc gel Xác định hàm lượng protein, họa tính enzyme Enzyme sau 13 tinh Điện di kiểm tra mẫu enzyme sau tinh 2.4.2 Tiến trình thí nghiệm 2.4.2.1 Tuần Nộp đề cương thí nghiệm Nhận dụng cụ thí nghiệm Chuẩn bị nguyên vật liệu : trùn mua hôm thứ ngày 26/02/2016 sau bảo quản tronng tủ đông để chuần bị tiến hành thí nghiệm 2.4.2.2 Tuần - Tiến hành rã đông trùn sau cho vào máy xay sinh tố, xay thời gian 10 phút - Xác định độ ẩm trùn quế để pha thành dung dịch trùn có nống độ 13 % - Xác định hàm lượng protein hoạt tính enzyme mẫu ban đầu - Sau có dịch trùn 13 %, tiến hành khảo sát thời gian thủy phân dịch trùn khoảng thời gian 18, 24, 30, 36 giờ, lần khảo sát thực mẫu Tuần tiến hành thủy phân trùn khoảng thời gian 18 24 cách cân g dịch trùn 13% cho vào erlen, bịt lại bao ni lông, cho vaò tủ ủ 600C khoảng thời gian khảo sát - Sau đủ thời gian thủy phân, tiến hành lấy mẫu tiến hành ly tâm 4000 vòng/phút 10 phút, thu dịch sau lấy dịch đem xác định hàm lượng protein phương pháp Biure hoạt tính enzyme phương pháp Anson cải tiến - Trong thời gian chờ thủy phân, dựng đường chuẩn Biure đường chuẩn Tyrosin 2.4.2.3 Tuần 3+4 : - Tiếp tục khảo sát thời gian thủy phân trùn khoảng thời gian lại 30 36 2.4.2.4 Tuần : Sau khảo sát khoảng thời gian thủy phân, tìm thời gian thủy phân trùn tối ưu, chọn mẫu trùn có hàm lượng protein hoạt tính enzyme tốt đem tủa với acetone hòa với đệm phostphate đem tinh sắc kí lọc gel Xác định hoạt tính hoạt tính riêng mẫu có peak 2.4.2.5 Tuần Diện di kiểm tra kết thu sau lọc gel Chọn mẫu điện di gồm : mẫu có peak lọc gel, mẫu trước lọc gel enzyme thô 14 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Đo độ ẩm mẫu ban đầu - Khối lượng trùn đem đo : 4.024g - Sấy 1050C - Độ ẩm mẫu dịch trùn nguyên liệu ban đầu máy đo 87% 3.2 Xác định hàm lượng protein mẫu sau tự phân mẫu ban đầu  Phưng trình đườn chuẩn: Giá trị OD Đường chuẩn Biure - 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -0.1 y = 0.0582x - 0.0007 R² = 0.9998 10 12 Hàm lượng protein (mg/ml) Phương trình đường chuẩn Albumin: y = 0.0582x – 0.007, R2 = 0.9998 Bảng Hàm lượng protein dịch trùn tự phân mẫu ban đầu STT mẫu Thời gian (h) 18 18 18 24 24 24 30 30 30 Độ pha Nhiệt loãng độ (0C) (%) 10 60 10 60 10 60 10 60 10 60 10 60 10 60 10 60 10 60 15 OD 0.18 0.228 0.193 0.398 0.558 0.222 0.258 0.28 0.304 Hàm lượng protein (mg/ml) 3.1048 3.9296 3.3282 6.8505 9.5997 3.8265 4.4450 4.8230 5.2354 10 11 12 Mẫu ban đầu 36 36 36 10 10 10 60 60 60 0.333 0.195 0.505 0.315 5.7337 3.3625 8.6890 5.4244 Mẫu số có hàm lượng protein cao (9,5997 mg/ml) ứng với thời gian thủy phân 24h Số liệu có chênh lệch thay đổi tương đối nhiều, nguyên nhân chủ yếu dẫn đến kết máy đo mật độ quang không ổn định, giá trị thay đổi nhiều, phần khác lúc thao tác thí nghiệm, vortex không Một nguyên nhân khác tủ ủ 600C, thời gian thực thí nghiệm phải để mẫu qua đêm nên nhiệt độ tủ ủ bị điều chỉnh mở mở vào nhiều lần khiến nhiệt độ không ổn định 3.3 Xác định hoạt tính protease mẫu sau tự phân mẫu ban đầu  Phưng trình đườn chuẩn: OD 0.6 y = 0.503x + 0.006 R² = 0.998 0.5 0.4 OD 0.3 Linear (OD) 0.2 0.1 M Tyrosin 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.2 Đường chuẩn y=0.503x+0.006 ; R2 =0.998 với y ΔOD,x µM tyrosin 16 Bảng4 Kết phân tích hoạt tính enzyme ST T thời gian (h) 18 18 18 24 24 24 30 30 30 10 36 11 36 12 36 Mẫu ban đầu - pha loãng (%) nhiệt độ ΔOD (ºC) µM tyrosin HT (UI/ml) HTR (UI/mg) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 0.0213 -0.0270 0.0125 0.0006 0.0087 -0.0157 -0.0038 -0.0032 -0.0107 -0.0543 -0.0038 -0.0050 0.0024 21.2724 -27.0378 12.5248 0.5964 8.7475 -15.7058 -3.7773 -3.1809 -10.7356 -54.2744 -3.7773 -4.9702 2.3857 3.4257 -0.2752 0.1505 0.0029 0.0325 -0.1579 -0.0327 -0.0244 -0.0820 -0.2958 -0.0374 -0.0185 0.0176 0.113 -0.13 0.069 0.009 0.05 -0.073 -0.013 -0.01 -0.048 -0.267 -0.013 -0.019 0.018 Số liệu có thay đổi chênh lệch điều kiện thủy phân, thời gian, địa điểm Vì sô liệu chênh lệch nên ta chọn số mẫu để đem làm kết sau Ta chọn mẫu số 3, 5, mẫu ban đầu để khảo sát mối liên hệ hoạt tính hoạt tính riêng, ta có đồ thị sau: 17 Hoạt tính- UI/ml) Hoạt tính- Hoạt tính riêng 14 0.16 12 0.14 0.12 10 0.1 0.08 Hoạt tính 0.06 Hoạt tính riêng 0.04 0.02 Hoạt tính riêng- UI/mg Hình4 Đồ thị miêu tả mối liên hệ hoạt tính hoạt tính riêng Từ biểu đồ ta thấy hoạt tính enzyme cao hoạt tính riêng enzyme tăng Cột 1,2 kết hoạt tính ứng với thời gian thủy phân 18h 24h, so với mẫu ban đầu (cột 3) Ta thấy sau thủy phân enzyme có hoạt tính hoạt tính riêng cao lúc chưa thủy phân 3.4 Lọc gel Bảng Kết lọc gel Ống số OD 0.013 0.048 0.062 0.076 0.049 0.071 0.045 0.037 0.012 0.000 18 10 OD Giá trị OD Biure ống lọc gel 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04 0.03 0.02 0.01 10 Ống số Hình5 Đồ thị biểu diễn giá trị OD Biure mẫu sau lọc gel Từ hình nhận thấy có điểm ghi nhận giá trị OD cao đột biến Điểm thứ ống số 4, OD tăng từ 0,062 lên 0,076; điểm ghi nhận phần tử có kích thước lớn mẫu khỏi cột gel Điểm lại xuất ống , OD từ 0,049 tăng đột biến lên 0,071; peak ghi nhận có mặt phân tử nhỏ mẫu lọc gel – amino acid, peptide Còn peak đo mẫu số Sau ta xác định hoạt tính enzyme phương pháp anson, giá trị OD anson mẫu số OD = ODTT – ODTK = 0,156 – 0,138 = 0,018 Vì thể tích dịch lọc thu mẫu số nên không đủ thể tích để xác định hoạt tính enzyme Hoạt tính hoạt tính riêng mẫu số : enzyme mẫu số có hoạt tính 2,3857UI/ml có hoạt tính riêng 0,9051 UI/mg 19 3.5 Điện di Hình6 Kết điện di Thang chuẩn rõ miếng gel lại không thấy xuất vệt màu xanh lơ Nguyên nhân thao tác lúc thí nghiệm giai đoạn đổ gel Dẫn đến việc phân tử protein không tách Vì thời gian từ lúc lọc gel xong đến điện di bảo quản điều kiện đông lạnh tuần Sau đem rã đông nên hàm lượng protein bị 20 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Thời gian tối ưu để thủy phân trùn quế thu enzyme protease 24 h nhiệt độ 60 0C 4.2 Kiến nghị Vì thời gian thí nghiệm không nhiều nên khảo sát yếu tố thời gian thủy phân, điều kiện khác nhiệt độ thủy phân, lượng dung môi… chưa khảo sát nên khảo sát yếu tố khác tốt Phòng thí nghiệm nên trang bị thêm máy đo quang để kết thí nghiệm xác 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Nguyễn Đức Lượng, “Công nghệ enzyme”, Nhà xuất Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh, 2012 22 [...]... hành rã đông trùn sau đó cho vào máy xay sinh tố, xay trong thời gian 10 phút - Xác định độ ẩm trùn quế để pha thành dung dịch trùn có nống độ 13 % - Xác định hàm lượng protein và hoạt tính enzyme trong mẫu ban đầu - Sau khi có dịch trùn 13 %, tiến hành khảo sát thời gian thủy phân dịch trùn ở các khoảng thời gian 18, 24, 30, 36 giờ, mỗi lần khảo sát thực hiện 3 mẫu Tuần 2 tiến hành thủy phân trùn ở khoảng... dựng đường chuẩn Biure và đường chuẩn Tyrosin 2.4.2.3 Tuần 3+4 : - Tiếp tục khảo sát thời gian thủy phân trùn ở 2 khoảng thời gian còn lại là 30 và 36 giờ 2.4.2.4 Tuần 5 : Sau khi khảo sát các khoảng thời gian thủy phân, tìm được thời gian thủy phân trùn tối ưu, chọn mẫu trùn có hàm lượng protein và hoạt tính enzyme tốt nhất đem đi tủa với acetone và hòa với đệm phostphate đem đi tinh sạch bằng sắc kí... 2.4 Quy trình thí nghiệm 2.4.1 Sơ đồ thí nghiệm 12 Trùn quế (đông lạnh) Rã đông, xay nhuyễn Xác định độ ẩm, hàm lượng chất khô Xác định hàm lượng protein, họa tính enzyme Pha thành dung dịch trùn 13% Tự phân với nước -60oC - t= 18;24;30;36h Ly tâm (4000 vòng/phut/), 10 phút Dịch enzyme thô Xác định hàm lượng protein, họa tính enzyme Tủa acetone - Tỷ lệ 1:2 Xác định hàm lượng protein, họa tính enzyme. .. mối liên hệ giữa hoạt tính và hoạt tính riêng Từ biểu đồ trên ta thấy hoạt tính enzyme càng cao thì hoạt tính riêng của enzyme cũng tăng Cột 1,2 là kết quả hoạt tính ứng với thời gian thủy phân 18h và 24h, so với mẫu ban đầu (cột 3) Ta thấy sau khi thủy phân thì enzyme có hoạt tính và hoạt tính riêng cao hơn lúc chưa thủy phân 3.4 Lọc gel Bảng 5 Kết quả lọc gel Ống số 1 OD 0.013 0.048 0.062 0.076 0.049... tác trong lúc thí nghiệm trong giai đoạn đổ gel Dẫn đến việc các phân tử protein không tách ra được Vì thời gian từ lúc lọc gel xong đến khi điện di bảo quản trong điều kiện đông lạnh trong 2 tuần Sau đó đem ra rã đông nên hàm lượng protein bị mất đi 20 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Thời gian tối ưu để thủy phân trùn quế thu enzyme protease là 24 h ở nhiệt độ 60 0C 4.2 Kiến nghị Vì thời gian thí... cách cân 5 g dịch trùn 13% cho vào erlen, bịt lại bằng bao ni lông, cho vaò tủ ủ 600C trong khoảng thời gian khảo sát - Sau khi đủ thời gian thủy phân, tiến hành lấy mẫu ra và tiến hành ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút, thu dịch sau đó lấy dịch đem đi xác định hàm lượng protein bằng phương pháp Biure và hoạt tính enzyme bằng phương pháp Anson cải tiến - Trong thời gian chờ thủy phân, dựng đường... hàm lượng protein, họa tính enzyme Ly tâm thu tủa enzyme - 4000 vòng/phút - t=10 phút Hòa tan tủa với đệm - đệm pH 7 phosphate Lọc gel Xác định hàm lượng protein, họa tính enzyme Enzyme sau 13 tinh sạch Điện di kiểm tra mẫu enzyme sau tinh sạch 2.4.2 Tiến trình thí nghiệm 2.4.2.1 Tuần 1 Nộp đề cương thí nghiệm Nhận dụng cụ thí nghiệm Chuẩn bị nguyên vật liệu : trùn được mua hôm thứ 6 ngày 26/02/2016... nhận sự có mặt của các phân tử nhỏ trong mẫu lọc gel – amino acid, peptide Còn 1 peak đo được ở mẫu số 3 Sau đó ta xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp anson, giá trị OD anson của mẫu số 6 là OD = ODTT – ODTK = 0,156 – 0,138 = 0,018 Vì thể tích dịch lọc thu được ở mẫu số 4 quá ít nên không đủ thể tích để xác định hoạt tính enzyme Hoạt tính và hoạt tính riêng của mẫu số 4 : enzyme trong mẫu số 4... Tuần 6 Diện di kiểm tra kết quả thu được sau khi lọc gel Chọn mẫu điện di gồm : mẫu có peak khi lọc gel, mẫu trước khi lọc gel và enzyme thô 14 3 KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Đo độ ẩm mẫu ban đầu - Khối lượng trùn đem đo : 4.024g - Sấy ở 1050C - Độ ẩm mẫu dịch trùn nguyên liệu ban đầu máy đo được là 87% 3.2 Xác định hàm lượng protein mẫu sau tự phân và mẫu ban đầu  Phưng trình đườn chuẩn: Giá trị OD Đường... nhiều lần khiến nhiệt độ không ổn định 3.3 Xác định hoạt tính protease mẫu sau tự phân và mẫu ban đầu  Phưng trình đườn chuẩn: OD 0.6 y = 0.503x + 0.006 R² = 0.998 0.5 0.4 OD 0.3 Linear (OD) 0.2 0.1 M Tyrosin 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Đường chuẩn y=0.503x+0.006 ; R2 =0.998 với y là ΔOD,x là µM tyrosin 16 Bảng4 Kết quả phân tích hoạt tính enzyme ST T thời gian (h) 1 18 2 18 3 18 4 24 5 24 6 24 7 30