TRỰC KHUẨN Bacillus cereus

Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bacillus cereus Giới tiệu Bacillus cereus: Bacillus cereus trực khuẩn Gram dương, theo phân loại quốc tế thuộc giới bacteria, ngành (phylum) firmicutes, lớp (Class) Bacilli, (Order) Bacillales, họ (Family) Bacillaceaem, chi (Genius) Bacillus, lồi (Species) Cereus Trong chi bacillus ngồi lồi cereus có số lồi như: • Bacillus subtilis • Bacillus coagulans • Bacillus thuringiensis • Bacillus natto • Paenibacillus larvae Bacillus cereus lồi vi khuẩn hiếu khí, bào tử dạng hình ovan, có khả sinh nha bào, phát ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955 từ năm 1972 đến 1986 có tới 52 trường hợp trúng độc thực phẩm Bacillus cereus phát báo cáo chiếm khoảng 2% số ca bệnh thực phẩm, thực tế số lớn nhiều 1.1 Đặc điểm Bacillus cereus: Trực khuẩn, gram dương, tạo nội bào tử Kích thước 0,5–1,5 x 2-4 µ Vi khuẩn khơng tạo giáp mơ, khơng có khả di động Hình 1: Bacillus cereus kính hiển vi Hình 2: khuẩn lạc Bacillus cereus mơi trường BA Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 1.2 Đặc điểm ni cấy: Là loại vi khuẩn dễ mộc • Hiếu khí kị khí tùy nghi • Nhiệt độ 5-50oC, tối ưu 35-40oC • ph 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2 • Trên mơi trường NA hay TSA sau 24 tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì • Trên mơi trường BA tạo dung huyết rộng • Trên mơi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh có vòng sáng • Trên mơi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng • Trên mơi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn 1.3 Tính chất sinh hóa: • Trên mơi trường đường: lên men glucose điều kiện hiếu khí kị khí, khơng lên men mannitol • Khử nitrat thành nitrit • Phản ứng VP (+) • Phân giải Tyroxin • Catalase (+), Citrate (+) • Mọc NB + 0,001% lyzozym 1.4 Tính chất gây bệnh- Độc tố-Triệu chứng: Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều tự nhiên, nhiễm vào loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm Độc tố: vi khuẩn sản sinh loại độc tố • Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin Vi khuẩn sản sinh độc tố thịt , rau quả, gia vị Bản chất loại protein gây hủy hoại biểu bì niêm mạc ruột gây tiêu chảy nguy hiểm đến tính mạng • Độc tố gây nơn mửa (Type 2): emetic toxin Vi khuẩn nhiễm gạo, cơm nguội, đậu loại Bản chất độc tố phospholipit có tính ổn định cao khơng bị phân hủy nhiệt độ cao dịch dày Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Ngồi vi khuẩn có enzyme hemolyzin protein gây độc mạnh gây chết người Độc tố trung hòa cholesterol huyết góp phần cho phát triển vi khuẩn Triệu chứng trúng độc: • Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc • Biểu đau bụng, buồn nơn nơn sau 1-5 ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn Bệnh kéo dài 24 Trường hợp nhiễm type có triệu chứng đau bụng tiêu chảy khơng sốt Bắt đầu sau 4-16 sau ăn thực phẩm nhiễm khuẩn kéo dài 12-24 Phòng: khơng ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn ln hâm nóng 80oC trước ăn So sánh độc tố type type 2: Đặc tính Bền với nhiệt pH 11 Tính nhạy Type 45oC/30 phút ổn định pH 4-11 12 Nhạy với enzyme protease trypsin Type 120oC/90 phút 10 ổn định pH 2-11 13 Kháng pepsin trypsin Ở nước ta theo báo cáo từ y tế, có khoảng 38 trung tâm y tế có khả kiểm nghiệm lồi vi khuẩn này, khoảng 60% tình thành có lực kiểm nghiệm Tuy nhiên phương pháp xét nghiệm dựa phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc mơi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với xét nghiệm hóa sinh khác Phương pháp có nhược điểm thời gian lâu, nhiều ngày vài tuần độ xác khơng cao Trong năm gần đây, phương pháp xét nghiệm vi sinh vật dựa ngun tắc di truyền phân tử miễn dịch học thiết lập như: lai phân tử, PCR (Polymerase Chain Reaction), Elisa cho kết khả quan với độ xác cao, thời gian rút ngắn xuồng vài giờ, khơng đòi hỏi nhiều máy móc thiết bị khả động cao Những phương pháp mở cho ngành vi hóa sinh học nói riêng ngành cơng nghệ thực phẩm đại Cơ chế sản sinh độc tố Bacillus cereus 2.1 Giới thiệu chung độc tố B cereus Vì ngộ độc thực phẩm B.cereus khơng phải loại bệnh nói đến nhiều, thật phạm vi ảnh hưởng loại bệnh biết đến, báo cáo ngun nhân gây ngộ độc thực phẩm chiếm khoảng 33% tổng số ngun nhân gây ngộ độc thực phẩm (đa số ngun nhân vi rút) Norway (1988-1993), 47% Iceland (1985-1992) Tỷ lệ thấp Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn nhiều báo cáo quốc gia khác bao gồm U.S (1.3%) Canada (2.2%) Ở Anh xứ Wales, có đến 468 trường hợp từ 1990 đến 1995 B cereus thực vật hoại sinh đất phổ biến Nó phân lập từ nhiều nguồn thực phẩm đa dạng, đặc biệt thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật, từ thịt, sản phẩm từ thịt cá Phát mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm từ năm 1949 Hauge phân lập mẫu từ xốt vani sau có ca ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy bệnh viện Oslo, Norway Xốt vani nấu trước tiêu thụ bảo quản nhiệt độ phòng sử dụng Để khẳng định B cerus ngun nhân gây ngộ độc, Hauge phát triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106ml-1 uống 200ml cocktail Sau 13h, ơng cảm thấy đau bụng tiêu nhiều nước, triệu chứng dai dẳng khoảng 8h Hơn 20 năm sau, triệu chứng gây ngộ độc thực phẩm khác chủng B cereus gây lại xuất cơng nhân người Anh Triệu chứng nặng triệu chứng nơn mửa kéo dài thời gian ngắn (chưa đến 5h), điều cho thấy nhiễm độc Ngày nay, bệnh liên quan đến triệu chứng gây nơn mửa B cereus Bacillus cereus gây nhiễm trùng nhiễm độc khác nhau, thêm vào đó, ngộ độc khác B.cereus gây nhiễm trùng máu, viêm màng não, nhiễm trùng mắt Hai loại ngộ độc thực phẩm ngun nhân nhiều nhấn tố gây độc hại khác Bệnh nơn mửa mơ tả với thời kỳ ủ bệnh ngắn (1-5h), ngun nhân gây ngộ độc chuỗi polypeptide nhỏ (cereulide) hình thành trước thực phẩm (ví dụ Gạo) Triệu chứng bao gồm buồn nơn, nơn mửa đau dày (bảng 1-1) Bệnh tiêu chảy mơ tả với thời kỳ ủ bệnh từ – 16h, triệu chứng bao gồm đau bụng, tiêu nhiều nước đau thắt trực tràng (bảng 1-2) Ngun nhân triệu chứng sản sinh độc tố đường ruột thời kỳ sinh trưởng B.cereus ruột non từ việc ăn vào bụng tế bào hay bào tử vi khuẩn Thơng thường hai triệu chứng tương đối nhẹ, kéo dài 24h khơng phải ln ln đòi hỏi phải dùng thuốc Tuy nhiên, nhiều trường hợp ngộ độc gây tiêu chảy xảy ra, ngun nhân có lẻ tế bào biểu mơ chiếm đa số ruột non bào tử B.cereus sinh sơi nảy nở sản sinh độc tố đường ruột Bảng 1-1 Đặc điểm bệnh nơn mửa tính chất triệu chứng gây nơn mửa B Cereus Tính chất/ Hoạt động Liều nhiễm độc Mơ tả Số lượng B.cereus: 105 - 108 tb/g thực phẩm Khối lượng độc tố: 12 - 32 μg/kg Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Độc tố sản sinh Trong thực phẩm (25 - 30oC) Thời kỳ ủ bệnh ½ đến 5h Khoảng thời gian mang bệnh - 24h Triệu chứng Buồn nơn, nơn mửa Loại thực phẩm thường gặp Cơm nấu chin / chiên, mì ống, phở Tên độc tố Cereulide Cấu trúc độc tố Chuỗi polypeptide [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val] Khối lượng phân tử 1.2 kDa Sinh kháng thể Khơng (none) Hoạt động sinh học người Gây nơn Cơ quan nhận cảm 5-HT3 Cytotoxic No Hoạt động tế bào HEp-2 Hoạt động khơng bào Khả chịu nhiệt 90 phút 121oC Ảnh hưởng phân giải protein Khơng Việc sản sinh độc tố Chưa biết, liên quan đến enzyme (not known, but probably enzymatically) 2.2 Cơ chế gây bệnh 2.2.1 Triệu chứng nơn mửa Đặc điểm bệnh nơn mửa tính chất độc tố gây nơn mửa thể bảng 1-1 Sự giải thích cấu trúc độc tố emetic đưa đến hiểu biết sâu sắc triệu chứng Độc tố emetic có tên cereulide chuỗi polypeptide ba lần lặp lại bốn amino và/hoặc oxy-acid (bảng 1-1) Cereulide (polypeptide) tên độc tố quan trọng gây triệu chứng nơn mửa Bacillus cereus sản sinh Bài báo giải nghiên cứu q trình sinh tổng hợp độc tố dựa bất thường độc tố depsipeptide từ Cacbon số 13 (13C) liệt kê loại tiền L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) mơi trường tổng hợp trung gian Sự phân tích thực dựa vào mức cấu tạo phân tử amino hay oxy acid qua NMR ESI – MS phương pháp kính quang phổ cereulide sản phẩm thủy phân dipeptide Sự hợp ngun tử cacbon số 13 (13C) chiếm đến 95% O-Val, O-Leu L-Val, có 40% 13C kết hợp D-Ala Cereulide Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bacillus cereus biết ngun nhân gây hai loại ngộ độc thực phẩm, triệu chứng nơn mửa triệu chứng tiêu chảy Phần lớn ngộ độc Bacillus cereus gây phát sau Cereulide biết đến với cấu trúc bậc 1, với dodecadepsipeptide tuần hồn, với 12 góc lập thể trung tâm Hóa học lập thể từ sản phẩm thủy phân dipeptide kiềm tính, D-O-Leu, D-Ala, L-O-Val L-Val Đó ion Kali mạnh, liên kết yếu với ion Li+, ion Na+, ion Cs+, với ion Rb+ lại liên kết mạnh nhất, ion kim loại kiềm Cereulide tạo cấu trúc bậc từ NMR tính tốn học phân tử biểu thị hình Độc tố ngun nhân dẫn đến hình thành ty lạp thể có chứa ATP enzyme lien quan đến hoạt động chuyển hóa tế bào mơ khác Chúng ta bắt đầu quan tâm đến đường sinh tổng hợp độc tố cho chương trình phòng chống ngộ độc thực phẩm tương lai Nghiên cứu q trình sinh tổng hợp tương tự dodecadepsipeptide, valinomycin Agata – nhiều tác giả nghiên cứu q trình phát triển sinh độc tố bacillus cereus q trình tổng hợp trung gian cách đầy đủ từ CADM (hỗn hợp amino acid) đường sucrose (đường mía) Người ta nhận thấy rằng, bacillus cereus cho phép (chấp nhận) việc sản sinh cereulide cấu trúc bậc amino acid Val, Leu Thr cần thiết Những nghiên cứu khác q trình sinh tổng hợp cereulide có lẻ cần thiết để thúc đẩy việc nghiên cứu tìm phương pháp ngăn chặn ngộ độc từ thực phẩm Xét đốn từ cấu trúc 1, tiền thân D-Ala, L-O-Val D-O-Leu lien quan đến amino acid L-Ala, L-Val, L-Leu Figure 2.ESI-mass spectrum of cereulide-K+complex upper trace Natural isotope abundance lower trace,13C enriched cereulide Trong thí nghiệm này, chúng tơi trọng đến sinh tổng hợp trung gian amino acid L-Val, L-Leu, L-Ala (0.1g/L có đến 99% ngun tử cacbon dạng 13C cacboxylic, tất 15 amino acid lại (0.1g/L), K2HPO4 (5g/L) MgSO4.7H2O (0.05g/L), tiến hành nhiệt độ 300C thời gian 24h, giữ tốc độ lắc 200 rpm, chúng tơi thu 2mg cereulide Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn có độc tính điều kiện đánh dấu để phục vụ cho phân tích nghiên cứu 1H NMR mẫu đồng với quang phổ đáng tin cậy ngoại trừ chất đồng vị cacbon 13C ESI mass (interpreting Electrospray Mass Spectra) xuất đỉnh trung tâm với m/z 1201.48 mức bình thường M + K với m/z 1191.55 (thể hình 2), trung bình 10 đơn vị mass cao kết hợp cao 13Cs Chính liên hợp cao 13Cs vào phân tử cereulide thúc đẩy việc đo lường mức quang phổ NMR 13C ion K+ phức hợp CDCl3 để đạt mức quang phổ hình 3, với số liệu đáng kể 171.4 (L-O-Val), 172.2 (D-O-Leu), 175.7 (L-Val) 176.2 (D-Ala) chuyển sang mối tương quan C-H Tương ứng với cường độ cacbon (C6, C9, C12) L-O-Val, D-O-Leu L-Val nhiều hai lần C6 D-Ala Figure 3.13C NMR spectrum of cereulide-K+complex enriched at the carboxyl or carboamide atoms (Ã) Brucker AMX-600, 150 MHz for13C at 300 K Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Figure 4.Decoupled NHs by irradiating a-protons Tương tự với việc làm riêng thí nghiệm đạt với xạ β proton hợp phần amino hay oxy – acid Loại bỏ kết đạt với α proton O-Val 4.61 ppm với xạ β-H 2.30 ppm để thay đổi từ ba sang kép (J=3.8 Hz cặp với 13C OVal) thể hình Bức xạ β-H L-Val 2.24 ppm làm thay đổi α proton Val 3.82 ppm từ năm thành ba (J=5 Hz) Cả hai kết kết hợp cao cacbonyl cacbon 13C tiền thân amino acid L-O-Val L-Val Chưa có kết xác kết hợp 13C, nhiên trường hợp lại Ala OLeu (hình 5) Sự chiếu xạ gốc metyl Ala 1.47 ppm gây α-H (4.27 ppm) giống pha trộn ba kép biểu kiến với J=4 Hz, theo thứ tự định sẵn (tách biệt ra) có nghĩa tỷ lệ sát nhập lại để tạo thành cacbonyl cacbon khơng q cao (khơng đạt đến 100%) Sự chiếu xạ β-Hs O-Leu khoảng 1.84 ppm khơng đạt kết dải sóng tự nhiên q rộng Tuy nhiên, quang phổ NMR 13 C (hình 3) thí nghiệm riêng lẻ (hình 4, 5) minh chứng gần 100% kết hợp 13C tiền amino acid với hợp phần (O-Leu, Val O-Val) cereulide Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Figure 5.Decoupling experiments of a protons of the four components by irradiating b protons Một phần trăm kết hợp 13C xác định phép đo phổ từ sản phẩm thủy phân cereulide, hai dipeptide thu từ thủy phân kiềm cereulide (1) với 0.1N KOH (hoặc 1N NH4OH) rt 30 phút Các sản phẩm thủy phân dipeptide D-O-Leu-DAla L-O-Val-L-Val, phân tích phương tiện ESI (electrospray ionization)- thước MS/MS Q-TOF phép đo phổ (Mcro Mass Co.,Ltd, Manchester, UK) Để làm điều chất đồng vị thừa 13C kết hợp lại với thành mẫu, pha lỗng mẫu đến độ hòa tan 10-100 pmol/μL 99,8% methanol: 0.2% acid formic trước bị electrospray 5μL/phút Ngày nay, L-Leu L-Ala chứng minh để xác định rõ có từ q trình sinh tổng hợp cereulide, hai acid amin cần thiêt cho B cereus Một khả nghiên cứu ba L-amino acid lần biến đổi thành αketo acid sau biến đổi thành D-O-Leu L-O-Val chuyển hóa amin để tạo thành D-Ala Trong trường hợp có acid pyruvic bị pha lỗng số gốc cao LAla khơng cần thiết cho B cereus Nghiên cứu giải thích đến 95% kết hợp để tạo thành D-O-Leu, L-O-Val, L-Val khoảng (40%) kết hợp để tạo thành D-Ala 2.1.1 Triệu chứng tiêu chảy Triệu chứng tiêu chảy hai loại độc tố đường ruột sản sinh suốt q trình sinh trưởng B.cereus ruột non Sự hình thành độc tố đường ruột đầy đủ thực Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn phẩm để dẫn đến ngộ độc thực phẩm lý thuyết mà nói có thể, thực phẩm phục vụ cho người điều khơng thể chấp nhận Điều xảy khi, số lượng B.cereus tồn thực phẩm thấp 106/g /ml lượng lớn độc tố đường ruột phải hình thành để chống chịu với pH dày enzyme proteolytic tá tràng Những nhân tố làm giảm cách nhanh chóng hoạt động độc tố đường ruột thấp ơn 1% sơ với mức độ ban đầu Thời gian tương đối dài việc ăn vào sinh vật với việc xuất triệu chứng bệnh Đặc điểm triệu chứng tiêu chảy thể bảng 1-3 Mức độ biến đổi liều lây nhiễm có lẽ khả sản sinh độc tố đường ruột khác tính nhạy cảm cá nhân khác Bảng 1-2 Đặc điểm bệnh tiêu chảy gây chủng vi khuẩn B cereus Đặc tính Liều gây nhiễm Thơng thường 105/g /ml Độc tố sản sinh Trong ruột non Loại độc tố Protein Thời kỳ ủ bệnh – 16h Khoảng thời gian mang bệnh 12 – 24h Triệu chứng Đau bụng dai dẳng, tiêu nhiều nước, buồn nơn Ở Na-Uy, hai lần bộc phát xảy với nhiều người bị ảnh hưởng sau ăn thịt hầm với khoai tây rau Liều lượng gây bệnh xấp xỉ 104 – 105 Lần bùng phát (1992), 17 – 24 người bị ngộ độc, số bệnh nhân phải nhập viện từ – tuần, triệu chứng bắt đầu nặng bệnh nhân muộn (>24h) Lần thứ hai, bệnh bùng phát vào tháng năm 1995 mà 152 số 252 người Na-uy bị ảnh hưởng suốt thời gian tham gia giải vơ địch trượt tuyết Các đối thủ trẻ tuổi (16 – 19 tuổi) bị nhiễm triệu chứng sau 24 ủ bệnh họ bị đau từ đến vài ngày Bào tử B cereus từ mơ tả (phần giới thiệu chung) phân biệt thấy chúng có khả bám vào tế bào Caco-2 (trên tế bào biểu mơ người) Sau bám vào, bào tử nảy mầm cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào B cereus sinh dưỡng đỉnh tế bào biểu mơ, tiếp sản sinh độc tố, độc tố xuất đường ruột, độc tố đường ruột tập trung khoanh vùng vùng ngoại biên ống ruột tăng cao lumen gây nên mối nguy lớn gây bệnh cách trầm trọng Một điều xảy chế thời gian ủ bệnh lâu quan sát Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 10 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn khuẩn Thermus aquaticus, E gọi Tag, Flu Nhiệt độ 110oC Tag Flu không bò biến tính Về bản, để thực kó thuật PCR cần số phần sau : • Đoạn DNA mẫu (Template) chứa đoạn DNA cần khuếch đại • Đoạn mồi (Primer) xác đònh điểm bắt đầu điểm kết thúc • Enzyme DNA Polymerase nhân đôi đoạn DNA • Nucleotide nguyên liệu cho phản ứng nhân đôi DNA • Dung dòch đệm Ngoài ra, PCR thực chu trình nhiệt (khoảng 20-30 lần) nên cần có máy đun nóng làm nguội môi trường phản ứng ống nghiệm Thiết bò điện di cần thiết để xác đònh kích thước DNA ( thực tế trọng lượng đoạn DNA khuếch đại) Hình 2.1 : Máy PCR Nguyên lý khuyếch đại PCR tóm tắt sau : Một chu trình phản ứng gồm bước, máy PCR tổng số chu trình lặp lại 30 lần với thời gian nhanh • Bước : Duỗi xoắn DNA nhiệt độ 94oC thời gian phút Chuỗi DNA kép tháo xoắn tạo sợi đơn • Bước : Gắn mồi 54oC khoảng 45 giây Primer bắt dính đoạn DNA đơn cần nhân đôi cách đặc hiệu Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 32 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn • Bước : Kéo dài 72oC phút Enzyme xúc tác phản ứng kéo dài mạch DNA bổ sung gặp điểm kết thúc Hình 2.2 : Sơ đồ chép DNA Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 33 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.3 : Các bước phản ứng PCR Hỗn hợp sau chạy PCR nhuộm màu phân tích điện di gel Agarose Lượng DNA sau khuyếch đại có lựơng phân tử tập trung vi trí gel Kết điện di đem so sánh với thang DNA chuẩn để biết lượng phân tử đoạn DNA khuếch đại, mảnh DNA lúcbanđầu Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 34 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.4 : Kết điện di sản phẩm chạy PCR Xác đònh B.cereus PCR Như trình bày phần mở đầu, Bacillus cereus loài vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm với hai triệu chứng : Nôn mửa (Emetic) tiêu chảy (Diarrheic) Trong độc tố gây môn mửa (Emetic toxin) loại bền nhiệt loại gene có tên Cereulide Synthetic (CRS) vi khuẩn tổng hợp Nagoya City Public Health Research Institute, Nagoya University kết hợp hãng Takara đưa Kit xét nghiệm nhanh Bacilus cereus với quy trình xét nghiệm dựa kó thuật PCR Bộ Kit xét nghiệm hai loại gene tổng hợp : • CRS Bacillus cereus • LE ( Lecithinase enzyme gene) bacillus cereus loài chi bacillus atharcis, bacillus thuringiensis Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 35 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.5 : Bộ Kit PCR Thành Phần Chính Của Kit: (25 µl X 50 Reactions) • x PCR Premix * 500 µl ( Gồm hỗn hợp dNTP, IC, enzyme TaKaRa Ex TaqTM HS) • Hỗn hợp CRS Primer 50 µl (Để phát cereulide synthetic enzyme gene) • Hỗn hợp LE Primer 50 µl (Để phát lecithinase gene) • Hỗn hợp I.C Primer 50 µl (Để phát internal control) • Khuôn mẫu dương CRS 10 l • Khuôn mẫu dương LE 10 l Bảo Quản Bộ Kit : -20 oC Các Loại Hóa Chất Và Dụng Cụ Khác: • Nước chưng cất tiệt trùng • NuSieve 3:1 agarose ( Lonza biosciences) • Hệ đệm điện di (TBE powder (Cat.#T905) • Thang chuẩn DNA pHY marker (Cat.#3404A/B) Ф X174 Hin C II digest (Cat.#3406A/B) 100 Bp DNA (Cat.#3407 A/B) • Hệ đệm thò (6x : 30% glycerol, 0.03% bromophelnol blue, 0.03% xylene cyanol, 30mM EDTA, hãng TaKaRa cung cấp) Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 36 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn • Hóa chất nhuộm màu DNA (Ethidium bromide, SYBR green, Gelstar Nucleic acid stain (Hãng Lonza Biosciences)) • Máy gia nhiệt ( tới 95oC) • Máy li tâm tương thích với ống nghiệm 1.5ml • TaKaRa PCR Thermal Cycler DiceTM (Cat.#TP600,650) • Dụng cụ điện di • Nguồn điện • Đèn cực tím • Polaroid Camera chụp ảnh điện di • Ống nghiệm 1.5 ml (TaKaRa (Cat.#9047)) • Micropipettes loại 20 µl 200 µl • Nút đậy Micropipettes • Màng Polaroid • Khay nhuộm màu Agarose Gel Cách Thức Tiến Hành Chuẩn bò mẫu: • Mẫu vi sinh vật phân lập • Lấy lượng vi khuẩn từ khuẩn lạc nuôi cấy môi trường NGKG (Nissui Pharmaceutical Co.,Ltd) micropipette Thêm vào mẫu 100 µl nước tiệt trùng • Gia nhiệt mẫu lên 95oC phút • Lấy µl mẫu sau gia nhiệt để chạy PCR Mẫu từ thực phẩm • Lấy lượng nhỏ mẫu thực phẩm, cho mẫu vào môi trường SCD (Tryptosoya bouillon, Nissui Pharmaceutical Co.,Ltd) có chứa thêm Polymixin Thể tích môi trường gấp 10 lần thể tích mẫu Xay mẫu nhuyễn • Để mẫu nhiệt độ 35 oC 5-6h qua đêm • Ly tâm 1.3ml mẫu phút (1000vòng/phút) Lấy 1ml phần phía dòch mẫu sau li tâm cho vào ống Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 37 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn nghiệm ly tâm vận tốc 12,000 vòng/phút phút • Bỏ phần bã phía trên, thêm vào ống nghiệm 100 µl hệ đệm TE • Gia nhiệt tới 95 oC phút • Lấy 1ml dòch sau gia nhiệt chuẩn bò chạy PCR Phản ứng PCR Cho vào ống nghiệm PCR hỗn hợp sau: • 5x PCR premix 10 µl • CRS primer mixture 10 µl • LE primer mixture 10 µl • I.C primer mixture 10 µl • dH2O 36 µl Total = 49 µl - Thêm vào µl dòch mẫu sau gia nhiệt tạo mẫu dương Ngoài chuẩn bò mẫu âm cho phản ứng cách lấy 49 µl hỗn hợp trên, thêm vào µl nước tiệt trùng Đậy ống lắp đặt vào Thermal cycler Chạy PCR với thông số sau : • 94 oC 30s • 55 oC 30s, lặp lại 40 lần • 72 oC 30s Phản ứng PCR kết thúc khoảng 2h Bảo quản mẫu sau chạy PCR -20 oC Chuẩn bò gel agarose • Cho vào bình tam giác hệ đệm điện di thêm vào từ từ NuSieve 3:1 agarose ( Lonza biosciences) đạt nồng độ 3% thể tích Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 38 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn • Gia nhiệt 2-3 phút lò vi sóng Sau khuấy hỗn hợp đồng Tiếp tục gia nhiệt thêm lần • Thiết lập gel • Khi dòch Agarose gel nguội xuống 50-60 oC, tiến hành thêm hóa chất nhuộm màu Ethidium bromide 0.5 µg/ml, khuấy hỗn hợp gel • Đổ gel lên gel tạo rãnh gel • Để gel nhiệt độ phòng 30 phút để gel cứng lại • Sau gel đạt độ cứng, đưa gel vào thiết bò điện di Chạy điện di • Kết nối dây điện theo cực • Thêm µl hệ đệm thò vào ống sản phẩm chạy PCR lắc hỗn hợp • Rót từ từ hỗn hợp vào rãnh gel micropipette Lưu ý hai rãnh bên phải trái gel rót DNA maker (Thang DNA chuẩn 100 bp) Kết thảo luận Kết sau điện di thể có mặt đoạn gene sau:  Cereulide synthetic enzyme (CRS) gene: 426 bp  Lecithinase (LE) gene: 227bp  Internal Control (I.C.): 106 bp Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 39 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn  Hình 2.6 : Kết điện di • Hình ảnh điện di A có nghóa có Bacillus cereus loài bacillus khác mẫu thử có số lượng giới hạn phép thử, nhiễm loài vi sinh vật khác loài bacillus • Hình ảnh B có nghóa mẫu có chứa Bacillus cereus gây độc tố Cereulide (CRS) • Hình ảnh C chứng tỏ mẫu thử chứa Bacillus cereus không gây độc tố Cereulide (CRS), chứa loài chi bacillus khác (Bacillus thuringensis, bacillus antharcis) Mẫu phản ứng âm Nagative control reaction ( mẫu phân tích nước tiệt trùng) cho kết điện di hình A Nếu mẫu phản ứng âm cho kết điện di hình B,C xảy trình nhiễm khuẩn lạ khác suốt trình thực phép phân tích Lúc cần phải rà soát lại Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 40 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn trình để đảm bảo vô trùng phân tích tiến hành thử lại Nếu mẫu âm không cho kết điện di phản ứng PCR chạy không kó thuật, có yếu tố khác ảnh hưởng đến : hóa chất lạ, kit bò hư hỏng… Hình 2.7 : Hình ảnh kết điện di 3.2.6 Kỹ thuật Microarray, Macroarray: Kỹ thuật thực chất dựa kỹ thuật lai phân tử, phiến kính màng cellulose có gắn hàng chục nghìn mẫu dò ADN theo trình tự xác định Nhờ vào phản ứng lai, bắt cặp ADN có trình tự tương đồng mà có mặt đoạn gen vi sinh vật đích phát số copy xác định xác Với kỹ thuật xác định nhiều gen đích ( vi sinh vật) thời điểm với mức độ xác cao thời gian nhanh xác 3.2.7 Phương pháp phát vi sinh vật kỹ thuật Real Time PCR: Ngun tắc : Kỹ thuật Real Time PCR hay gọi PCR động dựa ngun tắc kỹ thuật PCR Tuy nhiên cho phép hiển thị theo dõi trực tiếp qúa trình nhân DNA diễn theo chu trình nhiệt qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang Dựa vào độ phát huỳnh quang ta định lượng đoạn DNA hình thành Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 41 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Do mồi có tính phát quang đánh dấu chúng với chất nhuộm khác nhau, nhờ để nhân đoạn khác phản ứng PCR Tuy nhiên phương pháp có hạn chế phải tổng hợp mẫu dò khác cho trình tự nhận biết khác nhau.[10] Các phương pháp định lượng Real time PCR • Phương pháp sử dụng chất nhuộm mầu SYBR Green: Chất nhuộm mầu gắn với rãnh nhỏ chuỗi DNA kép, gắn với sợi DNA kép cường độ phát huỳnh quang tăng lên, tạo nhiều tín hiệu phát chất mầu tăng lên theo tỉ lệ thuận Ưu điểm phương pháp SYBR đính vào chuỗi DNA kép có mặt • Phương pháp đầu dò thuỷ phân TaqMan: Kỹ thuật sử dụng đầu dò phát huỳnh quang, mẫu dò oligonucleotit đầu gắn với chất nhuộm mầu có phát huỳnh quang, đầu gắn với chất nhuộm có vai trò làm tắt phát huỳnh quang Khi có mặt đoạn DNA cần nhân, mẫu dò gắn vào DNA khn vùng mồi theo hướng 5’ Ở trạng thái khơng có tượng phát huỳnh quang Khi bắt đầu tiến hành quy trình PCR với hoạt động enzyme taq-polymerase mồi kéo dài gặp mẫu dò mẫu dò bị phân giải hoạt tính 5’ nuclease taq-DNA polymerase.Sự phân giải mẫu dò làm giải phóng chất nhuộm mầu có khả phát huỳnh quang khỏi ảnh hưởng kìm hãm chất nhuộm có vai trò làm tắt phát huỳnh quang Sự phát huỳnh quang nhận biết • Phương pháp đầu dò lai Trong kỹ thuật đầu dò gắn với chất cho huỳnh quang đầu 3’ đầu dò thứ hai gắn với chất nhuộm huỳnh quang Khi hai đầu dò tiến lại gần nhau, cách khoảng 1-5 nucleotide, chất phát quang phát từ chất cho huỳnh quang kích thích chất nhận huỳnh quang kết phát tín hiệu huỳnh quang Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 42 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Hình Sơ đồ số phương pháp kỹ thuật Real Time PCR Ưu điểm : • Kỹ thuật khắc phục nhược điểm PCR sau: • -Khơng cần chạy điện di kiểm tra kết PCR • -Có thể định lượng xác sản phẩm PCR, sử dụng PCR thơng thường việc phân biệt dựa độ lớn vạch thu sau điện di • -Độ đặc hiệu độ nhạy cao hơn, thời gian tiến hành phản ứng ngắn • -Có thể tiến hành với nhiều đoạn DNA lúc ống nghiệm nên giảm khả nhiễm mẫu Kết luận chung: Bào tử tế bào sinh trưởng B cereus xuất cách rộng rãi tự nhiên, đặc biệt đất (trong đất chứa 105 – 106 bào tử/g), tìm Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 43 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn thấy nguồn thực phẩm dạng tươi hay qua chế biến ngoại trừ thực phẩm trùng nhiệt hay chiếu xạ Phần lớn giống vi khuẩn B cereus phát triển thực phẩm có độ chua thấp nhiệt độ 150C 550C (nhiệt độ tối thích 30 – 350C), phát triển trog khoảng pH 5.0 8.8 Độc tố emetic (gây nơn mửa) B cereus bền nhiệt, tồn 1260C 90 phút Ngược lại, độc tố diarrheal (gây tiêu chảy) nhạy cảm với nhiệt độ bị vơ hoạt nấu chín nhiệt độ 560C phút Chủng loại, cấu trúc thành phần cấu tạo độc tố đường ruột B cereus cần nghiên cứu xa Cần thao tác kiểm tra ống nghiệm độc tố emetic kiểm tra cụ thể hoạt động mặt sinh học độc tố diarrheal Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 44 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Tơ Minh Châu(2005), Giáo trình vi sinh sở Nguyễn Thị Hiền, Phan Thị Kim, Trương Thị Hồ, Lê Thị Lan Chi (2003), Vi sinh vật nhiễm tạp cơng nghệ thực phẩm, NXB Nơng Nghiệp Hà Nội Nguyễn thị Kim Hoa (2004), Phát triển kỹ thuật PCR phân tích listeria monocytogenes gây bệnh thực phẩm, Luận văn thạc sỹ khoa học, Hà Nội Lâm Xn Thanh (2004), Giáo trình cơng nghệ sản phẩm sữa, NXB KHKT, Hà Nội Trần Linh Thước, Các phương pháp kiểm tra vi sinh vật nước thực phẩm, NXB giáo dục đào tạo Phùng Thị Thủy (2006) Góp phần kiểm sốt nhiễm tạp vi sinh vật q trình sản xuất sữa tiệt trùng với hỗ trợ kỹ thuật PCR, Luận văn thạc sỹ khoa học Tiếng Anh Applied Biosystems (AB) SYBR Green PCR and RT-PCR reagents 2001 B.Janatova, J Lukaaova(2001) heat resistaince of bacillus spp.Spore isolated from cow’s milk and farm ebvironment ” Acta Vet .Brono,70 Candrian U,Furrer B, Hofelein C, Meyer R, jermini M, Luthy J.(1991), ”Detection of Escherichia coli and identification of enterrotoxigenic strains by primer-directed enzymatic amplification of specific DNA sequences” :39-51 Sanjoy Das, P.K Surendran* & Nirmala Thampuran,2007, PCR-based detection of enterotoxigenic isolates of Bacillus cereus from tropical seafood DOUGLAS J BEECHER AND AMY C LEE WONG, 1994, dentification and Analysis of the Antigens Detected by Two Commercial Bacillus cereus Diarrheal EnterotoxinImmunoassay Kits M A ANDERSSON, R MIKKOLA, J HELIN, M C ANDERSSON, AND M SALKINOJA-SALONEN, 1998, A Novel Sensitive Bioassay for Detection of Bacillus cereus Emetic Toxin and Related Depsipeptide Ionophores Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 45 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Marcela Vyletělová, Juraj Banykó, Detection of Enterotoxins in Bacillus cereus by Multiplex PCR Method, BCET-RPLA and ELISA Assay, Research Institute for Cattle Breeding, Ltd., Výzkumníků 267, 788 13 Vikýřovice, Czech Republic http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/VSATTP/qddanhmuc/gioihanonhiem asp http://aem.asm.org/cgi/content/full/68/10/4853 10 http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-home.htm 11 http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf 12 http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.html 13 http://www.takara-bio.com 14 http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-14.html 15 http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-20a.html Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 46 [...]... B .cereus và các Bacillus khác cùng nhóm khơng tinh thể độc Cách tính kết quả: • Số tế bào B .cereus/ 1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc ở mỗi độ pha lõang và hiệu chỉnh bằng tỉ lệ khẳng định (phần trăm khuẩn lạc được xác nhận là B .cereus) Ví dụ: số khuẩn lạc đếm được ở độ pha lõang 10 -4 là 65, có 4 trong 5 khuẩn lạc được chọn xác nhận là B .cereus (được kiểm tra bằng các phản ứng sinh hóa) • Số tế bào B .cereus/ 1g... B .cereus bằng phương pháp đếm khuẩn lạc: Phát hiện bằng mơi trường chọn lọc: Trải 0.1ml mỗi độ pha lỗng lên các mơi trường thạch rồi ủ 24h ở 30oC: MYP: do B .cereus khơng lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymicin nên khuẩn lạc B .cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa, chứng tỏ lecithinase được tạo thành MOSSE: khuẩn lạc to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng Chọn từ 5 khuẩn. .. Institute, Nagoya University kết hợp cùng hãng Takara đã đưa ra bộ Kit xét nghiệm nhanh Bacilus cereus cùng với quy trình xét nghiệm dựa trên kó thuật PCR Bộ Kit này xét nghiệm hai loại gene tổng hợp : • CRS của Bacillus cereus • LE ( Lecithinase enzyme gene) của bacillus cereus và các loài cùng chi như bacillus atharcis, bacillus thuringiensis Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 35 Tai lieu chia se tai:... se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Xác Đònh Bacillus Cereus Bằng Phương Pháp Elisa Hai loại độc tố gây ra trúng độc thực phẩm do Bacillus cereus sinh ra là Emetic oxin (độc tố gây nôn) và Diarrhoeal Enterotoxin (độc tố gây tiêu chảy) Phương pháp xác đònh Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin (BDE) bằng kó thuật phân tích Elisa được Terca International Pty đưa ra qua bộ Kit Tecra® Bacillus Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn... wWw.SinhHoc.edu.vn Hình 2.4 : Kết quả điện di sản phẩm chạy PCR Xác đònh B .cereus bằng PCR Như đã trình bày ở phần mở đầu, Bacillus cereus là loài vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm với hai triệu chứng : Nôn mửa (Emetic) và tiêu chảy (Diarrheic) Trong đó độc tố gây môn mửa (Emetic toxin) là loại bền nhiệt do một loại gene có tên Cereulide Synthetic (CRS) của vi khuẩn tổng hợp Nagoya City Public Health Research Institute,... 30oC/48-72h -> kiểm tra sự phát triển của rễ giả (B .cereus khơng tạo cấu trúc rễ giả, thường tạo nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B.mycoides (cấu trúc giống như rễ hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy) Bacillus cereus (khơng có cấu trúc rễ giả) Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn 18 Tai lieu chia se tai: wWw.SinhHoc.edu.vn Bacillus Mycoides (có cấu trúc rễ giả) Thử nghiệm... Gram (-) có màu đỏ hồng (E.Coli) B .cereus là trực khuẩn lớn, Gram (+), thường kết hợp với nhau thành dạng chuỗi; bào tử hình bầu dục, khơng có dạng bào tử nang Dùng que cấy vòng chuyển một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinh dưỡng vào 0.5ml BPW vơ trùng Tạo huyền phù hóa dịch cho các phản ứng sinh hóa phía sau Thử nghiệm lên men glucose: Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose... nhân cơng và thời gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong cơng tác phòng ngừa Bacillus cereus phân biệt với các lồi khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gây bệnh than cho người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho cơn trùng, B.mycoides, B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men... pháp 2: bổ sung 0.2ml nước cất vơ trùng vào bề mặt mơi trường thạch nghiêng Nutrient Agar -> cấy huyền phù vi khuẩn vào -> ủ thạch nghiêng ở 30oC/6-8h -> nhỏ nước vơ trùng lên kính hiển vi, đặt sinh khối vi khuẩn vào -> quan sát dưới kính hiển vi để kiểm tra sự di động Hầu hết các chủng B ,cereus, B.thuringiensis là di động; B.anthracis và B.mycoides khơng di động Sự hình thành rễ giả: chạm nhẹ que... các chủng âm tính Do có hình thái đặc trưng trên các mơi trường thạch chọn lọc như : Mannitol-Egg YolkPolymycin (MYP), Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymicin Elgelb Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA), nên B .cereus còn được phát hiện và định lượng bằng mơi trường này Ngồi ra B .cereus cũng được định lượng bằng phương pháp MPN Qui trình phân tích: 25g mẫu + 225ml mơi trường pepton đệm (BPW) -> đồng ... Nutrient Agar -> cấy huyền phù vi khuẩn vào -> ủ thạch nghiêng 30oC/6-8h -> nhỏ nước vơ trùng lên kính hiển vi, đặt sinh khối vi khuẩn vào -> quan sát kính hiển vi để kiểm tra di động Hầu hết... Ở vi sinh vật, biến dưỡng lượng phương thức lên men từ glucose qua đường đường phân tạo chất trung gian chủ yếu pyruvic acid Để khơi phục dự trữ NAD+ tế bào phục vụ cho đường đường phân lồi vi. .. wWw.SinhHoc.edu.vn Ngồi vi khuẩn có enzyme hemolyzin protein gây độc mạnh gây chết người Độc tố trung hòa cholesterol huyết góp phần cho phát triển vi khuẩn Triệu chứng trúng độc: • Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: