Slide đề tài vi khuẩn bacillus cereus

BÁO CÁO TIỂU LUẬN: VI KHUẨN BACILLUS CEREUS NỘI DUNG 1. Mở đầu ­ Giới thiệu Bacillus cereus + Đặc điểm Bacillus cereus + Tính chất sinh hóa + Tính chất gây bệnh 2. Độc tố và cơ chế sinh độc tố + Giới thiệu chung về độc tố Ba.cereus + Cơ chế gây bệnh 3. Các phương pháp xác định + Phương pháp truyền thống + Phương pháp hiện đại GIỚI THIỆU BAC CEREUS  Trực khuẩn Gram dương  Thuộc giới bacteria   Ngành (phylum) firmicutes   Lớp (class) bacilli   Bộ (order) Bacillales   Họ (family) Bacillaceaem    Chi (genius) Bacillus   Loài (species) Cereus  GIỚI THIỆU BAC CEREUS Trong chi này, loài cereus, có số loài khác như: • Bacillus coagulans • Bacillus subtilis • Bacillus thuringiensis • Bacillus natto • Paenibacillus larvae GIỚI THIỆU B CEREUS  Được phát ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955  Bacillus cereus loài vi khuẩn hiếu khí   Bào tử dạng hình ovan có khả sinh nha bào Bacillus cereus kính hiển vi GIỚI THIỆU BAC CEREUS Bacillus cereus Infections Bacillus cereus subsp. mycoides.  Gram stain GIỚI THIỆU BAC CEREUS Bacillus cereus Infections Leifson flagella stain. B cereus food  poisoning is often associated with contaminated rice containing  heat­resistant B cereus spores ĐẶC ĐIỂM BACILLUS CEREUS  Trực khuẩn Gr+  Tạo nội bào tử  Kích thước 0.5-1.5 x 2-4 μm  Không tạo giáp mô, khả di động  Nhiệt độ tối thích: 35-400C  pH tối thích: 4.5-9.3 Mô hình cấu tạo B.cereus ĐẶC ĐIỂM BACILLUS CEREUS  Trên MT NA hay TSA sau 24 tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì  Trên MT BA tạo dung huyết rộng  Trên MT MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh có vòng sáng  Trên MT Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng … TÍNH CHẤT SINH HÓA B.CEREUS  Trên môi trường đường: lên men glucose điều kiện hiếu khí kị khí, không lên men mantose  Khử nitrat thành nitrit  Phân giải Tyroxin  Catalase (+), Citrate (+) 10 Kết quả: 1) Cereulide synthetic enzyme (CRS) gene: 426 bp 2) Lecithinase (LE) gene: 227bp 3) Internal Control (I.C.): 106 bp 45 Detection Real Time qPCR Kit dNTPs prime r buffer DNA SYBR Green Tag 46 Phương pháp Real Time qPCR o Ưu điểm: dễ sử dụng, nhạy, hiển thị theo dõi trực tiếp trình nhân DNA diễn o Nhược điểm: SYBR liên kết với DNA mạch kép phản ứng nên dẫn đến kết cao so với nồng độ đích 47 Gen HblA Gen BceT Gen entFM Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu Phản ứng PCR Phản ứng PCR Phản ứng PCR Duỗi xoắn DNA 94oC / 30s Duỗi xoắn DNA 94oC / 45s Gắn mồi 58oC/ 45s/30 lần Gắn mồi 65-55oC/ 45s/30 lần Kéo dài 72oC / 1ph Chạy điện di Kéo dài 72oC / 45s Chạy điện di Duỗi xoắn DNA 94oC / 45s Gắn mồi 52oC/ 45s/30 lần Kéo dài 72oC /1ph Chạy điện di 48 PHƯƠNG PHÁP PCR  Multiplex PCR:  Hỗn hợp PCR có nhiều cặp mồi  Phương pháp phát nhanh nhiều đoạn gen phản ứng  Ưu điểm: Giảm thời gian phân tích mẫu 49 BCETRBLA test kit Tecra BDE test kit ( ELISA VIA) PCR 50 51 52 53 54 B cereus group – Bal gen – PCR test Lane M: 100 bp DNA ladder, Lane 1: B cereus NCIM 2106, Lane 2: B subtilis NCIM 2545, Lane 3: Salmonella Dublin ATCC 15480, Lane 4: E coli MCIM 2068, Lanes 5-10: B cereus isolates, Lane 11: Staphylococcus aureus NCIM 2079, Lanes 12-15: B cereus isolates 55 NHẬN XÉT:  ELISA-BDE cho kết dương tính với dòng B.cereus có độc tố NHE (Omnii & Nduhiu, 2005; Marcela Vyletělová, Juraj Banykó, ) với độ nhạy 1ng/ml dịch thực phẩm bị nhiễm  BCET – RPLA cho kết dương tính với dòng có độc tố HBL, chạy PCR kiểm tra có diện gen hblA (Sanjoy Das et al.,2007;Mantynen & Lindstrom, 1998, ), có độ nhạy cao với protein L2/HBL (Douglas J.Beecher et al.,1994), 2ng/ml  81% dòng B.cereus sinh độc tố NHE, 53% dòng sinh độc tố HBL, 18% dòng cho loại độc tố tổng 96 loài (Omnii & Nduhiu, 2005)  65% cho kết dương tính với Tecra test, 51% với BCET-RPLA test (Beattie & Williams, 1998)  Primer BalF/BalR khuyếch đại đoạn gen 533bp đặc hiệu cho nhóm B.cereus (Sanjoy Das et al.,2007) 56 Độc Tố Thành phần độc tố Hemolytic enterotoxin (HBL) Diarrhoel enterotoxins Nonhemolytic enterotoxin (NHE) Protein Gen mã hoá L2 hblC BCET-RPLA test kit L1 hblD (B.cereus enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination Oxoid test kit) B hblA phát protein L2/HBL NheA nheA Tecra BDE ( ELISA - VIA) NheB nheB Bacillus Diarrheal Enterotoxin visual immunoassay - Tecra kit test) NheC nheC phát protein NheA 45kDa / NHE cytK-1 cytK-2 entFM bceT cytK-1 cytK-2 entFM Enterotoxin T Cytoxin K Enterotoxin FM Emetic toxin (Cereulide) Cereulide Ces ( CRS) Phương pháp phát Sperm motility test (Swensson et al.,2005;…) PCR 57 Marie-Hélène Guinebretìere et al,.2002; Marcela Vyletělová, Juraj Banykó,… ) KẾT LUẬN  B.cereus có loại độc tố:  Diarrhoeal enterotoxin,thời gian ủ bệnh dài 8-16h, gây ngộ độc tương tự loài Clostridium perfringens, bất họat 56oC/30phút, sống pH 4-11  Emetic toxin (cereulide), thời gian ủ bệnh ngắn 1-6h , gây ngộ độc tương tự loài Staphylococcus, bất họat 120oC/90ph, sống pH 2-11   Phương pháp miễn dịch :  ELISA-BDE dương tính với độc tố NHE  BCET-RPLA dương tính với độc tố HBL Diarrhoel enterotoxins B.cereus phát triển 35-40oC Các thực phẩm sau nấu chín để nguội dễ bị nhiễm b.cereus, cần bảo quản thực phẩm 60oC 58 59 [...]... HÌNH ẢNH B .Cereus trên kính hiển vi điện tử Khuẩn lạc B .cereus trên môi trường thạch máu cừu 31 B .Cereus không tạo cấu trúc rễ giả B.mycoides tạo cấu trúc rễ giả 32 Khuẩn lạc B .cereus trên môi trường Mossel Khuẩn lạc B .cereus trên môi trường MYP 33 PHƯƠNG PHÁP HIỆN ĐẠI  BCET – RPLA  (B .cereus enterotoxin Reverse Passive Latex Agglutination  )  BDE ­ ELISA  (Bacillus Diarrheal Enterotoxin Visual ImmunoAssay... Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết người Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho sự phát triển của vi khuẩn Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau như: nhiễm trùng máu, vi m màng não, và nhiễm trùng mắt 13 TRIỆU CHỨNG TRÚNG ĐỘC  Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/ g...TÍNH CHẤT GÂY ĐỘC Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm 11 ĐỘC TỐ CỦA BACILLUS CEREUS  Phát hiện đầu tiên các về các mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm do vk bac .cereus là từ năm 1949 khi Hauge đã phân lập mẫu từ xốt vani sau khi có một ca ngộ độc thực phẩm gây tiêu chảy tại bệnh vi n ở Oslo, Norway Xốt... tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h 12 ĐỘC TỐ CỦA BACILLUS CEREUS     Độc tố gây tiêu chảy (Diarrhoed toxin): Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rau quả, gia vị Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột, gây tiêu chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng Độc tố gây nôn mửa emetic toxin: Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu các loại Bản chất độc tố là phospholipit... Nhuộm Gram, thử sinh hóa Tra bảng MPN 28 Các thử nghiệm phân biệt các loài Bacillus nhóm 1  Thử nghiệm tính di động: hầu hết các chủng B .cereus; B.thuringgiensis là di động, B.anthracis, B.mycoides không di động  Sự hình thành rễ giả: B .cereus không tạo cấu trúc rễ giả, B.mycoides tạo cấu trúc rễ giả  Thử nghiệm làm tan máu: B .cereus làm tan máu mạnh, tạo vùng tan máu hoàn toàn (β) 2-4µm, B.thuringiensis... thường không làm tan máu trong 24h  Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể:B.thuringiensis tạo tinh thể độc tố, B .cereus và các Bacillus khác không tạo tinh thể độc tố 29 Tiêu chuẩn vi sinh cho phép trong thực phẩm , Bộ y tế 4/1998 Gới hạn cho phép (CFU/g hoặc CFU/ml thực phẩm) Nhóm thực phẩm B .cereus Nhóm thịt •Thịt tươi, thịt đông, thịt xay nhỏ, thịt nghiền, thịt chế biến •Sản phẩm chế biến từ thịt: thịt... điều không thể chấp nhận Điều này xảy ra khi, số lượng B .cereus tồn tại trong thực phẩm thấp nhất là 106/g hoặc /ml và lượng lớn của độc tố đường ruột phải được hình thành để chống chịu được với pH của dạ dày và 19 enzyme proteolytic của tá tràng CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ Diarrheal Syndrome Bảng 1­2 Đặc điểm bệnh tiêu chảy gây ra bởi  chủng vi khuẩn B. cereus                                                                Đặc tính... Phản ứng VP + + + + - Sinh acid từ manitol - - - - + Tan máu (cừu) + + + -(d) - 25 Phương pháp truyền thống Phương pháp đếm khuẩn lạc Mẫu Đồng nhất mẫu Phân lập Khẳng định Đếm số khuẩn lạc điển hình Nhuộm Gram Test sinh hóa 26 Cách tính kết quả: Mật độ (CFU/ml)=AixDi/V Ai:số khuẩn lạc trung bình/đĩa Di: độ pha loãng V: Dung tích huyền phù tế bào cho vào mỗi đĩa (ml) 27 Phương pháp truyên thống Phương... khuẩn lạc  Phương pháp MPN - Các phương pháp hiện đại:  Phương pháp RPLA  Phương pháp ELISA  Phương pháp PCR 22 PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG 23 Ưu & nhược điểm - Ưu điểm:  Không phải đầu tư dụng cụ, thiết bị đắt tiền - Nhược điểm:  Độ nhạy không cao  Yêu cầu kỹ năng thao tác  Tốn nhiều hóa chất  Thời gian phân tích lâu  Tốn nhiều nhân công 24 Các đặc tính của Bacillus nhóm 1 Loài Đặc tính B .cereus. .. tiêu nhiều nước, thỉnh thoảng buồn nôn 20 CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ  Bào tử của B cereus từ mô tả đầu tiên ở trên (phần giới thiệu chung) là được phân biệt để cho thấy rằng chúng có khả năng bám vào các tế bào Caco-2 (trên các tế bào biểu mô của người) Sau khi bám vào, các bào tử này nảy mầm một cách nhanh chóng (trong vòng 1h), hình thành tế bào B cereus sinh dưỡng trên đỉnh của các tế bào biểu mô, tiếp đó là sản ... B CEREUS  Được phát ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955  Bacillus cereus loài vi khuẩn hiếu khí   Bào tử dạng hình ovan có khả sinh nha bào Bacillus cereus kính hiển vi GIỚI THIỆU BAC CEREUS. .. phát triển vi khuẩn Bacillus cereus gây nhiễm trùng nhiễm độc khác như: nhiễm trùng máu, vi m màng não, nhiễm trùng mắt 13 TRIỆU CHỨNG TRÚNG ĐỘC  Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/ g thực... GIỚI THIỆU BAC CEREUS Bacillus cereus Infections Bacillus cereus subsp. mycoides.  Gram stain GIỚI THIỆU BAC CEREUS Bacillus cereus Infections Leifson flagella stain. B cereus food  poisoning is often associated with contaminated rice containing