KIỄM TRA VI KHUẨN BACILLUS CEREUS

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM  KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM ĐỀ TÀI: KIỄM TRA VI KHUẨN BACILLUS CEREUS GVHD: NGUYỄN THỊ MỸ LỆ BUỔI: Thứ , tiết  10 ĐỘC TỐ VÀ CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ ỨNG DỤNG I-Giới tiệu Bacillus cereus: • Trực khuẩn Gram dương • Thuộc giới bacteria • Ngành (phylum) firmicutes • Lớp (class) bacilli • Bộ (order) Bacillales • Họ (family) Bacillaceaem • Chi (genius) Bacillus • Lồi (species) Cereus  Bacillus cereus trên kính hiển vi  Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 Trong chi bacillus ngồi lồi cereus có số lồi như: • Bacillus subtilis • Bacillus coagulans •  Bacillus thuringiensis •  Bacillus natto •  Paenibacillus larvae  Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 • Được phát ca nhiễm độc thực phẩm vào năm 1955 • Bacillus cereus lồi vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy ý, di động • Bào tử dạng hình ovan • có khả sinh nha bào Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 Bacillus cereus Infections Bacillus cereus subsp mycoides Gram stain Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Khuẩn lạc Bacillus cereus môi trường BA Thứ 5, Tiết  10 1) Đặc điểm • Kích thước 0.51.5 x 24à Hiờu khớ, k khớ tựy ý, di động • Tạo nội bào tử • Lên men glucose sinh • Phản ứng VP( +) Mơ hình cấu tạo B.cereus Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 2) Đặc điểm nuôi cấy Nhiệt độ 5oC-50oC, tối ưu 35oC-40oC pH 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2 Trên môi trường NA hay TSA sau 24 tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì Trên mơi trường BA tạo dung huyết rộng Trên mơi trường MYP : khóm hồng chung quanh có vòng sáng Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh có vòng sáng Trên mơi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn 3) Tính chất sinh hóa Trên mơi trường đường: lên men glucose điều kiện hiếu khí kị khí, khơng lên men mannitol Khử nitrat thành nitrit Phản Phân Catalase Mọc (+), NB + ứng VP giải Citrate 0,001% (+) Tyroxin (+) lyzozym Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 •Các thử nghiệm phân biệt lồi Bacillus nhóm I: + Thử nghiệm tính di động Thử nghiệm tính di động lồi Bacillus nhóm I Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 +Sự hình thành rễ giả: Bacillus cereus (khơng có cấu trúc rễ giả) Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Bacillus Mycoides (có cấu trúc rễ giả) Thứ 5, Tiết  10 +Thử nghiệm làm tan máu Bacillus cereus tạo vùng tan máu 2-4mm xung quanh vùng phát triển Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 +Sự tạo độc tố protein dạng tinh thể: •Cấy vi khuẩn từ mơi trường TSA sang 2.5ml môi trường Nutrient Broth chứa 0.001% lysozyme, thực tương tự với môi trường không chứa lysozyme  ủ ở 350C 24  kiểm tra tăng trưởng môi trường chứa không chứa lysozyme Bacillus phát triển làm mơi trường đục đều, ống có kết âm tính ủ thêm 24 để kết luận vi khuẩn có kháng lysozme hay khơng Dựa vào bảng để khẳng định dòng chọn B.cereus hay khơng Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 c) Cách tính kết quả: •Số tế bào B.cereus/1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc độ pha loãng hiệu chỉnh bằng tỉ lệ khẳng định (phần trăm khuẩn lạc xác nhận B.cereus) Trong đó: N: tổng số khuẩn lạc đếm n: số lượng đĩa đếm f: độ pha loãng tương ứng V: thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa R: tỉ lệ xác nhận = tỉ lệ số khuẩn lạc nghi ngờ cho thử nghiệm dương tính so với số khuẩn lạc nghi ngờ Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 II-Các phương pháp phân tích nhanh: 1) Phương pháp miễn dịch 2) Phương pháp Elisa: 3) Kĩ thuật latex agglutination (LA): 4) Kĩ thuật lai phân tử ( DNA- hybridization) 5)Kỹ thuật PCR: 6) Kỹ thuật Microarray: 7) Phương pháp phát vi sinh vật kỹ thuật Real Time PCR Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 TIẾN HÀNH PHÂN TÍCH VI KHUẨN BACILLUS CEREUS TRÊN MẪU THỊT Bước 1 : Pha lỗng mẫu : •Mẫu đưa phòng thí nghiệm, mở cho vào khay vô trùng Dùng kéo kẹp vô trùng lấy đại diện 10g mẫu thịt cho vào bao PE vô trùng điều kiện vô trùng Mẫu thịt đồng với 90ml dung dịch pepton đệm (BPW) máy Stomacher/1phút để có độ pha lỗng dung dịch 10-1 •Dùng pipet vơ trùng hút 1ml dung dịch pha lỗng 10-1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch pepton đệm (BPW) để dung dịch pha loãng 10-2 Ta làm tới dung Máy dập mẫu dịch pha lỗng 10-6 Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 Bước 2: Cấy mẫu mơi trường MYP •Ta chọn nồng độ thích hợp 10-4 10-6, hút 0,1ml dịch pha loãng cho vào đĩa MYP (mỗi nồng độ đĩa) Dùng que gạt cẩn thận chất nuôi nhanh tốt ủ 300C, 24- 48 Bacillus cereus MYP Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 Bước 3: Khẳng định Bacillus cereus Bằng phản ứng sinh hóa •Chọn đếm đĩa có từ 15 – 150 khuẩn lạc đặc trưng bacillus cereus (dẹt, đường kính 2-3mm, bờ hình cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vòng đục) chuyễn khuẩn lạc nghi ngờ lên môi trường phục hồi TSA, ủ 300C qua đem trước tiến hành thử sinh hóa Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 Thử nghiệm lên men glucose: Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth ->ủ 350C / 24h, kị khí -> lắc mạnh ống nghiệm -> quan sát độ đục (sự phát triển); chuyển màu môi trường từ đỏ sang vàng (chứng tỏ có sinh acid glucose điều kiện kị khí) Sự chuyển màu mơi trường từ đỏ sang vàng Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 Thử nghiệm khả khử nitrate Cấy vi khuẩn vào 5ml canh trường Nitrate Broth -> ủ 350C/24h -> bổ sung vài giọt dd thuốc thử nitrate -> có màu đỏ cam xuất 10 phút (chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrit) Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 • Ống A cấy vi khuẩn canh trường Nitrate Broth chưa bổ sung thuốc thử   • Ống B C có bổ sung thuốc thử alpha-naphthylamine sulfanilic acid Ống B cho kết dương tính (nitrate bị khử thành nitrite ), Ống C cho kết âm tính với nitrite Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 Cách tính kết quả: Ví dụ: Thể tích dịch mẫu cấy vào đĩa 0.1ml, số khuẩn lạc đếm đĩa độ pha lỗng 10-4 65, có khuẩn lạc chọn xác nhận B.cereus (được kiểm tra phản ứng sinh hóa) Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm Thứ 5, Tiết  10 Kết Luận Bài thuyết trình nhóm đến kết thúc !!!! Cám ơn Cô Bạn theo dõi!!!