KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS

KỸ THUẬT ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS Nguyên tắc Số khuẩn lạc điển hình bờ hình cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục (lên men đường mannit phân giải lecithin lòng đỏ trứng gà môi trường thạch MYP) có phản ứng sinh hóa phù hợp tính số lượng B cereus g ml mẫu thực phẩm Dụng cụ, thiết bị - Máy đồng mẫu - Tủ sấy - Nồi hấp áp lực - Tủ ấm 300C - Đĩa petri vô trùng đường kính 90 – 100 mm - Pipet vô trùng loại xả hết có dung tích định danh , 5, 10 ml - Nồi cách thủy - Máy đếm khuẩn lạc - Bình thủy tinh vô trùng, dung tích 250 ml, 500 ml - Ống nghiệm vô trùng, 16 x 18 mm - pH mét - Máy vortex Môi trường, hoá chất - Nước pepton đệm Buffered Pepton Water (BPW) - Thạch Mannitol-Egg Yolk-Polymycin (MYP) - Nhũ tương lòng đỏ trứng (Egg Yolk Emulsion), 50% - Thạch dinh dưỡng Nutrient Agar cho B.cereus - Thạch máu cừu (Trypticase Soy Sheep) máu thỏ - Dung dịch polymicin B sunfat 0,1 % - Hoá chất nhuộm Gram Quy trình phân tích 4.1 Đồng pha loãng mẫu - Mẫu thực phẩm cắt nhỏ xay nhuyễn máy điều kiện vô trùng thể đồng - Cho 25g mẫu vào túi PE, bổ sung 225ml môi trường pepton đệm (BPW) đồng để có độ pha loãng 10-1, đồng Stomacher phút - Hút xác 1ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm có chứa sẵn ml nước pepon đệm, lắc 2-3 phút thu dung dịch mẫu thử 10-2 Tiếp tục làm tương tự để có dung dịch mẫu thử 10-3 Nuôi cấy phân lập - Đánh dấu lên đĩa thạch tên mẫu, nồng độ dung dịch mẫu thử - Dùng pipet ml vô trùng, hút xác 0,1 ml từ dung dịch mẫu thử 10-1 (hoặc 0,1 ml từ mẫu thực phẩm lỏng) nhỏ lên bề mặt đĩa thạch MYP, đĩa 0,1 ml Làm tương tự với độ pha loãng - Dùng dụng cụ dàn mẫu thủy tinh dàn dịch cấy lên khắp mặt đĩa thạch cho khuẩn lạc mọc phân tán Để đĩa có đậy nắp nhiệt độ phòng khoảng 15 phút lật ngược đưa vào tủ - Ủ 300C / 24h Nếu không thấy khuẩn lạc ủ thêm 24h Lưu ý: Đĩa thạch nuôi cấy phải hong khô trước dùng Mỗi mẫu thực phẩm phải nuôi cấy đậm độ pha loãng Mỗi đậm độ phải cấy lên đĩa thạch để tính trung bình cộng đậm độ 4.3 Đểm khuẩn lạc điển hình B.cereus - Khuẩn lạc B.cereus điển hình môi trường thạch MYP: dẹt, đường kính – mm, bờ hình cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục - Chọn đĩa hai đậm độ pha loãng liên tiếp, đếm khuẩn lạc điển hình đĩa 4.4 Tăng sinh chủng - Chọn khuẩn lạc điển hình từ đĩa thạch MYP cấy sang môi trường thạch nghiêng dinh dưỡng Ủ ấm 300C/ 24h 4.5 Xác định - Nhuộm Gram : cấy ria khuẩn lạc từ ống thạch dinh dưỡng Nhuộm gram, quan sát kính hiển vi - Sau thực xong quy trình nhuộm, quan sát màu nhuộm tế bào vật kính 100x B.cereus trực khuẩn lớn, Gram dương, thường kết hợp với tạo thành dạng chuỗi Bào tử hình bầu dục, dạng nang bào tử - Thử nghiệm khả tan máu: cấy khuẩn lên môi trường thạch máu Ủ 300C 24 B cereus làm tan máu mạnh tạo vùng tan máu hoàn toàn (β), đường kính 2-4 mm xung quanh vùng phát triển Đọc kết Khuẩn lạc B cereus môi trường thạch MYP: dẹt, đường kính – mm, bờ hình cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục; tan máu β Hình 1: B cereus thạch MYP Hình 2: Tan máu β B cereus Tính kết - Tính số lượng a B cereus khẳng định đĩa, theo công thức: b a = - x c A Trong đó: A: số lượng khuẩn lạc nghi ngờ mang thử TCSVHH b: số lượng khuẩn lạc dương tính khẳng định tcsvhh c: tổng số khuẩn lạc nghi ngờ đếm đĩa - Tính số lượng N B cereus khẳng định có mặt mẫu thử Tính số lượng N B cereus khẳng định có mặt mẫu thử, trung bình hai đậm độ pha loãng liên tiếp công thức sau: ∑a N = -V (n1+ 0,1 n2) d Trong đó: ∑a tổng số khuẩn lạc B cereus nhận dạng đĩa đậm độ pha loãng liên tiếp giữ lại V thể tích chất cấy đĩa, tính ml n1 số đĩa chọn độ pha loãng thứ n2 số đĩa chọn độ pha loãng thứ hai d độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ giữ lại - Làm tròn kết tính đến hai chữ số có nghĩa - Báo cáo kết theo số B cereus có ml gam sản phẩm, biểu thị theo số từ 1,0 đến 9,9 nhân 10x, x luỹ thừa tương ứng 10  ... TCSVHH b: số lượng khuẩn lạc dương tính khẳng định tcsvhh c: tổng số khuẩn lạc nghi ngờ đếm đĩa - Tính số lượng N B cereus khẳng định có mặt mẫu thử Tính số lượng N B cereus khẳng định có mặt... tan máu β Hình 1: B cereus thạch MYP Hình 2: Tan máu β B cereus Tính kết - Tính số lượng a B cereus khẳng định đĩa, theo công thức: b a = - x c A Trong đó: A: số lượng khuẩn lạc nghi... lên môi trường thạch máu Ủ 300C 24 B cereus làm tan máu mạnh tạo vùng tan máu hoàn toàn (β), đường kính 2-4 mm xung quanh vùng phát triển Đọc kết Khuẩn lạc B cereus môi trường thạch MYP: dẹt, đường