NHỮNG QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

NHỮNG QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT Thao tác an toàn yêu cầu quan trọng thí nghiệm vi sinh vật Vi sinh vật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy Trong trình làm thí nghiệm, thường thao tác với số lượng lớn đậm đặc tế bào vi sinh vật Bên cạnh giống, loài vi sinh vật có ích giống, loài có khả gây bệnh có hại sức khỏe người Mặt khác, trình thí nghiệm phải sử dụng nhiều loại hóa chất, có hóa chất có độc tính Chính thế, người làm thí nghiệm phòng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thủ qui tắc sau đây: Những qui định chung: - Những người nhiệm vụ không vào phòng thí nghiệm - Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng - Không nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự Không ăn uống, hút thuốc phòng kiểm nghiệm - Mang trang, găng tay thao tác với vi sinh vật hóa chất - Trên bàn thí nghiệm để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép Tất vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở,… phải để nơi qui định - Trước sau kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn hóa chất sát trùng cồn 70% dung dịch diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%) chuẩn bị sẵn lau khô giấy vệ sinh - Cần ghi tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người thí nghiệm lên tất hộp petri, ống nghiệm,… - Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dấy lên quần áo, sách dụng cụ cá nhân Đồng thời phải ý bảo vệ da quần áo khỏi bị dính hóa chất thuốc nhuộm - Cẩn thận thao tác với đèn cồn đèn Bunsen Tắt lửa chưa có nhu cầu sử dụng sau thực xong thao tác Tuyệt đối không dùng đèn cồn để mồi lửa đèn cồn - Sử dụng bóp cao su thao tác ống hút định lượng (pipette), Tuyệt đối không hút miệng - Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ phòng thí nghiệm chưa hướng dẫn cụ thể Sử dụng theo hướng dẫn, thận trọng, tránh làm đổ vỡ hư hỏng - Tất vật liệu bị nhiễm bẩn, môi trường chứa nhiễm vi sinh vật cần phải khử trùng trước vứt bỏ sử dụng lại Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vật cần ngâm vào dung dịch diệt khuẩn (nước javel) trước rửa tái sử dụng - Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh thiết bị, dụng cụ sử dụng theo qui trình xếp vào nơi qui định - Rửa tay trước rời phòng thí nghiệm - Tất trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán hướng dẫn thí nghiệm để kịp thời xử lý Một số lưu ý với sinh viên nhằm đạt kết tốt thực hành vi sinh vật a Trước thực hành - Cần đọc trước nội dung toàn để hình dung khối lượng công việc làm - Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích thí nghiệm - Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm b Trong thực hành: - Ghi cẩn thận dặn giảng viên thao tác qui trình thực hành - Thực thí nghiệm theo hướng dẫn giảng viên - Trong trình thí nghiệm có thao tác, công đoạn không rõ cần hỏi lại giảng viên hướng dẫn Trang - Ghi chép cẩn thận ý quan trọng thí nghiệm kết thí nghiệm c Kết thúc thực hành: - Làm báo cáo thực hành theo yêu cầu mục thí nghiệm theo yêu cầu giảng viên Trang BÀI THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT Thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật học 1.1.Tủ sấy (vacuum oven): to từ 60oC – 200oC, dùng để sấy khô, khử trùng loại dụng cụ chịu sức nóng khô, chủ yếu dụng cụ thủy tinh, kim loại Tùy vào đối tượng cần khử khuẩn mà sấy chế độ to thời gian khác nhau, thường sấy 160oC/2 giờ, 180oC/30 phút Hình Tủ sấy 1.2.Tủ ấm (incubator or etuve): to từ 20oC – 60oC, có chế độ ổn định nhiệt độ, sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật nhiệt độ thích hợp cho sinh trưởng phát triển chúng Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ t o khác để vi sinh vật phát triển tốt Ví dụ: Coliform 30oC/24h – 48h, E coli thích hợp 44oC/24h – 48h 1.3 Tủ lạnh hay tủ mát (freezer): dùng bảo quản môi trường pha chế, giống vi khuẩn, chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh,…), hóa chất, thuốc thử dễ phân hủy nhiệt độ thường 1.4 Nồi hấp ướt (Autoclave): Thiết bị cấp nhiệt nước áp suất cao (hơi nước bão hòa áp suất cao), sử dụng để hấp khủ trùng môi trường, số nguyên liệu dụng cụ thí nghiệm Tùy đối tượng mà sử dụng chế độ nhiệt độ áp suất thích hợp, thường dùng 121oC/1 atm/ 15 phút Hay 127oC/1.5 atm/30 phút với môi trường đất, 117 oC/ 0.8 atm/15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường sữa…… Thể tích môi trường nuôi cấy (ml) 25 50 100 250 500 1000 2000 4000 Thời gian hấp tiệt trùng tối thiểu (phút) 20 25 28 31 35 40 48 63 Trang Chỉ số áp kế 0,0 nồi áp suất (atm) To sôi nước (oC) 100 o o T sôi nước ( F) 212 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,5 2,0 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273 Hình Nồi hấp cao áp (Autoclave) 1.5 Cân phân tích điện tử (analytical balance): cân trọng lượng từ 100µg – 200g Độ xác 10-4 g Cân kỹ thuật (technical balance): độ xác 10 -2g Dùng cân hóa chất, môi trường A B Hình Cân phân tích (A) cân kỹ thuật (B) 1.6 Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím (UV) (flux laminar ): Có không gian vô trùng sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại phận thổi khí vô trùng Hình Tủ cấy vô trùng 1.7 Máy ly tâm (centrifuge): Dùng tách chất pha rắn-lỏng khỏi Trang tách sinh khối tế bào khỏi môi trường nuôi cấy, tách hồng cầu, enzyme,… Hình Máy ly tâm 1.8 Máy lắc (shaker): Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật cách lắc bình nuôi cấy theo chiều khác (lắc vòng lắc ngang) cách đặn để tăng lượng oxy hòa tan môi trường Hình Máy lắc 1.9 Kính hiển vi (microscope): có vai trò quan trọng nghiên cứu vi sinh vật Dùng nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả phóng đại kính (sẽ giới thiệu chi tiết sử dụng kính hiển vi) Hình Kính hiển vi quang học 1.10 Máy đo pH (pH meter): đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy vi sinh vật Trang A B Hình Máy đo pH để bàn (A), máy đo pH cầm tay (B) 1.11 Máy cất nước (single/ double water stills): dùng để cất nước Hình Máy cất nước 1.12 Bể ổn nhiệt (water bath): chứa nước cài đặt nhiệt độ định để ổn định nhiệt độ cho thí nghiệm cần ổn định nhiệt độ Hình Bể ổn nhiệt 1.13 Nồi lên men (fermenter/Bioreactor): thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật điều kiện tối ưu hóa điều chỉnh thông số môi trường nuôi cấy Trang Hình Nồi lên men 1.14 Các thiết bị khác như: máy đếm vi sinh vật, máy quang phổ, sấy đông khô,… Dụng cụ - Dụng cụ thủy tinh: có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định mức,… yêu cầu phải sạch, trong, trung tính Trước dùng đựng môi trường phải sấy khô, làm nút khử trùng tủ sấy khô - Đối với dụng cụ mới: cần ngâm nước dung dịch H 2SO4 loãng 24 Sau rửa lại nước xà phòng nhiều lần pH trung tính - Đối với dụng cụ qua sử dụng chứa môi trường vi sinh vật, cần khử trùng rửa xà phòng, phơi sấy khô - Đối với dụng cụ bị bám bẩn, cần ngâm thêm với dung dịch sulfocromic vài giờ, sau rửa lại nước - Dụng cụ đưa lên ánh sáng vết mờ vết bợn - Các dụng cụ khác: đèn cồn, giá ống nghiệm, que cấy, kẹp, kéo, bơm tiêm nhựa, đầu típ, bếp điện,… Các phương pháp khử trùng vi sinh vật * Nguyên tắc Diệt trùng hay khử trùng phương pháp nhằm ức chế loại bỏ, cuối giết chết vi sinh vật không mong muốn Người ta thường khử trùng phương pháp chính: 3.1 Phương pháp lý học * Nhiệt khô - Đối với dụng cụ cấy kim loại, thủy tinh, phương pháp thường dùng đốt: đốt trực tiếp lửa nhúng cồn đốt - Đối với dụng cụ thủy tinh gói giấy sấy 160 oC/ Dụng cụ đưa vào sấy phải chịu nhiệt độ cao không buộc dây nhựa thun * Nhiệt ẩm - Phương pháp luộc: cho vật khử trùng vào nước sôi, nhiệt thấm nhanh vào mẫu vật làm cho protein đông kết, dẫn đến giết chết vi sinh vật Tuy nhiên, diệt tế bào sinh dưỡng, bào tử - Phương pháp Pasteur: Chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh ( ký sinh ), không diệt bào tử vi khuẩn hoại sinh Phương pháp không diệt hoàn toàn mầm bệnh mà chọn vài vi sinh vật đối kháng mạnh Vì vậy, phải biết nhiệt độ thời gian diệt trùng cho loại vi sinh vật - Phương pháp Tyndall: đun cách thủy nhiều lần nhiệt độ 70- 80 oC, lần 30-60 phút liên tiếp ngày liền - Phương pháp nước bảo hòa áp suất cao: dùng autoclave * Diệt trùng xạ - Tia tử ngoại hay UV: sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật - Tia âm cực: dùng diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm Vật khử Trang trùng phải bao gói kín * Diệt trùng sóng Sóng ngắn tác động với cường độ thời gian thích hợp phá vỡ tế bào vi sinh vật, làm chết tế bào sống * Diệt trùng cách lọc - Dụng cụ lọc thường màng xốp sứ, aminate, cellulose,… thường vật phẩm lỏng không khử trùng nhiệt - Đối với khử trùng không khí thiết bị khử trùng máy lọc khí có trang bị màng lọc hay hấp phụ vi khuẩn 3.2 Phương pháp hóa học - Chất sát khuẩn da: xà phòng, cồn, iode, phẩm màu (phần lớn phẩm màu có tác dụng sát khuẩn như: xanh methylene) - Chất diệt khuẩn tẩy uế: phenol, formol, hợp chất Clor,… Những điểm cần lưu ý - Không làm vụn không thấm làm nút đậy cho dụng cụ ống nghiệm, bình tam giác - Khi nút gòn vào đuôi pipette, độ chặt phải vừa đủ, phải kiểm tra khả hút dung dịch pipette sau nút xong - Kích thước nút đậy ống nghiệm, bình tam giác phải phù hợp, tiện dụng Báo cáo thực tập - Trình bày yêu cầu việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật? - Công dụng cách sử dụng dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật? - Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ môi trường nuôi cấy vi sinh vật? Trang BÀI PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT Nguyên tắc Các chất dinh dưỡng hợp chất tham gia vào trình trao đổi chất nội bào Môi trường dinh dưỡng hỗn hợp gồm chất dinh dưỡng chất có nhiệm vụ trì oxi hoá khử, áp suất thẩm thấu tế bào ổn định độ pH môi trường Yêu cầu môi trường dinh dưỡng: có đủ chất dinh dưỡng cần thiết; có độ pH thích hợp; có độ nhớt định; không chứa yếu tố độc hại; hoàn toàn vô trùng đảm bảo phát triển ổn định vi sinh vật Phân loại môi trường dinh dưỡng: người ta dựa sở khác để phân loại môi trường - Phân loại theo nguồn gốc + Môi trường tự nhiên: dịch nước chiết thịt, nước chiết khoai tây, máu động vật + Môi trường nhân tạo: Czapeck, Hansen, EMB + Môi trường bán tự nhiên: Potatoe glucose agar (PGA), giá đậu đường - Phân loại theo trạng thái vật lý: + Môi trường lỏng: dạng lỏng, agar hay chất làm giá thể khác thành phần môi trường + Môi trường rắn: 1000ml môi trường có 15-20g agar hay chất làm giá thể + Môi trường bán lỏng (bán rắn): 1000ml môi trường có 3-5g agar hay chất làm giá thể khác - Phân loại theo công dụng: + Môi trường phân lập + Môi trường tăng sinh + Môi trường lưu giữ giống + Môi trường thử nghiệm sinh hóa Môi trường nuôi cấy vi sinh vật pha chế theo nguyên tắc: - Dựa sở nhu cầu chất dinh dưỡng khả đồng hoá chất dinh dưỡng loại sinh vật - Để đảm bảo cân áp suất thẩm thấu môi trường tế bào vi sinh vât nên cần điều chỉnh tỷ lệ nồng độ chất thành phần môi trường - Đảm bảo điều kiện hoá lý cần thiết cho hoạt động trao đổi chất vi sinh vật Dụng cụ, môi trường hóa chất 2.1 Dụng cụ STT Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Giá ống nghiệm Cái Ống nghiệm Ф18 Cái Bình tam giác Cái Phễu thủy tinh Cái Đũa khuấy thủy tinh Cái Ghi Trang STT Tên dụng cụ, thiết bị nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Cốc 100ml Cái Cốc 500ml Cái Đĩa cân nhựa Cái Bình tia Cái 10 Bếp điện Cái Đơn vị tính Số lượng STT Dụng cụ dùng chung Máy đo pH Cái Cân kỹ thuật Cái Cân phân tích Cái Nồi hấp cao áp Cái Tủ sấy Cái Ghi Ghi 2.2 Môi trường hoá chất * Môi trường nuôi cấy vi khuẩn: Môi trường cao thịt - peptone - Cao thịt: 3g - Peptone: 10g - NaCl : 5g - Agar: 20g - Thêm nước cất cho đủ 1000ml Lắc đều, điều chỉnh pH=7,0±0,2 Nấu sôi nhẹ để tan agar, phân phối môi trường vào dụng cụ để khử trùng 121 oC 30 phút * Môi trường nuôi cấy nấm men: Môi trường Hansen - Glucose, maltose (hoặc đường kính ): 50g - Peptone:10g - K2HPO4: 3g - MgSO4.7H2O : - 5g - Agar: 20g - Thêm nước cất đủ: 1000ml Lắc đều, điều chỉnh pH=6,0±0,2 Trang 10 BÀI 23 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VIBRIO CHOLERAE TRONG THỰC PHẨM (Tiêu chuẩn: TCN 200:2004) Nguyên tắc Vibrio cholerae thuộc giống Vibrio, họ Vibrionaceae phẩy khuẩn gram âm, kỵ khí tuỳ nghi, có khả di động nhanh, phản ứng oxidase dương tính, phát triển nhiệt độ 420C, lên men đường sacarose, khử lysin; phát triển môi trường muối không phát triển môi trường có nồng độ muối lớn %; nhạy với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat Vibrio cholerae nhóm vi khuẩn nguy hiểm (tác nhân gây bệnh tả), thường xâm nhiễm vào loại thủy hải sản Có khả phát dịch nhanh Trong tất loại thực phẩm, tiêu đối tượng (không phát 25g thực phẩm) Phát Vibrio cholerae cách tăng sinh môi trường lỏng chọn lọc cấy chuyển phân lập môi trường rắn chọn lọc Những khuẩn lạc nghi ngờ khẳng định thử nghiệm sinh hoá kháng huyết Dụng cụ, môi trường hóa chất 2.1 Dụng cụ Tên dụng cụ, thiết bị STT Đơn vị tính Số lượng Ghi nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Cái Ống nghiệm Ф18 Cái 15 Bình tam giác 250ml Cái Cốc 100ml Cái Bình tia Cái Pipette 1ml Cái Pipette 10ml Cái Micropipette 100-1000μl Cái Đầu týp 1000μl Cái STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi Nồi hấp cao áp Cái Tủ cấy vô trùng Cái Tủ sấy Cái Máy dập mẫu Cái Bút đếm khuẩn lạc Cái 2.2 Môi trường hoá chất * Nước pepton kiềm: Ancalin Peptone Water (APW) - Pepton : 10,00 g - Natri clorua : 10,00 g - Nước cất : đủ 1000ml - pH 8,5±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Hoà tan thành phần, chỉnh pH theo yêu cầu chia vào bình chứa thích hợp Hấp nhiệt độ 1210C 10 phút Khi bảo quản phải vặn chặt nắp bình, để tránh bay nước pH bị thay đổi * Môi trường phân lập: Thạch Thiosunfat-Citrat-Bile-muối-Sacarose (TCBS thạch) - Pepton : 10,00 g - Cao nấm men : 5,00 g - Natri xitrat : 10,00 g - Na2S2O3 : 10,00 g - Mật bò : 5,00 g - Sacarose : 20,00 g - Natri clorua (NaCl) : 10,00 g Trang 124 - Sắt (III) citrat (FeC6H5O7) : 1,00 g - Natri cholate : 3,00 g - Xanh bromthymol : 0,04 g - Xanh thymol : 0,04 g - Thạch : 15,00 g - Nước cất vô trùng đủ 1000ml - pH 8,6± 0,2 (ở nhiệt độ 250C) Ðun sôi để hoà tan hoàn toàn thành phần làm nguội tới nhiệt độ khoảng 500C Rót 15 - 20 ml vào đĩa petri vô trùng Trước sử dụng phải làm khô đĩa môi trường cách để qua đêm nhiệt độ phòng đặt đĩa tủ ấm nhiệt độ khoảng 370C - 450C Không hấp khử trùng môi trường Môi trường, thuốc thử sinh hoá * Thạch sắt ba đường: Triple Sugar Iron agar -TSI - Pepton : 15,00 g - Proteose pepton : 5,00 g - Cao thịt bò : 3,00 g - Cao nấm men : 3,00 g - NaCl : 5,00 g - Lactose : 10,00 g - Sacarose : 10,00 g - Glucose : 1,00 g - FeSO4 : 0,20 g - Na2S2O3 : 0,30 g - Ðỏ phenol : 0,024 g - Thạch : 12,00 g - Nước cất đủ : 1000 ml - pH = 7,4±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Hoà tan thành phần, chia vào ống nghiệm khoảng ml Hấp nhiệt độ 121 0C 15 phút Trước môi trường đông, đặt ống nằm nghiêng cho phần thạch đứng cao khoảng - cm phần thạch nghiêng khoảng - cm * Thạch sắt hai đường: Klingler Iron Agar -KIA - Polypepton pepton : 20,00 g - NaCl : 5,00 g - Lactose : 20,00 g - Dextrose : 1,00 g - Sắt ammoni xitrat : 0,50 g - Na2S2O3 : 0,50 g - Phenon đỏ : 0,025 g - Thạch : 15,00 g - Nước cất đủ : 1000 ml - pH = 7,4±0.2 (ở nhiệt độ 250C) Hoà tan thành phần, chia vào ống nghiệm khoảng ml Hấp nhiệt độ 121 0C 15 phút Trước môi trường đông, đặt ống nằm nghiêng cho phần thạch đứng cao khoảng - cm phần thạch nghiêng khoảng - cm * Hugh - Leifson Glucose - Pepton : 2,00 g - Cao nấm men : 0,50 g - NaCl : 30,00 g - Dextrose : 10,00 g - Tím bromcresol : 0,015 g - Thạch : 3,00 g - Nước cất đủ : 1000 ml Trang 125 - pH = 7,4±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Ðun nóng để hoà tan hoàn toàn thành phần chia vào ống nghiệm khoảng ml Hấp nhiệt độ 1210C 15 phút * O/F Glucose - Trypton : 2,00 g - Natri clorua (NaCl) : 5,00 g - K2HPO4 : 0,30 g - Xanh bromthymol : 0,03 g - Thạch : 2,00 g - Glucose : 10,00 g - Nước cất đủ: 1000ml - pH = 6,8±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Ðun sôi để hoà tan thành phần rót ml môi trường vào ống nghiệm Hấp nhiệt độ 1210C 15 phút * Canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 10 % NaCl (ký hiệu là: T1N0; T1N1; T1N3; T1N6; T1N8 T1N10) Hoà tan 10 g trypton lít nước cất Sau đó, thêm : 10, 30, 60, 80 100 g NaCl để canh thang trypton có giải nồng độ NaCl Sau đó, khuấy đều, chỉnh pH cho môi trường sau hấp có pH = 7,2 0,2 (ở nhiệt độ 25 0C) Tiến hành rót ml môi trường vào ống nghiệm Hấp nhiệt độ 121 0C 15 phút Các ống môi trường phải nút chặt trình bảo quản để tránh bốc nước làm thay đổi nồng độ muối * Môi trường thử decarboxylase (Môi trường bản) - Pepton : 5,00 g - Cao nấm men : 3,00 g - Glucose : 1,00 g - Tím bromcresol : 0,02 g - Nước cất đủ : 1000 ml - pH = 6,5±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Tuỳ theo loại môi trường cần pha, thêm g loại axitamin: L-lysin L-arginin L-ornithin vào môi trường Sau đó, rót ml môi trường vào ống nghiệm, nới lỏng nắp Hấp nhiệt độ 121 0C 10 phút Các ống phải nút chặt bảo quản sau cấy * Canh thang urê - urê : 20,00 g - Na2HPO4 : 9,50 g - K2HPO4 : 9,10 g - Cao nấm men : 0,10 g - Ðỏ phenol : 0,01 g - Nước cất đủ : 1000ml - pH = 6,8±0,1 (ở nhiệt độ 250C) Hoà tan thành phần Không hấp khử trùng, lọc vô trùng màng lọc có đường kính lỗ 0,45 ml Sau đó, rót khoảng 1,5 - 3,0 ml vào ống nghiệm đĩa petri sấy vô trùng * Canh thang bromcresol ( Môi trường bản) - Pepton : 10,00 g - NaCl : 5,00 g - Cao thịt bò : 3,00 g - Tím bromcresol : 0,04 g - Nước cất đủ : 1,00 lít - pH = 7,0±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Trang 126 Hoà tan thành phần trên, chỉnh pH cho môi trường sau pha đạt yêu cầu rót 2,5 ml vào ống nghiệm Hấp nhiệt độ 1210C 10 phút Pha loại dung dịch cacbonhydrat 50% (như: sacarose, lactose, D-cellobiose, arabinose, D-manniton D-mannose) nước cất lọc vô trùng Thêm 0,278±0,002 ml dung dịch vào ống nghiệm chứa 2,5 ml môi trường Môi trường cuối có nồng độ carbohydrat 5% * Thạch trypton muối 2% : TSA 2% NaCl - Trypton : 10,00 g - NaCl : 20,00 g - Thạch : 20,00 g - Nước cất đủ : 1000 ml - pH = 7,2±0,2 (ở nhiệt độ 250C) Ðun sôi để hoà tan thành phần Hấp nhiệt độ 121 0C 15 phút Sau đó, để nguội đến nhiệt độ khoảng 45 - 500C rót đĩa ống nghiệm * Thuốc thử Oxidasse Hoà tan 1,0 g N-tetrametyl-p-phenylenediamine.2HCl vào 100 ml nước cất vô trùng Ðựng dung dịch lọ sẫm màu bọc lọ giấy bạc Bảo quản dung dịch nhiệt độ - 80C, sử dụng vòng ngày * Dầu khoáng vô trùng Rót khoảng 20 - 50 ml dầu khoáng vào bình có nắp xoáy Hấp dầu nhiệt độ 121 0C 30 phút * Thuốc thử ONPG - Dung dịch đệm: Natri dihydro phosphat ngậm phân tử nước (NaH2PO4.H2O) : 6,90 g Nước cất : 45,00 ml Dung dịch hydroxit natri (NaOH) 30 % (w/v) : 3,00 ml Hoà tan NaH2PO4.H2O nước cất Thêm dung dịch NaOH 30% chỉnh pH = 7,0 (ở nhiệt độ 250C), thêm nước cất vừa đủ 50 ml Bảo quản dung dịch nhiệt độ - 80C - Dung dịch ONPG: ONPG (o-nitrophenyl-D-galactoside ) : 80,00 mg Nước cất 370C : 15,00 ml Dung dịch đệm : 5,00 ml Hoà tan ONPG nước cất nhiệt độ 37 0C Thêm dung dịch đệm vào lắc Bảo quản nhiệt độ - 80C Trước sử dụng phải làm ấm dung dịch đến nhiệt độ 370C * Các đĩa 10 mg 150 mg O/129 Vibriostat Cắt giấy lọc thành mảnh tròn đường kính khoảng - mm đặt vào đĩa petri, hấp khử trùng Chuẩn bị đĩa 150 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 - diisopropyl pteridin photphat (O/129) nước cất vô trùng theo tỷ lệ 15,0 mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch vào đĩa Chuẩn bị đĩa 10 mg O/129 Vibriostat: hoà tan 2,4 - diamino - 6,7 - diisopropyl pteridine phosphat (O/129) nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1,0mg/ml, nhỏ 10ml dung dịch vào đĩa Sấy khô đĩa, bảo quản tủ lạnh, tránh ánh sáng 2.3 Nguyên liệu khác - Mẫu thủy sản tươi (nghêu, sò, mực ) - Túi nilon dập mẫu - Dịch vi khuẩn Vibrio cholerar kiểm chứng - Cồn 96o Tiến hành thí nghiệm 3.1 Chuẩn bị mẫu Chuẩn bị mẫu thực phẩm Trang 127 Cân vô trùng 25 g mẫu thuỷ sản vào túi PE vô trùng Cắt mẫu lớn thành mảnh nhỏ thêm 225 ml nước pepton kiềm APW vào túi, nghiền máy nghiền đồng phút Mẫu kiểm tra thường ví dụ: mẫu nghêu Lấy phần thịt 10 - 12 nghêu (kể nước) cắt nhỏ, trộn Sau đó, nghiền máy nghiền đồng thể 50 g mẫu hàu 450 ml nước pepton kiềm APW phút Chia dung dịch mẫu vào bình vô trùng, bình chứa 250 ml pha loãng thành hai dãy cách trộn 10 ml dung dịch mẫu 90 ml nước pepton kiềm APW Ủ mẫu hai chế độ nhiệt 37,00C±1,00C 42,00C±0,20C 3.2 Tăng sinh a Ðối với mẫu thông thường Ủ bình chứa mẫu chuẩn bị (kể mẫu chứng dương mẫu chứng âm) nhiệt độ 37,00C±1,00C - Sau đó, phân lập, phần lại ủ tiếp 16 - 24 phân lập lại b Ðối với mẫu nghêu Ủ dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 nhiệt độ 37,00C±1,00C - 16 - 24 Ủ dãy pha loãng 10-1 đến 10-2 nhiệt độ 42,00C±0,20C - 3.3 Phân lập đọc kết đĩa Sau nuôi ủ chế độ nhiệt khoảng thời gian trê, không lắc, dùng khuyên cấy lấy dịch mẫu bề mặt cấy ria vào môi trường TCBS thạch Ủ đĩa TCBS thạch nhiệt độ 37,00C±1,00C 18 - 24 Trên môi trường TCBS thạch, khuẩn lạc V cholerae tròn, dẹt, bóng, màu vàng (do vi khuẩn lên men sacarose), đậm có viền mờ xung quanh Hình Khuẩn lạc đặc trưng Vbrio cholerae môi trường TCBS 3.4 Thử nghiệm sinh hoá kháng huyết a Thử nghiệm sinh hoá sơ Chọn khuẩn lạc nghi ngờ TCBS thạch để cấy chuyển sang môi trường không chọn lọc TSA 2% NaCl Ủ nhiệt độ 37,0 0C±1,0oC 18 - 24 Khuẩn lạc mọc môi trường sử dụng để thực thử nghiệm sinh hoá * Thử nghiệm môi trường TSI, KIA Cấy chuyển khuẩn lạc từ môi trường TSA vào ống thạch nghiêng TSI KIA Nới lỏng nắp ống để tạo điều kiện hiếu khí Nuôi ủ nhiệt độ 37,0 0C±1,00C 18 - 24 Trên môi trường TSI, V.cholerae làm phần thạch nghiêng thạch đứng môi trường chuyển màu vàng, không sinh không sinh H2S Trên môi trường KIA, phần thạch nghiêng có màu đỏ thạch đứng màu vàng, không sinh không sinh H2S * Thử nghiệm với canh thang trypton muối Trang 128 Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào ống canh thang muối trypton có giải nồng độ NaCl là: 0; 1; 3; 6; 10 % Nuôi ủ nhiệt độ 37,0±1,0 0C 18 - 24 giờ, ủ lại ống âm tính sau 18 - 24 V cholerae phát triển ống canh thang có nồng độ NaCl 0%, 3% làm đục môi trường * Thử nghiệm lên men - oxy hoá Cấy khuẩn lạc từ môi trường TSA vào ống môi trường bán lỏng Hugh-Leifson glucose O/F glucose Phủ khoảng - ml dầu khoáng vô trùng vào ống ủ ống nghiệm nhiệt độ 37,0±1,00C - ngày V cholerae lên men glucose làm môi trường Hugh - Leifson từ màu tím chuyển thành vàng môi trường O/F từ màu xanh thành vàng * Thử nghiệm oxidase Ðặt giấy lọc lên nắp đĩa petri, nhỏ khoảng - giọt thuốc thử oxidase Dùng que cấy bạch kim (platin) que cấy nhựa dùng lần; que gỗ vô trùng lấy khuẩn lạc từ môi trường TSA ria lên vị trí nhỏ thuốc thử oxidase V cholerae làm vết ria có màu tím thẫm xanh thẫm sau 10 giây Chú thích: không dùng que cấy crôm sắt thử nghiệm * Nhuộm gram V cholerae vi khuẩn gram âm, hình cong dạng dấu phẩy b Thử nghiệm sinh hoá khẳng định * Thử nghiệm phát triển nhiệt độ 420C Cấy vi khuẩn từ TSA vào ống canh thang trypton 1% NaCl Ủ nhiệt độ 42,0 C±0,20C 18 - 24 V cholerae phát triển nhiệt độ 420C làm môi trường bị đục * Thử nghiệm cacbonhydrat Cấy vi khuẩn từ TSA vào ống canh thang bromcresol có chứa lọai cacbohydrat: sacarose, lactose, D-cellobiose, arabinose, D-manniton, D-mannose Ủ ống canh thang nhiệt độ 37,00C±1,00C Phản ứng dương tính môi trường có màu vàng, âm tính môi trường giữ nguyên màu đỏ V cholerae cho phản ứng sacarose, manniton, mannose dương tính lactose, cellobiose, arabinose âm tính * Thử nghiệm decacboxylase/dehydrolase Cấy vi khuẩn từ môi trường TSA vào ống canh thang ornithin, lysin, arginin ống đối chứng axit amin Mỗi ống phủ - ml dầu khoáng vô trùng Ủ ống nhiệt độ 37,00C±1,0 0C 18 - 24 Phản ứng dương tính môi trường giữ nguyên màu tím đậm Phản ứng âm tính toàn ống canh thang có màu vàng ổn định ngày (tương tự màu ống đối chứng) V cholerae cho phản ứng lysin ornithin dương tính, phản ứng arginin âm tính * Thử nghiệm urê Cấy vi khuẩn từ TSA vào canh thang urê, ủ nhiệt độ 37,0 0C±1,00C 18 - 24 V cholerae cho phản ứng âm tính môi trường giữ nguyên màu tím hồng * Thử nghiệm ONPG Lấy vi khuẩn phát triển môi trường TSI từ môi trường không chọn lọc khác có chứa 1,0% lactose vào ống nghiệm có chứa 0,25 ml nước muối sinh lý, hoà tan Thêm giọt toluen vào ống lắc đều, để yên phút Thêm 0,25 ml dung dịch ONPG ủ ống nghiệm nhiệt độ 37,00C±1,00C Kiểm tra ống định kỳ 24 V cholerae cho phản ứng ONPG dương tính dung dịch có màu vàng Có thể dùng đĩa ONPG thay cho thuốc thử ONPG Hoà tan khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 0,2 ml nước muối sinh lý Ðặt đĩa ONPG vào đáy ống ủ ấm đọc kết * Thử nghiệm tính nhạy cảm với hợp chất ức chế phẩy khuẩn O/129 Vibriostat Dàn vi khuẩn lên đĩa thạch TSA 2% NaCl Ðặt đĩa O/129 có chứa 10 mg 150mg Vibriostat vào vị trí khác Sau đó, lật ngược đĩa ủ nhiệt độ 37,0±1,0 0C Trang 129 18 - 24 V cholerae không phát triển bị ức chế Vibriostat tạo vòng vô khuẩn xung quanh đĩa O/129 * Thử nghiệm kháng huyết Nhỏ giọt kháng huyết lên lam kính giọt nước muối sinh lý lên vị trí khác lam Dùng que cấy vô trùng khác chuyển vi khuẩn từ TSA lên hai giọt dung dịch phân tán vi khuẩn Kết luận dương tính có tượng ngưng kết giọt có kháng huyết tượng ngưng kết giọt nước muối Sử dụng chủng chứng dương chủng chứng âm trình thực Tóm tắt thử nghiệm kháng huyết V cholerae theo Bảng Bảng Bảng Phân biệt V cholerae O1 V cholerae non - O1 Kháng nguyên Kháng huyết Dung dịch muối đa giá O1 sinh lý Chủng có kết sinh hoá + tương tự V cholerae Chủng có kết sinh hoá tương tự V cholerae Chủng có kết sinh hoá + + tương tự V cholerae Bảng Phân biệt kiểu huyết chủng V.cholerae O1 Kháng nguyên Kháng huyết Kháng huyết Dung dịch Inaba Ogawa muối sinh lý V cholerae O1 + V cholerae O1 + V cholerae O1 + + V cholerae O1 - Kết luận V.cholerae O1 V.cholerae non- O1 Chủng không đặc hiệu với kháng nguyên O nhóm Kết luận Chủng Inaba Chủng Ogawa Chủng Hikojima Chủng không đặc hiệu 3.5 Ðọc kết Phát không phát V cholerae 25 g mẫu Những điểm cần lưu ý - Môi trường tăng phân lập Vibrio TCBS có số thành phần biến tính nhiệt độ cao, không hấp tiệt trùng - Chủng Vibrio cholerae (gây bệnh tả) loại vi sinh vật nguy hiểm, cẩn thận trình thực hành Mang trang găng tay để tránh bị xâm nhiễm Các dung dịch vi sinh vật, dụng cụ môi trường nuôi cấy cần hấp tiệt trùng cẩn thận sau thí nghiệm - Dịch pepton kiềm (APW) tăng sinh chọn lọc Vibrio, sau 24 có mùi khó chịu, hấp tiệt trùng để loại bỏ, cần bọc kỹ túi nilon - Để kết phân tích xác, nên sử dụng môi trường tổng hợp dạng đông khô cho tất bước thử nghiệm Báo cáo thực tập - Trình bày đặc tính sinh lý gây bệnh Vibrio cholerae? - Trình bày quy trình phân tích Vibrio cholerae thủy sản? - Giải thích chế thử nghiệm sinh hóa kháng huyết sử dụng trình phân tích xác định Vibrio cholerae? Trang 130 BÀI 24 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH CLOSTRIDIUM PERFRINGENS TRONG THỰC PHẨM Nguyên tắc Vi khuẩn Clostridium perfringens thuộc nhóm vi khuẩn Gram dương Đa số sống kị khí, ưa nhiệt có khả sinh bào tử chịu nhiệt Clostridium perfringens thủy giải mạnh protein chuyển hóa acid amin tạo mùi khó chịu Clostridium perfringens sinh độc tố thực phẩm gây bệnh hoại tử vết thương Clostridium perfringens phân tích cách sử dụng môi trường có chứa sắt sulphite Khuẩn lạc mọc môi trường có màu đen phản ứng S2- Fe2+ 2 Dụng cụ, môi trường hóa chất 2.1 Dụng cụ Tên dụng cụ, thiết bị STT Đơn vị tính Số lượng Ghi nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Cái Ống nghiệm Ф18 Cái 15 Bình tam giác 250ml Cái Cốc 100ml Cái Bình tia Cái Pipette 1ml Cái Pipette 10ml Cái Micropipette 100-1000μl Cái Đầu týp 1000μl Cái STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi Nồi hấp cao áp Cái Tủ cấy vô trùng Cái Tủ sấy Cái Máy dập mẫu Cái Bình ủ kỵ khí Cái Bếp đun cách thủy Cái Bút đếm khuẩn lạc Cái 2.2 Môi trường hoá chất * Môi trường Sulphite polymyxin sulphadiazin (SPS agar) Được sử dụng để định lượng Clostridium perfringens - Peptone :15g - Yeast extract :10g - Ferric citrate :0,5g - Sodium sulphite :0,5g - Polymycin B sulphate :0,01g - Sodium sulfadiazine :0,12g - Agar :13,9g - Nước cất đủ :1000ml Phân phối vào ống nghiệm Hấp 15 phút 121oC pH cuối = 7,0±0,2 * Dung dịch Buffered Peptone Water (BPW) Được sử dụng để pha loãng vi sinh vật - Peptone :10g - NaCl :5g - Na2HPO4.9H2O :9g - KH2PO4 :1,5g - Nước cất đủ :1000ml Trang 131 Phân phối 9ml vào ống nghiệm 90ml vào erlen Hấp khử trùng 121 oC, 15 phút pH cuối = 7,0±0,2 * Môi trường Wilson Blair cải tiến (Sulfite Iron Wilson Blair agar) Được sử dụng để định lượng Clostridium perfringens - Glucose :20 g - Peptone :10g - NaCl :5g - Cao thịt :5g - Agar :20g - Nước cất đủ :1000ml Đun sôi, phân phối vào ống nghiệm hộp petri Hấp 121 oC pH cuối = 7,0±0,2 Để tủ lạnh Không dùng trước 24 sau ngày * Dung dịch phèn sắt 5% (pha trước dùng) * Dung dịch Na2SO3 5% (pha trước dùng) 2.3 Nguyên liệu khác - Mẫu thủy sản tươi (nghêu, sò, mực ) - Túi nilon dập mẫu - Dịch vi khuẩn Clostridium perfringens kiểm chứng - Cồn 96o - Túi kỵ khí Gaspak Tiến hành thí nghiệm * Phương pháp SPS 3.1 Cách ủ mẫu - Mẫu đưa phòng thí nghiệm, mở cho vào khay vô trùng Dùng kéo kẹp vô trùng lấy đại diện 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng Mẫu đồng với 225ml dung dịch BPW máy dập mẫu để có dung dịch pha loãng 10-1 - Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch pha loãng 10 -1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch BPW để dung dịch pha loãng 10 -2 Tùy theo mức độ nhiễm bẩn mẫu mà tiến hành pha loãng nồng độ cao 3.2 Cấy ủ mẫu - Lấy 1ml mẫu pha loãng, đồng cho vào đĩa petri - Cho 15 - 20 ml thạch SPS vào đĩa, đảo đĩa, trộn Để đông lại - Lật úp đĩa, để bình kỵ khí Ủ 35 - 370C 24h 3.3 Đọc kết - Đếm tất khuẩn lạc đặc trưng Clostridium perfringens (tròn, đen, có đường kính 3mm) 3.5 Tính toán kết Số khuẩn lạc 1g mẫu trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ có ống nghiệm nuôi cấy (cùng nồng độ) nhân với hệ số pha loãng tương ứng chia cho 10 * Phương pháp Wison Blair cải tiến 3.6 Chuẩn bị mẫu phân tích phòng thí nghiệm - Mẫu đưa phòng thí nghiệm, mở cho vào khay vô trùng Dùng kéo kẹp vô trùng lấy đại diện 25g mẫu cho vào bao PE vô trùng Mẫu đồng với 225ml dung dịch BPW máy dập mẫu để có dung dịch pha loãng 10-1 - Dùng pipet vô trùng hút 1ml dung dịch pha loãng 10 -1 sang ống nghiệm chứa 9ml dung dịch BPW để dung dịch pha loãng 10 -2 Tùy theo mức độ nhiễm bẩn mẫu mà tiến hành pha loãng nồng độ cao 3.7 Cấy ủ mẫu - Chọn nồng độ pha loãng thích hợp Cho 10ml dung dịch pha loãng (mỗi nồng độ ống) vào ống nghiệm có chứa môi trường Wilson Blair cải tiến làm nguội 45 oC Cho thêm 2ml dung dịch Na2SO3 giọt phèn sắt 5% Tiếp tục làm sau: - Lắc Trang 132 - Đun cách thủy 75oC, 15 phút - Làm đông nhanh - Ủ 37oC bình kỵ khí thời gian 18 - 24 3.8 Đọc kết Đếm tất khuẩn lạc đặc trưng Clostridium perfringens (tròn, đen, có đường kính 3mm) 3.9 Tính toán kết Số khuẩn lạc 1g mẫu trung bình cộng số khuẩn lạc nghi ngờ có ống nghiệm nuôi cấy (cùng nồng độ) nhân với hệ số pha loãng tương ứng chia cho 10 Những điểm cần lưu ý - Phèn sắt Na thiosulfat cần pha riêng rẽ bổ sung sau hấp tiệt trùng - Chủng Clostridium perfringens loại vi sinh vật nguy hiểm, cẩn thận trình thực hành Mang trang găng tay để tránh bị xâm nhiễm Các dung dịch vi sinh vật, dụng cụ môi trường nuôi cấy cần hấp tiệt trùng cẩn thận sau thí nghiệm - Để kết phân tích xác, nên sử dụng môi trường tổng hợp dạng đông khô cho tất bước thử nghiệm Báo cáo thực tập - Trình bày đặc tính sinh lý gây bệnh Clostridium perfringens? - Trình bày quy trình phân tích Clostridium perfringens thực phẩm? - Giải thích chế thử nghiệm sinh hóa sử dụng trình phân tích xác định Clostridium perfringens? Quy trình phân tích Clostridium perfringens thực phẩm: Đồng mẫu, xử lý mẫu 80oC Cấy đĩa với môi trường SPS 45oC, lắc Bổ sung thêm môi trường SPS Ủ 37oC bình kỵ khí, 24 – 48 Đếm khuẩn lạc màu đen đường kính khoảng 3mm Trang 133 BÀI 25 PHÂN TÍCH VI SINH VẬT TRONG THỰC PHẨM BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) Nguyên tắc Các phương pháp truyền thống phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm bao gồm bước nuôi cấy môi trường chọn lọc hàng loạt thử nghiệm hoá sinh để khẳng định diện loài gây bệnh định, thường kéo dài vài ngày đến vài tuần Trong năm vừa qua, phương pháp nhanh hơn, chuyên biệt nhằm phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm dựa nguyên tắc sinh học phân tử miễn dịch học phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA…đã thiết lập PCR (Polymerase Chain Reaction) kỹ thuật ứng dụng phổ biến khắc phục nhược điểm phương pháp truyền thống nhờ khả phát nhanh đặc hiệu mầm bệnh Các nghiên cứu giới tập trung vào khẳng định khả sử dụng PCR phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vệ sinh thực phẩm PCR kỹ thuật nhằm tạo lượng lớn DNA mục tiêu ống nghiệm dựa vào chu kỳ nhiệt Kỹ thuật nhà khoa học người Mỹ Kary Mullis phát minh vào năm 1985 Sự phân tích sản phẩm PCR điện di cho phép phát vi sinh vật mục tiêu dự so sánh với trình tự DNA đặc trưng vi sinh vật chuẩn Xét nghiệm kỹ thuật PCR thường có kết độ xác cao, tính đặc hiệu lớn Tuy nhiên kết tùy thuộc trình độ kỹ thuật viên, phương tiện máy móc làm việc việc quản lý chất lượng 2 Dụng cụ, môi trường hóa chất 2.1 Dụng cụ Tên dụng cụ, thiết bị STT Đơn vị tính Số lượng Ghi nhóm (3 sinh viên) Giá ống nghiệm Cái Ống nghiệm Ф18 Cái 15 Bình tam giác 250ml Cái Cốc 100ml Cái Bình tia Cái Pipette 1ml Cái Pipette 10ml Cái Micropipette 100-1000μl Cái Đầu týp 1000μl Cái 10 Ống Eppendorf 0,2 0,5 ml; 1,5 10 Cái ml chuyên dùng cho PCR STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi Nồi hấp cao áp Cái Tủ cấy vô trùng Cái Tủ sấy Cái Máy dập mẫu Cái Bình ủ kỵ khí Cái Bếp đun cách thủy Cái Bút đếm khuẩn lạc Cái Máy PCR Cái Máy ly tâm dùng cho ống Cái eppendorf 1,5 ml 10 Máy vortex Cái 11 Thiết bị điện di ngang Cái nguồn điện di có điện hoạt Trang 134 Tên dụng cụ, thiết bị Đơn vị tính Số lượng Ghi nhóm (3 sinh viên) động từ 80 đế 150 volt Hộp đèn soi UV có kính lọc 12 Cái 302mm 13 Bộ chụp ảnh đèn UV Cái 2.2 Môi trường, hóa chất a Hóa chất * Mồi: Gồm hai mồi invA1 invA2 thiết lập cách 520 bp gen invA có vai trò trình xâm nhiễm Salmonella vào thành ruột động vật người Trình tự hai mồi sau : invA1 : 5' - TTGTTACGGCTATTTTGACCA -3' invA2 : 5' - CTGACTGCTACCTTGGCTGATG - 3' Nồng độ mồi sử dụng phân tích pha loãng thành pM đệm TE Ðệm TE có thành phần sau : 10 mM Tris-HCl (pH = 8), mM EDTA * Hỗn hợp dùng khuếch đại PCR 1,1x - Taq polymerase: 0,025 U/ml (1,25 U/50 ml) - Tris - HCl (pH = 8,8 nhiệt độ 25oC): 75 mM - Sunphat amon (NH4)2ư SO4: 20 nM - Tween 20: 0,01% (v/v) - dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP): 200 mM (mỗi loại) - Magiê clorua (MgCl2) 1,5 mM - Tất thành phần pha chế nước cất lần bảo quản nhiệt độ 4oC tháng Có thể bảo quản nhiệt độ - 20 oC năm Không nên rã đông tái đông dung dịch pha chế nhiều lần * Thang ADN Nên sử dụng thang đo phù hợp ước lượng đoạn khuếch đại 520 bp Có thể sử dụng sản phẩm khuếch đại có kích thước 520 bp biết trước làm thang đo phương pháp * Agarose Sử dụng kỹ thuật loại dùng để điện di ADN có kích thước nhỏ 1000 bp * Ðệm điện di TAE 1x - Tris: 4,84 g - Na2EDTA 0,5M, pH = 8,0: ml - Axit axetic băng: 1,14 ml - Nước cất cho đủ: 1000 ml Nên pha chế thành dung dịch 10x (đậm đặc 10 lần), sử dụng pha loãng với nước thành dung dịch 1x * Ðệm tải mẫu 6x - Glyxerol: 30 % - Xanh bromphenon: 0,25 % - Tris: 200 mM - Na2EDTA: 20 mM Các thành phần pha nước cất, bảo quản nhiệt độ 4oC * Thuốc nhuộm AND: dung dịch etyl bromua nồng độ 10 mg/ml b Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Dung dịch đệm pepton - Pepton (C5H10O5): 10,0g - Natri clorua (NaCl): 5,0g - Ðinatri hyđro phôt phat (Na2HPO4): 3,6 g - Kali đihyđro phôt phat (KH2PO4): 1,5g STT Trang 135 - Nước cất: 1000 ml Hoà tan thành phần nước cất, đun tan, phân phối vào bình chứa phù hợp Hấp khử trùng nhiệt độ 121oC 15 phú pH sau khử trùng 7,0 0,2 25oC 2.3 Nguyên liệu khác Mẫu thức ăn đường phố, thịt gà tươi sống, hải sản, trứng sản phẩm trứng, rau xà lách, thức ăn gia súc nhiễm vi sinh vật tự nhiên Tiến hành thí nghiệm 3.1 Lấy mẫu Cân xác 25 g mẫu (hoặc khối lượng xác tuỳ theo yêu cầu) cho vào bình tam giác bao PE vô trùng 3.2 Tăng sinh Nhằm làm tăng số lượng Salmonella mẫu, tế bào bị suy yếu hay tổn thương phục hồi phát triển Giai đoạn tiến hành môi trường không chọn lọc nguyên tắc phần khối lượng mẫu bổ sung phần khối lượng môi trường tăng sinh Nếu lấy 25 g mẫu, phải bổ sung 225 g môi trường tăng sinh dung dịch pepton đệm Ủ mẫu có môi trường tăng sinh nhiệt độ 37,0oC 1,0oC khoảng 18 giờ 3.3 Xử lý mẫu giải phóng ADN Giai đoạn nhằm thu nhận sinh khối sau tăng sinh, rửa môi trường sau nuôi cấy, phá vỡ tế bào để giải phóng ADN Cách xử lý sau: - Lắc canh khuẩn tăng sinh Hút 0,5 ml vào ống eppendorf tích 1,5 ml, ly tâm với tốc độ 10 000 vòng/phút phút loại bỏ phần môi trường lỏng bên Rửa sinh khối bên với nước cất vô trùng tiếp tục ly tâm với chế độ để loại bỏ phần nước - Huyền phù sinh khối ống với 0,5 ml nước cất vô trùng Ðun sôi cách thuỷ 10 phút Ly tâm huyền dịch sau đun với tốc độ 10 000 vòng/phút phút để lắng mảnh vỡ tế bào xuống đáy Phần dịch bên coi khuôn ADN để tiến hành phản ứng khuếch đại 3.4 Khuếch đại Giai đoạn nhằm làm tăng số lượng đoạn ADN đích máy luân nhiệt (thermocycler) hai mồi đặc trưng Quá trình khuếch đại tiến hành khoảng 30 chu kỳ - Chuẩn bị ống khuếch đại Hút 45 ml hỗn hợp khuếch đại PCR 1,1 x cho vào ống nghiệm PCR tích 0,2 0,5 ml, thêm vào ml mồi invA1 invA2 có nồng độ pM ml mẫu khuôn ADN Tổng thể tích ống khuếch đại 50 ml Ðối chứng dương: thay dịch khuôn ADN mẫu dịch ADN Salmonella chuẩn biết Ðối chứng âm: thay dịch khuôn ADN mẫu nước cất vô trùng - Chương trình khuếch đại Các ống khuếch đại đặt vào máy luân nhiệt Chương trình khuếch đại sau: trì nhiệt độ 95oC phút để làm biến tính hoàn toàn sợi ADN mẫu Tiếp theo 35 chu kỳ, chu kỳ có bước sau: 95 oC/60 giây; 54oC/45 giây 72oC/60 giây Sau kết thúc 35 chu kỳ, mẫu giữ nhiệt độ 72 oC 10 phút, sau giữ ổn định nhiệt độ 20oC điện di 3.5 Ðiện di sản phẩm khuếch đại - Chuẩn bị gel điện di agarose 1% Gel agarose % pha đệm TAE 1x đun chảy hoàn toàn đổ vào khay điện di có sẵn lược để tạo giếng Gel điện di phải có độ dày khoảng - mm Gel sau chuẩn bị ngâm chìm hoàn toàn đệm TAE - Chuẩn bị dịch điện di Mẫu sau khuếch đại nhuộm với 10 ml đệm tải mẫu 6x trộn thật Trang 136 - Ðiện di Một giếng gel điện di sử dụng cho thang ADN chuẩn hay mẫu đối chứng dương Nạp 10 ml dịch điện di chuẩn bị vào gel agarose Tiến hành điện di 60 phút hiệu điện 100 vôn 3.6 Nhuộm ADN, quan sát sản phẩm khuếch đại - Chuẩn bị dung dịch nhuộm mẫu Pha dung dịch nhuộm ADN sau: cho 0,2 ml etyl bromua 10 mg/ml vào 0,5 lít nước, pha vào khay chứa có miệng rộng gel điện di - Nhuộm gel Ngâm gel điện di vào dung dịch nhuộm 10 phút Rửa gel nước khoảng - phút để loại bỏ phần etyl bromua dư - Quan sát, chụp hình Cho gel nhuộm lên hộp đèn soi UV, đóng kính bảo vệ, bật đèn quan sát vạch sáng đỏ ADN xuất gel Sau đó, chụp hình để lưu trữ kết 3.7 Ðọc giải thích kết Kết phân tích xem xét kết luận mẫu đối chứng dương tính có sản phẩm khuếch đại ADN với kích tước 520 bp mẫu đối chứng âm sản phẩm Mẫu kết luạn dương tính Salmonella có sản phẩm khuếch đại 520 bp gel Mẫu kết luận âm tính sản phẩm khuếch đại, hay sản phẩm khuếch đại có kích thước khác 520 bp Những điểm cần lưu ý - Mang trang găng tay cao su để tránh làm tạp nhiễm sản phẩm PCR - Không điều chỉnh khoảng thể tích cho phép hút sử dụng micropipette - Tuân thủ bước thao tác chuẩn bị phản ứng PCR vận hành máy luân nhiệt PCR - Phải dùng kính bảo vệ mắt quan sát sản phẩm điện di gel agarose đèn UV Báo cáo thực tập - Trình bày nguyên tắc phương pháp PCR xác định vi sinh vật thực phẩm? - Trình bày vai trò mồi xuôi, ngược phản ứng PCR? - Giải thích phản ứng PCR nên tiến hành khoảng 35 chu kỳ? - Trình bày nguyên tắc phương pháp đọc điện di sản phẩm PCR? - Trình bày kết xác định Salmonella spp mẫu thực phẩm ban đầu phương pháp PCR? Trang 137 TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Duy Linh, Trần Thị Hường, Trịnh Thị Hồng, Lê Duy Thắng 2010 Thực tập vi sinh sở NXB Đại học Quốc Gia Tp Hồ Chí Minh Trần Văn Minh, Dương Nhật Linh 2008 Thực tập vi sinh sở Tài liệu lưu hành nội Trường Đại học Mở Tp Hồ Chí Minh Lê Xuân Phương 2004 Thí nghiệm vi sinh vật học NXB Đại học Đà Nẵng Trần Linh Thước, Nguyễn Đức Hoàng, Phạm Thị Phượng Trang, Phạm Thi Hồng Tươi 2001 Thực tập vi sinh vật học NXB Đại học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh Trần Linh Thước.2002 Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm NXB Giáo dục Benson 2001 Microbiological Applications Lab Manual, eighth edition The McGraw-Hill companies Harley Prescott 2002 Laboratory Exercises in Microbiology, fifth edition The McGrawHill companies N.F Lightfoot, E.A Maier 2003 Microbiological Analysis of Food and Water: Guidelines for Quality Assurance Elsevier Science Trang 138 [...]... với nhau trong quá trình nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật * Mục đích của vi c nuôi cấy - Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu và vật phẩm cần nghiên cứu - Tiến hành vi c nhân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng - Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết - Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển của từng loại vi sinh vật * Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật - Mọi... cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa? Tại sao? Trang 14 BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT 1 Nguyên tắc Quá trình nuôi cấy vi sinh vật gồm 2 khâu: cấy và nuôi Cấy là những thao tác chuyển vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển của chúng Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động và phát triển của vi sinh vật Hai... Hình Nguyên tắc quang học của kính hiển vi Chức năng của kính hiển vi quang học dùng để quan sát tế bào vi sinh vật, ký sinh trùng, tế bào động vật, thực vật 1.2 Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học Kính hiển vi quang học được cấu tạo gồm 2 phần: - Hệ thống cơ học: giá kính gồm chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính, ổ gắn Trang 21 và xoay vật kính, bàn kính, thanh trượt... quan sát 5 Báo cáo thực tập - Trình bày cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi? - Vẽ hình các tiêu bản vi sinh vật quan sát? Chú thích hình vẽ? Trang 27 BÀI 5 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VI SINH VẬT 1 Nguyên tắc Nhuộm màu là quá trình làm cho tế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật có màu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm Nhuộm màu vi sinh vật nhằm mục đích: - Giúp dễ dàng hóa vi c... cấy truyền vi khuẩn, nấm men, nấm mốc? - Nêu các điều kiện nuôi ủ nấm men và vi khuẩn sau khi gieo cấy? - Đĩa petri sau khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa mặt thạch? Giải thích? - Khi cấy truyền vi sinh vật trên ống thạch nghiêng, giải thích tại sao phải ria que cấy ngược từ đáy ống nghiệm lên phía trên? Trang 20 BÀI 4 PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIỂN VI QUANG HỌC 1 Nguyên tắc 1.1... cấy trong bình hút chân không, nuôi trong ống nghiệm đặc biệt, sau khi rút hết không khí và hàn kín lại, đun sôi môi trường trong một thời gian để loại hết O2 Để nguội 450C Dùng pipet cấy vi sinh vật vào đáy ống nghệm Làm nguội nhanh rồi đổ vaselin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với oxy 3.4 Quan sát vi sinh vật sau khi nuôi cấy Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật. .. Trang 15 2.3 Chủng giống vi sinh vật - Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea - Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini - Vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis 2.4 Nguyên liệu khác - Giấy lọc - Bông không thấm - Bông thấm nước 3 Tiến hành thí nghiệm 3.1 Cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng Cấy truyền là phương pháp lấy vi sinh vật từ ống nghiệm này sang một ống nghiệm. .. giống vi sinh vật dùng quan sát - Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea - Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini Trang 24 - Vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis 2.4 Nguyên liệu khác - Giấy lọc - Bông không thấm - Bông thấm nước 3 Tiến hành thí nghiệm 3.1 Làm tiêu bản vi sinh vật sống a Làm tiêu bản giọt ép - Dùng que cấy hoặc ống hút chuyển giống vi sinh vật từ ống nghiệm. .. màu vi sinh vật nhằm mục đích: - Giúp dễ dàng hóa vi c quan sát hình dạng tế bào, các thành phần cấu trúc của tế bào vi sinh vật trên kính hiển vi - Giúp phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau do vi c ăn màu khác nhau đối với các loại thuốc nhuộm tạo điều kiện cho vi c phân loại, định dang vi sinh vật (nhuộm màu Gram) Tùy theo từng loại vi sinh vật, tuỳ theo từng cấu trúc tế bào muốn nhuộm, ta có nhiều... cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính (giữa lổ mâm kính) Chú ý: Có thể dùng điểm sáng của hộp tụ quang để làm điểm chuẩn khi điều chỉnh mẫu vật về điểm trục kính, nếu mẫu vật nhỏ quá * Bước 3: Quan sát Nguyên tắc bắt buộc khi quan sát là phải quan sát được ở vật kính có độ phóng đại nhỏ, rồi mới chuyển sang quan sát ở vật kính có độ phóng đại lớn hơn kề nó Xem tiêu bản ở vật kính X10 - Hạ tụ quang kính