NHỮNG QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

Máy lắc shaker: Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách lắc các bình nuôi cấy theo các chiều khác nhau lắc vòng và lắc ngang một cách đều đặn đểtăng lượng oxy hòa tan

NHỮNG QUY TẮC AN TOÀN TRONG PHÒNG THÍ NGHIỆM

VI SINH VẬT

Thao tác an toàn là yêu cầu cực kỳ quan trọng đối với thí nghiệm vi sinh vật Vi sinhvật có kích thước nhỏ bé mà mắt thường không nhìn thấy được Trong quá trình làm thínghiệm, chúng ta thường thao tác với số lượng rất lớn và đậm đặc tế bào vi sinh vật Bên cạnhnhững giống, loài vi sinh vật có ích là những giống, loài có khả năng gây bệnh và có hại đốivới sức khỏe con người Mặt khác, trong quá trình thí nghiệm chúng ta cũng phải sử dụngnhiều loại hóa chất, trong đó có những hóa chất có độc tính Chính vì thế, người làm thínghiệm trong phòng thí nghiệm vi sinh vật cần tuân thủ các qui tắc cơ bản sau đây:

1 Những qui định chung:

- Những người không có nhiệm vụ không được vào phòng thí nghiệm

- Khi vào phòng thí nghiệm phải mặc áo Blouse (cài khuy kín), cột tóc gọn gàng

- Không nói chuyện ồn ào, giữ gìn trật tự Không ăn uống, hút thuốc trong phòng kiểmnghiệm

- Mang khẩu trang, găng tay khi thao tác với vi sinh vật và hóa chất

- Trên bàn thí nghiệm chỉ để vật dụng thí nghiệm, số ghi chép, giấy ghi chép Tất cảcác vật dụng cá nhân, áo khoác, túi xách, sách vở,… phải để đúng nơi qui định

- Trước và sau khi kết thúc thí nghiệm, phải sát trùng mặt bàn bằng các hóa chất sáttrùng cồn 70% hoặc dung dịch diệt khuẩn khác (lysol 5%, amphyl 10%, chlorox 10%) đãchuẩn bị sẵn và lau khô bằng giấy vệ sinh

- Cần ghi chú tên chủng, ngày tháng thí nghiệm, người là thí nghiệm lên tất cả các hộppetri, ống nghiệm,…

- Tuyệt đối không để canh trường hay vật phẩm có vi sinh vật dấy lên quần áo, sách

vở và dụng cụ cá nhân Đồng thời cũng phải chú ý bảo vệ da và quần áo khỏi bị dính hóa chất

và thuốc nhuộm

- Cẩn thận khi thao tác với đèn cồn hoặc đèn Bunsen Tắt ngọn lửa khi chưa có nhucầu sử dụng hoặc ngay sau khi thực hiện xong mỗi thao tác Tuyệt đối không dùng đèn cồn đểmồi lửa đèn cồn

- Sử dụng quả bóp cao su khi thao tác ống hút định lượng (pipette), Tuyệt đối khônghút bằng miệng

- Không tự ý sử dụng trang thiết bị, dụng cụ trong phòng thí nghiệm khi chưa đượchướng dẫn cụ thể Sử dụng theo hướng dẫn, hết sức thận trọng, tránh làm đổ vỡ và hư hỏng

- Tất cả các vật liệu bị nhiễm bẩn, môi trường chứa hoặc nhiễm vi sinh vật cần phảiđược khử trùng trước khi vứt bỏ hoặc sử dụng lại Các dụng cụ, bình chứa nhiễm vi sinh vậtcần được ngâm vào dung dịch diệt khuẩn (nước javel) trước khi rửa và tái sử dụng

- Kết thúc thí nghiệm phải vệ sinh các thiết bị, dụng cụ đã sử dụng theo đúng qui trình

và sắp xếp vào đúng nơi qui định

- Rửa tay sạch sẽ trước khi rời phòng thí nghiệm

- Tất cả các trường hợp tai nạn phải báo cáo cho cán bộ hướng dẫn thí nghiệm để kịpthời và xử lý

2 Một số lưu ý với sinh viên nhằm đạt kết quả tốt trong thực hành vi sinh vật

a Trước khi thực hành

- Cần đọc bài trước nội dung toàn bài để hình dung được khối lượng công việc sẽ làm

- Hiểu rõ nguyên tắc, mục đích của các thí nghiệm

- Đọc cẩn thận cách tiến hành thí nghiệm

b Trong giờ thực hành:

- Ghi chú cẩn thận những căn dặn của giảng viên về các thao tác và qui trình thựchành

- Thực hiện thí nghiệm theo đúng hướng dẫn của giảng viên

- Trong quá trình thí nghiệm có những thao tác, công đoạn không rõ cần hỏi lại giảngviên hướng dẫn

- Ghi chép cẩn thận các chú ý quan trọng của thí nghiệm và kết quả của mỗi thínghiệm

c Kết thúc thực hành:

- Làm báo cáo thực hành theo các yêu cầu trong mục 5 của từng bài thí nghiệm vàtheo yêu cầu của giảng viên

BÀI 1 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT

VÀ CÁC PHƯƠNG PHÁP TIỆT TRÙNG VI SINH VẬT

1 Thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật học

1.1.Tủ sấy (vacuum oven): to từ 60oC – 200oC, dùng để sấy khô, khử trùng các loạidụng cụ chịu được sức nóng khô, chủ yếu là dụng cụ thủy tinh, kim loại Tùy vào đối tượngcần khử khuẩn mà sấy ở chế độ to và thời gian khác nhau, thường sấy ở 160oC/2 giờ, hoặc

180oC/30 phút

Hình Tủ sấy

1.2.Tủ ấm (incubator or etuve): to từ 20oC – 60oC, có chế độ ổn định nhiệt độ, được

sử dụng để nuôi cấy vi sinh vật tại nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển củachúng Tùy vào đối tượng nuôi cấy mà ủ ở to khác nhau để vi sinh vật có thể phát triển tốt Vídụ: Coliform 30oC/24h – 48h, E coli thích hợp ở 44oC/24h – 48h

1.3 Tủ lạnh hay tủ mát (freezer): dùng bảo quản môi trường đã pha chế, giống vi

khuẩn, các chế phẩm sinh học (vaccin, huyết thanh, đĩa giấy kháng sinh,…), hóa chất, thuốcthử dễ phân hủy ở nhiệt độ thường

1.4 Nồi hấp ướt (Autoclave): Thiết bị này cấp nhiệt bằng hơi nước ở áp suất cao (hơi

nước bão hòa ở áp suất cao), được sử dụng để hấp khủ trùng môi trường, một số nguyên liệu

và dụng cụ thí nghiệm Tùy đối tượng mà sử dụng ở chế độ nhiệt độ và áp suất thích hợp,thường dùng ở 121oC/1 atm/ 15 phút Hay 127oC/1.5 atm/30 phút với môi trường đất, 117oC/0.8 atm/15 phút với môi trường chứa nhiều đường, môi trường sữa……

Thể tích môi trường nuôi

Chỉ số áp kế của

nồi áp suất (atm) 0,0 0,2 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,5 2,0

To sôi nước (oC) 100 105 110 112 114 116 117 119 121 127 134

To sôi nước (oF) 212 221 230 234 237 241 243 246 250 261 273

Hình Nồi hấp cao áp (Autoclave)

1.5 Cân phân tích điện tử (analytical balance): cân trọng lượng từ 100µg – 200g.

Độ chính xác 10-4 g Cân kỹ thuật (technical balance): độ chính xác 10-2g Dùng cân hóa chất,môi trường

Hình Cân phân tích (A) và cân kỹ thuật (B)

1.6 Tủ cấy vô khuẩn có đèn cực tím (UV) (flux laminar ): Có không gian vô trùng

được sử dụng để thao tác với vi sinh vật nhờ hệ thống đèn tử ngoại và bộ phận thổi khí vôtrùng

1.7 Máy ly tâm (centrifuge): Dùng tách các chất ở các pha rắn-lỏng ra khỏi nhau như

Hình Tủ cấy vô trùng

tách sinh khối tế bào ra khỏi môi trường nuôi cấy, tách hồng cầu, enzyme,…

Hình Máy ly tâm

1.8 Máy lắc (shaker): Thiết bị dùng để nuôi cấy, nhân giống vi sinh vật bằng cách

lắc các bình nuôi cấy theo các chiều khác nhau (lắc vòng và lắc ngang) một cách đều đặn đểtăng lượng oxy hòa tan trong môi trường

Hình Máy lắc

1.9 Kính hiển vi (microscope): có vai trò rất quan trọng nghiên cứu vi sinh vật.

Dùng nghiên cứu, quan sát tế bào vi sinh vật về đặc điểm hình thái, sinh lý nhờ vào khả năngphóng đại của kính (sẽ giới thiệu chi tiết ở bài sử dụng kính hiển vi)

Hình Kính hiển vi quang học

1.10 Máy đo pH (pH meter): đo pH dung dịch, môi trường nuôi cấy vi sinh vật

A B

Hình Máy đo pH để bàn (A), máy đo pH cầm tay (B)

1.11 Máy cất nước (single/ double water stills): dùng để cất nước.

Hình Máy cất nước

1.12 Bể ổn nhiệt (water bath): chứa nước và được cài đặt ở nhiệt độ nhất định để ổn

định nhiệt độ cho những thí nghiệm cần sự ổn định về nhiệt độ

Hình Bể ổn nhiệt

1.13 Nồi lên men (fermenter/Bioreactor): thiết bị lên men nuôi cấy vi sinh vật trong

điều kiện tối ưu hóa và điều chỉnh được các thông số môi trường nuôi cấy

Hình Nồi lên men

1.14 Các thiết bị khác như: máy đếm vi sinh vật, máy quang phổ, sấy đông khô,…

2 Dụng cụ

- Dụng cụ thủy tinh: có nhiều loại với nhiều kích cỡ khác nhau như bình tam giác, ốngnghiệm, đĩa petri, lam kính, đũa thủy tinh, que trang, ống đong, cốc đong, bình định mức,…yêu cầu phải sạch, trong, trung tính Trước khi dùng đựng môi trường phải được sấy khô, làmnút bông và khử trùng trong tủ sấy khô

- Đối với dụng cụ mới: cần ngâm nước hoặc dung dịch H2SO4 loãng trong 24 giờ Sau

đó mới rửa lại bằng nước hoặc xà phòng nhiều lần cho đến khi pH trung tính

- Đối với dụng cụ đã qua sử dụng còn chứa môi trường và vi sinh vật, cần khử trùngrồi mới rửa sạch bằng xà phòng, phơi và sấy khô

- Đối với dụng cụ bị bám bẩn, cần ngâm thêm với dung dịch sulfocromic vài giờ, sau

đó rửa lại bằng nước sạch

- Dụng cụ sạch khi đưa lên ánh sáng không có vết mờ và vết bợn

- Các dụng cụ khác: như đèn cồn, giá ống nghiệm, que cấy, kẹp, kéo, bơm tiêm nhựa,đầu típ, bếp điện,…

- Phương pháp Pasteur: Chỉ diệt vi khuẩn gây bệnh ( ký sinh ), không diệt bào tử và vikhuẩn hoại sinh Phương pháp này không diệt hoàn toàn mầm bệnh mà chỉ chọn một vài visinh vật đối kháng mạnh nhất Vì vậy, phải biết nhiệt độ và thời gian diệt trùng cho từng loại

- Tia tử ngoại hay UV: chỉ sát trùng bề mặt, không xuyên sâu vào mẫu vật

- Tia âm cực: dùng trong diệt trùng dụng cụ giải phẫu, thuốc, thực phẩm Vật khử

trùng phải bao gói kín

- Trình bày yêu cầu của việc bao gói dụng cụ nuôi cấy vi sinh vật?

- Công dụng và cách sử dụng các dụng cụ, thiết bị phòng thí nghiệm vi sinh vật?

- Trình bày phương pháp tiệt trùng dụng cụ và môi trường nuôi cấy vi sinh vật?

BÀI 2 PHƯƠNG PHÁP PHA CHẾ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

VI SINH VẬT

1 Nguyên tắc

Các chất dinh dưỡng là những hợp chất tham gia vào quá trình trao đổi chất nội bào.Môi trường dinh dưỡng là hỗn hợp gồm các chất dinh dưỡng và các chất có nhiệm vụ duy trìthế oxi hoá khử, áp suất thẩm thấu của tế bào và sự ổn định độ pH của môi trường

Yêu cầu của môi trường dinh dưỡng: có đủ các chất dinh dưỡng cần thiết; có độ pHthích hợp; có độ nhớt nhất định; không chứa các yếu tố độc hại; hoàn toàn vô trùng đảm bảo

sự phát triển ổn định của vi sinh vật

Phân loại môi trường dinh dưỡng: người ta dựa trên các cơ sở khác nhau để phân loạimôi trường

- Phân loại theo nguồn gốc

+ Môi trường tự nhiên: dịch nước chiết thịt, nước chiết khoai tây, máu độngvật

+ Môi trường nhân tạo: Czapeck, Hansen, EMB

+ Môi trường bán tự nhiên: Potatoe glucose agar (PGA), giá đậu đường

- Phân loại theo trạng thái vật lý:

+ Môi trường lỏng: dạng lỏng, không có agar hay các chất làm giá thể kháctrong thành phần môi trường

+ Môi trường rắn: mỗi 1000ml môi trường có 15-20g agar hay các chất làm giáthể

+ Môi trường bán lỏng (bán rắn): mỗi 1000ml môi trường có 3-5g agar hay cácchất làm giá thể khác

- Phân loại theo công dụng:

+ Môi trường phân lập+ Môi trường tăng sinh+ Môi trường lưu giữ giống+ Môi trường thử nghiệm sinh hóaMôi trường nuôi cấy vi sinh vật được pha chế theo nguyên tắc:

- Dựa trên cơ sở nhu cầu về các chất dinh dưỡng và khả năng đồng hoá các chất dinhdưỡng của từng loại sinh vật

- Để đảm bảo sự cân bằng về áp suất thẩm thấu giữa môi trường và tế bào vi sinh vâtnên cần điều chỉnh tỷ lệ và nồng độ các chất trong thành phần môi trường

- Đảm bảo các điều kiện hoá lý cần thiết cho các hoạt động trao đổi chất của vi sinhvật

2 Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1 Dụng cụ

STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi

nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú

STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú

2.2 Môi trường và hoá chất

* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn:

Môi trường cao thịt - peptone

* Môi trường nuôi cấy nấm men:

Môi trường Hansen

- Glucose, maltose (hoặc đường kính ): 50g

Nấu sôi nhẹ để tan agar, phân phối môi trường vào các dụng cụ để khử trùng ở 121oCtrong 30 phút

* Môi trường nuôi cấy nấm mốc:

Môi trường Czapek

* Môi trường nuôi cấy xạ khuẩn:

Môi trường Gauze 1

* Môi trường nuôi cấy tảo

Môi trường Tamiya

3.2 Cân đong hóa chất pha chế môi trường

Cân, đong thật chính xác từng thành phần môi trường và pha chế theo đúng trình tựhướng dẫn trong tài liệu Dùng đĩa cân nhựa hoặc cốc thủy tinh để cân đong các loại hóa chất

dễ hút ẩm

3.3 Phối chế tạo môi trường nuôi cấy

- Các thành phần của môi trường được hòa tan riêng rẽ trong nước cất trước khi phốitrộn

- Phối trộn các thành phần theo trình tự nhất định tránh sự tương tác trực tiếp của cácthành phần có thể phản ứng tạo kết tủa với nhau Phối trộn dựa trên nguyên tắc thể tích tăngdần

- Sau khi phối chế các thành phần, cần tiến hành lọc môi trường qua giấy lọc, bôngthấm nước (đối với môi trường lỏng) hoặc vải màn (đối với môi trường đặc) để làm trong môitrường, đảm bảo việc quan sát vi sinh vật được dễ dàng

- Đối với môi trường rắn, sau khi phối trộn các thành phần, phải tiến hành nấu sôi môitrường để làm tan hoàn toàn agar trước khi phân phối vào dụng cụ chứa

3.4 Điều chỉnh độ pH của môi trường

- Muốn điều chỉnh độ pH của môi trường có thể dùng HCl 10 % hay NaCl 10 % Ngoài

ra có thể dùng một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3

- Muốn kiểm tra độ pH của môi trường nên dùng máy đo pH (pH-metre) Phương phápnày nhanh nhạy và cho độ chính xác cao Trong phòng thí nghiệm có thể dùng chỉ thị màuxanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng không cho

độ chính xác cao

3.5 Phân phối môi trường vào dụng cụ chứa

- Môi trường sau khi pha chế xong thường được phân phối môi trường vào ốngnghiệm, bình tam giác Trình tự phân phối gồm các bước sau:

+ Môi trường cần được đun cho hoá chất lỏng rồi đổ qua phễu thuỷ tinh vào các dụngcụ

+ Tay trái giữ dụng cụ chứa môi trường, tay phải kẹp nút bông và kéo ra

+ Nhanh tay rót môi trường vào dụng cụ và đậy nút bông lại

- Đối với ống nghiệm: Nếu dùng môi trường làm thạch nghiêng thì lượng môi trườngcần được phân phối chiếm 1/4 thể tích của ống nghiệm Nếu làm thạch đứng thì lượng môitrường cần được phân phối từ 1/2 - 1/3 thể tích ống nghiệm

Đối với bình cầu hay bình tam giác, lượng môi trường được phân phối chiếm 1/2 1/3 thể tích của bình

Đối với đĩa petri, môi trường chỉ được phân phối vào đĩa sau khi đã hấp tiệt trùng.Thể tích môi trường khoảng 12-15ml mỗi đĩa, lớp môi trường thạch dầy khoảng 2mm

- Viết nhãn môi trường trên dụng cụ chứa, bao gồm các thông tin:

+ Tên môi trường

- Đối với môi trường có các thành phần dễ bị biến tính ở nhiệt độ cao (vitamin, chấtkháng sinh, chất kích thích sinh trưởng ), cần hấp tiệt trùng môi trường trước, sau đó bổ sungcác thành phần này sau khi hấp xong

- Một số loại môi trường không được hấp tiệt trùng theo quy định của nhà sản xuất (vídụ: môi trường Selenit cystine broth, Xylose lysin deoxycholate agar, Chromocult coliformagar ), cần chuẩn bị nước cất vô trùng trước, sau đó pha chế và sử dụng ngay

3.7 Làm thạch nghiêng, thạch đứng, đổ thạch vào đĩa petri

- Làm thạch nghiêng: cần tiến hành ngay sau khi khử trùng môi trường vừa kết thúc vàmôi trường chưa đông đặc Ống nghiệm được đặt nghiêng cố định trên giá đỡ Phần đỉnhnghiêng phải cách nút đậy 3-5cm Phần đáy phải có một phần thạch đứng 0,5-1cm

- Làm thạch đứng: đặt các ống nghiệm đã có môi trường làm thạch đứng vào giá ,đểyên cho đến khi môi trường nguội và đông đặc

- Đổ thạch vào đĩa petri: môi trường vô trùng chứa trong ống nghiệm hoặc bình tamgiác được rót vào phần đáy của đĩa petri Toàn bộ quy trình đổ thạch vào đĩa petri đều thựchiện trong tủ cấy vô trùng hoặc trong phạm vi vô trùng của ngọn lửa đèn cồn

3.8 Kiểm tra độ vô trùng và bảo quản

- Môi trường sau khi pha chế xong, được đặt ở điều kiện nhiệt độ phòng 24 giờ Sauthời gian này kiểm tra độ vô trùng của môi trường bằng cách quan sát trạng thái môi trường

- Môi trường chưa dùng cần được bảo quản ở chỗ mát, hạn chế tác dụng của ánh sáng,nhiệt độ từ 0 - 50C và không để môi trường bị khô Thời gian lưu trữ tối đa là 15 ngày

- Trước khi sử dụng, để kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường, người ta thường đặtchúng vào tủ ấm 370C, trong 48 - 72h Sau đó lấy ra quan sát, loại bỏ các ống có vi sinh vậtphát triển và chỉ sử dụng những ống nghiệm, những đĩa petri có môi trường đạt yêu cầu

Thạch đứng

Canh trường

Thạch nghiêng

Hình Một số dạng môi trường trong ống nghiệm và hộp petri

- Các thao tác phân phối môi trường vào dụng cụ phải nhanh, gọn, khéo léo để môitrường không dính lên miệng dụng cụ hoặc nút bông và việc phân phối cần thực hiện xongtrước khi môi trường bị đông đặc

5 Báo các thực tập

- Trình bày khái niệm môi trường và phân loại môi trường nuôi cấy vi sinh vật?

- Trình bày quy trình pha chế môi trường nuôi cấy vi sinh vật?

- Yêu cầu của môi trường trong đĩa petri, ống nghiệm thạch nghiêng và thạch đứng?

- Giải thích tạo sao không phân phối môi trường vào đĩa petri trước khi khử trùng?

- Đĩa petri chứa môi trường trước khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa? Tại sao?

BÀI 3 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY VI SINH VẬT

1 Nguyên tắc

Quá trình nuôi cấy vi sinh vật gồm 2 khâu: cấy và nuôi Cấy là những thao tác chuyển

vi sinh vật từ môi trường đang sống sang môi trường thuận lợi hơn cho sự phát triển củachúng Nuôi là quá trình đảm bảo và duy trì những điều kiện thuận lợi nhất cho sự hoạt động

và phát triển của vi sinh vật Hai khâu này luôn gắn bó với nhau trong quá trình nghiên cứu

và ứng dụng vi sinh vật

* Mục đích của việc nuôi cấy

- Phát hiện sự có mặt của vi sinh vật trong các nguyên liệu và vật phẩm cần nghiêncứu

- Tiến hành việc nhân giống các vi sinh vật một cách nhanh chóng

- Bảo tồn các giống vi sinh vật thuần khiết

- Nghiên cứu các đặc tính sinh học và sự phát triển của từng loại vi sinh vật

* Nguyên tắc nuôi cấy vi sinh vật

- Mọi thao tác nuôi cấy đều phải thực hiện trong điều kiện vô trùng để tránh tạp nhiễmcác vi sinh vật không mong muốn từ môi trường ngoài

- Môi trường và dụng cụ nuôi cấy đều phải được khử trùng triệt để

- Duy trì tốt các điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng, oxy ) để vi sinh vậtphát triển thuận lợi

2 Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1 D ng cụng cụ ụng cụ

STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú

2.2 Môi trường, hóa chất

- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật: đã được chuẩn bị ở bài 2, bao gồm các loại

+ Môi trường cao thịt – pepton: nuôi cấy vi khuẩn+ Môi trường Hansen: nuôi cấy nấm men

+ Môi trường Czapeck: nuôi cấy nấm mốc

- Cồn 96o

2.3 Chủng giống vi sinh vật

- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea

- Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini

- Vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis

3.1 Cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng

Cấy truyền là phương pháp lấy vi sinh vật từ ống nghiệm này sang một ống nghiệmkhác Trước khi cấy, tiến hành dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ốngnghiệm bên dưới nút ống nghiệm

a Cấy truyền bằng pipet Pasteur

- Khử trùng pipet pasteur qua ngọn lửa đèn cồn

- Tay trái cầm ống giống gốc, dùng ngón tay út phải mở nút bông của ống giống, hơ

và xoay miệng ống giống qua ngọn lửa đèn cồn để sát khuẩn

- Cho pipet pasteur vào ống giống lỏng để lấy dịch vi khuẩn (dịch dâng lên trong pipet

từ từ theo lực mao dẫn), nhanh chóng đặt ngón tay trỏ phải lên đầu pipet, rút pipet ra khỏiống, đậy nút bông lại rồi đặt ống giống vào giá

- Cầm ống môi trường mới bằng tay trái, mở nút bằng ngón tay út phải, khử khuẩnmiệng ống, cho pipet vào tới khi đầu pipet chạm vào môi trường và để chảy ra vài giọt dịchchứa vi khuẩn Rút pipet ra, khử trùng miệng ống, đậy nút

- Đặt pipet vào bình đựng thuốc sát khuẩn

b Cấy truyền bằng que cấy vòng

- Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường

- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dâycấy

- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéo nútống nghiệm ra

- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm

- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ốnggiống

- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môitrường Khi đầu que cấy chạm vào môi trường thì lắc khẽ que cấy cho vi khuẩn tan trong môitrường

- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút lại

- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong

Hình Thao tác cấy truyền vi sinh vật trên môi trường lỏng

3.2 Phương pháp cấy truyền trên môi trường thạch

a Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng

Phương pháp này dùng để cấy truyền các vi sinh vật hiếu khí Gồm các thao tác nhưsau:

- Dán nhãn ghi: tên loại vi sinh vật, ngày cấy vào thành ống nghiệm

- Sử dụng que cấy đầu tròn thực hiện các thao tác cấy

- Tay trái cầm hai ống nghiệm: 1 ống giống; 1 ống môi trường

- Tay phải cầm que cấy và khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn cho đến khi nóng đỏ dâycấy

- Dùng ngón út và ngón áp út kẹp nút đậy ống nghiệm vào lòng bàn tay xoay nhẹ, kéonút đậy ra

- Hơ nóng để khử trùng không khí ở miệng 2 ống nghiệm

- Đợi khi que cấy vừa nguội, khéo léo đưa que cấy tiếp xúc với khuẩn lạc trong ốnggiống

- Rút que cấy ra, không để que cấy chạm vào thành ống nghiệm và đưa vào ống môitrường để thực hiện thao táo cấy:

- Hòa giống ở đầu que cấy vào giọt nước ở đáy ống nghiệm

- Nhẹ nhàng lướt que cấy trên mặt thạch theo các kiểu:

+ Hình chữ chi

+ Hình vòng xoắn

+ Hình vạch ngang song song

- Khử trùng lại phần không khí nơi miệng 2 ống nghiệm rồi đậy nút bông

- Khử trùng lại que cấy sau khi đã sử dụng xong

* Đối với nấm mốc hoặc các vi sinh vật đa bào sinh bào tử khác, khi cấy trên ốngnghiệm thạch nghiêng, dùng que cấy móc vô trùng lấy bào tử từ ống giống Cấy truyền bào tửsang ống nghiệm môi trường mới theo 2 cách:

- Cấy điểm: cách cắm ngập đầu que cấy thành 3 điểm cách đều nhau trên bề mặt thạch

- Cấy gõ: đưa que cấy có mang bào tử vào ống nghiệm môi trường, gõ nhẹ lưng quecấy vào thành ống nghiệm đối diện với mặt thạch để rải bào tử xuống

Hình Cấy truyền trên ống nghiệm thạch nghiêng

b Cấy trên ống nghiệm thạch đứng

- Phương pháp này dùng để cấy các vi sinh vật kỵ khí

- Sử dụng que cấy đầu nhọn

- Sau khi lấy giống vi sinh vật, dùng que cấy này đâm sâu vào phần khối thạch hìnhtrụ

- Đâm sát đáy ống nghiệm và đâm thành 3 đường: 1 đường chính giữa, 2 đường sátthành ống tùy yêu cầu

- Đường cấy phải thẳng, nhẹ nhàng để không gây nứt, vỡ môi trường

Hình Phương pháp cấy trên thạch đứng

c Cấy truyền trên thạch đĩa

- Dùng que cấy đầu tròn, hoặc que trải thủy tinh

- Dùng que cấy đầu tròn lấy vi sinh vật bằng tay phải theo đúng quy cách đã hướngdẫn ở trên

- Tay trái cầm hộp petri khẽ hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn Sau đó để cách đèn cồnchừng 1 - 2cm, khẽ mở mở nghiêng một bên hộp (phần hơ lửa), sao cho vừa đủ để cho quecấy vào

- Nhẹ nhàng, nhanh chóng lướt que cấy trên mặt thạch theo một trong các kiểu sau:

+ Theo hình zig zac trên toàn bộ mặt thạch+ Theo những đường song song

+ Theo hình zig zac 3 hoặc 4 góc

- Khi dùng que trải, hút sẵn một lượng khoảng 0,1 dịch vi sinh vật nhỏ lên trên bề mặtthạch đĩa Khử trùng que trải thủy tinh bằng cách nhúng vào cồn và đốt trên ngọn lửa Làmnguội que trải và trải đều giọt dung dịch vi sinh vật lên khắp bề mặt môi trường thạch đĩa

Hình Các kiểu cấy truyền bằng que cấy trên thạch đĩa

(d)

Hình Cấy truyền bằng que trải trên thạch đĩa

3.3 Các điều kiện nuôi cấy của vi sinh vật

- Nhiệt độ: Phụ thuộc vào từng loại vi sinh vật Duy trì sự ổn định của nhiệt độ đóbằng tủ ủ vi sinh vật

- Độ ẩm: để duy trì độ ẩm, trong quá trình nuôi cần đảm bảo đủ lượng nước khi làmmôi trường Trong điều kiện cần thiết có thể phun nước vô khuẩn vào phòng nuôi hoặc đểnước bốc hơi trong tủ ấm

- Oxy: đối với vi sinh vật hiếu khí, cung cấp thường xuyên và đầy đủ oxy Lớp môitrường nuôi cấy có độ dầy vừa phải Các bình chứa môi trường được lắc thường xuyên trongquá trình nuôi để cung cấp thêm oxy cho vi sinh vật Nếu nuôi cấy trong môi trường có khốilượng lớn phải tiến hành sục khí thường xuyên hay định kỳ Đối với vi sinh vật kỵ khí: hạnchế sự tiếp xúc với oxy bằng cách đổ lên bề mặt môi trường parafin, dầu vaselin hoặc cấytrích sâu vào môi trường đặc, nuôi cấy trong bình hút chân không, nuôi trong ống nghiệm đặcbiệt, sau khi rút hết không khí và hàn kín lại, đun sôi môi trường trong một thời gian để loạihết O2 Để nguội 450C Dùng pipet cấy vi sinh vật vào đáy ống nghệm Làm nguội nhanh rồi

đổ vaselin lên bề mặt để hạn chế sự tiếp xúc với oxy

3.4 Quan sát vi sinh vật sau khi nuôi cấy

Sau khi nuôi ở thời gian và nhiệt độ thích hợp cho mỗi loại vi sinh vật ta thấy:

- Trong môi trường lỏng: Vi khuẩn phát triển sẽ làm đục môi trường

- Trong môi trường đặc ở thạch nghiêng: Nấm men, vi khuẩn phát triển sẽ tạo nên vệtnổi trên mặt thạch trong hay trắng đục Nấm mốc sẽ tạo nên những sợi mảnh từ vết cấy

- Trong môi trường thạch đứng: Các vi khuẩn kỵ khí phát triển ở đáy của cột môitrường

- Khi cấy truyền vi khuẩn, dùng tay trái cầm hai ống nghiệm; ống có vi sinh vật ở xa

và ống môi trường ở gần người thao tác Trước và sau khi cấy truyền xong phải hơ que cấytrên ngọn lửa đèn cồn để vô trùng que cấy

5 Báo cáo thực tập

- Trình bày phương pháp cấy truyền vi khuẩn, nấm men, nấm mốc?

- Nêu các điều kiện nuôi ủ nấm men và vi khuẩn sau khi gieo cấy?

- Đĩa petri sau khi cấy vi sinh vật nên đặt úp hay ngửa mặt thạch? Giải thích?

- Khi cấy truyền vi sinh vật trên ống thạch nghiêng, giải thích tại sao phải ria que cấyngược từ đáy ống nghiệm lên phía trên?

BÀI 4 PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT VI SINH VẬT BẰNG KÍNH HIỂN

và đặc tính của một số vi khuẩnmà kính hiển vi thường khó quan sát

b Kính hiển vi đổi pha

Ánh sáng thường bị đổi pha và biên độ dao động bởi cấu trúc đặc biệt của tụ quangkính, vật kính và thị kính.Chức năng: dùng quan sát rõ nét các cấu trúc nhỏ như tiên mao, cáclớp màng

c Kính hiển vi huỳnh quang

Chùm tia tử ngoại chiếu vào tiêu bản đã nhuộmmàu bằng các chất huỳnh quang.Trong tế bào, các cấu trúckhác nhau sẽ phát quang với màu sắc khác nhau Chức năng: quansát và phân biệt được các cấu trúc khác nhautrong tế bào vi sinh vật

d Kính hiển vi điện tử

Chùm tia điện tử bước sóng rất ngắn, năng suất phân li rất lớn nên độ phân giải cao,giúp phân biệt 2 điểm rất gần nhau Chức năng: dùng quan sát virus, cấu trúc phân tử của tếbào

e Kính hiển vi quang học

Dùng ánh sáng có bước sóng từ 500nm – 560 nm trong chùm ánh sáng thường để tạonăng suất phân ly lớn giúp phân biệt 2 điểm cách nhau khoảng 0.2 µm trở lên Hệ thốngphóng to của kính hiển vi quang học gồm hai bộ phận:

Vật kính (quay về phía vật quan sát) và thị kính (quay về phía mắt nhìn) Mỗi bộ phậnnày là một hệ thống thấu kính hội tụ phức tạp, mẫu vật cần quan sát AB được đặt trước vậtkính một khoảng cách lớn hơn tiêu cự của vật kính một chút Ảnh thật đảo ngược A’B’ củavật sẽ thu được ở bên kia vật kính, nằm trong khoảng tiêu cự của thị kính Thị kính hoạt độngnhư một kính lúp Qua thị kính, người ta sẽ thấy ảnh ảo A’’B’’ được phóng to lên của ảnhthật A’B’

Hình Nguyên tắc quang học của kính hiển viChức năng của kính hiển vi quang học dùng để quan sát tế bào vi sinh vật, ký sinhtrùng, tế bàođộng vật, thực vật

1.2 Cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học

Kính hiển vi quang học được cấu tạo gồm 2 phần:

- Hệ thống cơ học: giá kính gồm chân kính, thân kính, trụ đỡ và xoay thị kính, ổ gắn

Đế kính Đèn

và xoay vật kính, bàn kính, thanhtrượt di chuyển tiêu bản, ốc di chuyển thanh trượt, kẹp giữtiêu bản, ốc di chuyển tụ quang kính, ốc điều chỉnh sơ thô cấp, ốc điều chỉnh thứ cấp (vicấp)

-Hệ thống quang học gồm: thị kính, vật kính, tụ quang kính, màn chắn sáng, nguồnchiếu sáng (đèn điện chiếu sáng và/ hoặc kính chiếu sáng) Ngoài ra, ở kính dùng nguồnchiếu sáng là đèn điện thì có thêm bộ phận cung cấp điện như phích cắm, dây điện, cầu chì,mạchđiện (trong chân kính) và nút điều chỉnh cường độ chiếu sáng

Hình Cấu tạo kính hiển vi quang học

* Nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi quang học

- Vật kính là hệ thống quang học phức tạp gồm một số thấu kính, trực tiếp phóng đạimẫu vật Các thấu kính sắp xếp theo thứ tự, thấu kính nhỏ ngoài cùng hướng vào tiêu bản có

độ phóng đại lớn nhất Độ phóng đại của kính phụ thuộc tiêu cự, tức bán kính cong của thấukính Thấu kính càng cong, tiêu cự càng ngắn thì khả năngphóng đại càng lớn

Có 2 loại vật kính:

+ Vật kính khô độ phóng đại nhỏ như x4, x10, x15, x40,

+ Vật kính dầu có độ phóng đại lớn như x90, x100

- Thị kính cũng có cấu tạo phức tạp, gồm 2 thấu kính, một hướng về mắt người xem,một hướng về vật kính Thị kính phóng đại một lần nữa ảnh do vật kính thu vào, làm ảnh tolên, xem rõ hơn

Độ phóng đại của kính = độ phóng đại của vật kính x độ phóngđại của thị kính

Ví dụ: Độ phóng đại của vật kính: x100 , độ phóng đại của thị kính: x10

Như vậy: độ phóng đại của kính: 100 x 10 = 1.000 lần

Năng suất phân ly của kính quan trọng hơn độ phóng đại, và là tiêu chuẩn chính đểchọn kính hiển vi Năng suất phân ly (độ phân giải) của kính hiển vi là đại lượng cho biết khảnăng phân biệt hai điểm của vật quan sát nằm sát nhau Nếu khoảng cách giữa 2 điểm nằmcàng sát nhau mà vẫn có thể phân biệt được thì năng suất phân ly của kính càng cao

Khoảng cách này phụ thuộc chiều dài sóng ánh sáng sử dụng và số lượng tia sáng đivào vật kính, được biểu hiện bằng công thức:

Trong đó:

λ: Độ dài bước sóng phát ra từ mẫu vật

n: Chỉ số chiết quang của môi trường giữa mẫu vật và vật kính

α: Nửa góc mở của vật kính

2nsinα: Trị số mở của vật kính

- Qua đó, ta thấy muốn có độ phân ly cao phải dùng ánh sáng có bước sóng thật ngắn,hoặc dùng vật kính có trị số mở lớn Nếu dùng vật kính có trị số mở 0,65 và soi với ánh sángtrắng (có bước sóng trung bình α= 0,55 μm) thì khoảng cách nhỏ nhất có thể nhìn thấy rõđược là:

Bảng Thông số của vật kính và thị kính

Ký hiệu ghi

trên vật kính

Độ phóng đạicủa vật kính

Độ mở(A)

Khoảng cách từ vậtkính đên tiêu bản (mm)

Đường kính vi trườngkhi quan sát bằng thịkính x10 (mm)

ta dùng dầu soi cóchiết suất ánh sáng gần bằng thủy tinh, thủy tinh và dầu soi được xem nhưmột môi trường đồng nhất Ánh sáng đi qua không bị khúc xạ, nên tập trung đầy đủ vào vậtkính, giúp xemrõ ảnh

Hình Tương quan giữa độ phóng đại của vật kính với khoảng cách làm việc từ vật kính đến

tiêu bản vi sinh vật

Độ mở

Độ phóng đại

Khoảng cách làm việc

Hình Nguyên lý của vật kính dầu

2 Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1 D ng cụng cụ ụng cụ

STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú

2.2 Hóa chất

- Cồn 96o

- Dịch xà phòng loãng

- Dung dịch Xylen

2.3 Chủng giống vi sinh vật dùng quan sát

- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea

Nguồn sáng

Đèn tụ quang

Dầu soi kính

Ánh sáng bị khúc xạ nếu kkông có dầu soi kính

Ánh sáng không bị khúc xạ Thấu kính của vật

kính dầu

Tiểu bản

Con ngươi diaphragm

- Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini

- Vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis

- Đặt lá kính lên giọt canh trường thật nhẹ nhàng tránh không tạo thành bọt khí giữahai tấm kinh Muốn vậy để một mép lá kính tiếp xúc với phiến kính rồi từ từ hạ lá kính xuống

- Đưa tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10 rồi x40

b Làm tiêu bản giọt treo

Loại tiêu bản này dùng để theo dõi sự sinh sản, sự hình thành bào tử, khả năng diđộng và phản ứng của tế bào vi sinh vật với các loại kích thích

- Dùng phiến kính đặc biệt có phần lõm hình tròn ở giữa

- Bôi vazơlin quanh phần lõm của phiến kính

- Cho 1 giọt canh trường lên giữa lá kính

- Thận trọng xoay ngược lá kính cho giọt canh trường xuống phía dưới rồi dặt lênphần lõm của phiến kính

- Chú ý không để giọt canh trường lan rộng hay chạm vào phần đáy của phần lõm trênphiến kính

- Đặt tiêu bản lên quan sát trên kính hiển vi ở vật kính x10 rồi x40

Ưu điểm của loại tiêu bản này so với tiêu bản giọt ép là giúp ta quan sát tế bào vi sinhvật sống dễ dàng hơn và lâu hơn

Hình Tiêu bản giọt ép và tiêu bản giọt treo

3.2 Sử dụng kính hiển vi quan sát tiêu bản vi sinh vật sống

Trước khi sử dụng phải kiểm tra tất cả các bộ phận của kính, dùng khăn mềm để laucác bộ phận của kính (Chú ý: chỉ lau bên ngoài, không tháo rời các bộ phận của kính), để kínhngay ngắn vừavới tầm ngồi, sau đó tiến hành tuần tự các bước tiếp theo để soi tiêu bản

* Bước 1: Chuẩn bị kính

Cắm điện, bật công tắc kính, điều khiển núm chỉnh ánh sáng ở đế kính để có đượcánh sáng thích hợp Xoay vật kính nhỏ nhất (vật kính 10x) về trục kính như trên

* Bước 2: Đặt tiêu bản vào mâm kính

- Trước khi đặt tiêu bản vào mâm kính, phải chọn mặt phải, mặt trái của tiêu bản Mặtphải của tiêu bản thường có dán lamen, dán nhãn (nếu có lamen và nhãn) hoặc làm giảm bớt

độ lóa của gương khi để nghiêng soi ra ánh sáng (nếu không có lamen, không có nhãn)

- Để mặt phải của tiêu bản lên trên, tay phải mở kẹp tiêu bản, tay trái cầm phía đầunhãn tiêu bản, đặt tiêu bản vào mâm kính và tay phải thả kẹp giữ tiêu bản ra Tiêu bản đượcgiữ chặt vào xe đẩy, trên mâmkính

- Dùng ốc xe đẩy để điều chỉnh sao cho mẫu vật nằm đúng vào trục kính (giữa lổ mâmkính)

Chú ý: Có thể dùng điểm sáng của hộp tụ quang để làm điểm chuẩn khi điều chỉnhmẫu vật về điểm trục kính, nếu mẫu vật nhỏ quá

- Xoay vật kính x10 vào khớp của ổ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang)

Mắt nhìn vào bàn đặt tiêu bản (không nhìn vào thị kính), hai tay xoay ốc điều chỉnh sơcấp đưa dần vật kính hướng đến tiêu bản (không được chạm vào tiêu bản)

- Đặt mắt hướng vào thị kính, hai tay xoay chậm ốc điều chỉnh sơ cấp hướng ra xa tiêubản đến khi mắt thấy rõ dần tiêu bản mẫu vật thì dừng lại Hai tay nắm ốc vi cấp điều chỉnhcho ảnh rõ nhất

- Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kínhvới tiêu bản và màng chắn sáng sao choảnh rõ nhất

Xem tiêu bản ở vật kính X40

- Nâng tụ quang kính lên vừa phải (thị trường sáng hơn)

- Xoay vật kính X40 vào khớp của ổ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang)

- Đặt mắt hướng vào thị kính, có thể nhìn thấy ngay hình thái của mẫu vật (đôi khikhông rõ lắm) Hai tay nắm ốc vi cấp điềuchỉnh cho ảnh rõ nhất

- Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quang kínhvới tiêu bản và màng chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất

* Quan sát vi sinh vật

- Xem chi tiết hình dáng, màu sắc của nấm mốc: khuẩn ty, vách ngăn khuẩn ty, cuốngbào tử, thể bọng, thể bình, túi bào tử, cách sắp xếp của bào tử, Xem tổng thể hình dáng củanấm mốc ở vật kính x10, vẽ hình

- Tế bào nấm men: Xem ở vật kính x40 quan sát hình dạng tế bào: tế bào đứng riêng lẻhay kết dính tạo sợi giả - sợi thật, trạng thái nảy chồi Vẽ hình một thị trường kính hiển vi ởvật kính X40, có các tế bào nấm men

- Xem trạng thái của tế bào vi khuẩn: di động hay đứng yên, kiểu di động của tế bào,hình dạng của tế bào

3.3 Bảo quản kính hiển vi

- Sau khi sử dụng xong, xoay tất cả các vật kính ra trước, mở kẹp tiêu bản, lấy tiêubản ra trả về chỗ cũ, hạ mâm kính, hạ hộp tụ quang.Dùng hai tay bê kính cất vào tủ chống ẩm(tủ bảo quản kính hiển vi)

- Phải giữ gìn kính luôn luôn sạch sẽ, không để bụi bẩn và hóa chất dính vào Luônluôn giữ kính ở nơi khô ráo, mát mẻ để các bộ phậnquang học không bị mốc

- Khi lau kính, khi sử dụng kính, không được tháo rời các bộ phận của kính Khôngđược dùng tay xoa trên mặt các thấu kính, mà nên dùng một bút lông nhỏ sạch để chải bụi ở

- Không được tháo rời các bộ phận của kính hiển vi.

- Các tiêu bản vi sinh vật sống sau khi quan sát xong phải khử trùng trước khi rửa

- Không được nhúng các vật kính x4, x10, x40 vào trong giọt dầu khi quan sát

5 Báo cáo thực tập

- Trình bày cấu tạo và nguyên tắc hoạt động của kính hiển vi?

- Vẽ hình các tiêu bản vi sinh vật quan sát? Chú thích hình vẽ?

BÀI 5 PHƯƠNG PHÁP NHUỘM MÀU VI SINH VẬT

1 Nguyên tắc

Nhuộm màu là quá trình làm cho tế bào hoặc các thành phần của tế bào vi sinh vật cómàu dưới tác dụng của các loại thuốc nhuộm Nhuộm màu vi sinh vật nhằm mục đích:

- Giúp dễ dàng hóa việc quan sát hình dạng tế bào, các thành phần cấu trúc của tế bào

vi sinh vật trên kính hiển vi

- Giúp phân biệt các chủng vi sinh vật với nhau do việc ăn màu khác nhau đối với cácloại thuốc nhuộm tạo điều kiện cho việc phân loại, định dang vi sinh vật (nhuộm màu Gram)

Tùy theo từng loại vi sinh vật, tuỳ theo từng cấu trúc tế bào muốn nhuộm, ta có nhiềuphương pháp nhuộm màu khác nhau Mỗi phương pháp nhuộm cũng có nguyên tắc nhuộmkhác nhau

Đối với các phương pháp nhuộm màu không cố định vi sinh vật, thường sử dụng cácloại thuốc nhuộm không hoặc ít độc đối với vi sinh vật và được pha loãng đảm bảo cho visinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm

Đối với các phương pháp nhuộm màu vi sinh vật được cố định, thường sử dụng thuốcnhuộm có khả năng thẩm thấu qua màng tế bào và kết hợp với thành phần khác nhau của tếbào thành những hợp chất màu đặc trưng bền vững

2 Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1 D ng cụng cụ ụng cụ

STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú

STT Dụng cụ dùng chung Đơn vị tính Số lượng Ghi chú

- Thuốc nhuộm Fuchsin Zeihl loãng và đậm đặc

- Thuốc nhuộm Safranin O

- Thuốc nhuộm Crystal violet (tím kết tinh)

- Dung dịch lugol

- Dung dịch Xanh methylen

- Dầu soi kính (dầu Bách hương – dầu cede)

* Dung dịch tím kết tinh (crystal violet - C25H30N3Cl.9H2O = 570,11): 2g tím kết tinhhoà tan trong 20 ml ethanol 95%; 0,8 g ammon oxalat hoà tan trong 80 ml nước cất Trộn haidịch nói trên lại với nhau, giữ 48 giờ rồi lọc Bảo quản trong lọ tối, sử dụng trong vài tháng

* Dung dịch lugol: Hoà tan 1g Iod trong 3-5 ml nước cất, thêm 2g KI (Kali iodide),khuấy cho tan hết, thêm nước cất cho đủ 300 ml Bảo quản trong lọ tối

* Dung dịch tẩy màu: Ethanol 96% hoặc trộn hỗn hợp 70 ml ethanol 96% với 30 mlaceton hoặc trộn 100ml ethanol 96% với 4ml I2 10%

* Dung dịch nhuộm bổ sung: Chuẩn bị sẵn dung dịch Safranin O (C20H19N4Cl =350,80) 2,5%, trước khi dùng pha với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (vol/vol) để có dung dịch 0,5%.Hoặc chuẩn bị sẵn dung dịch Fuchsin Ziehl: fuchsin kiềm (C19H18N3Cl = 323,82) 1g, phenol5g, ethanol 90% 10 ml, nước cất 200 ml (hòa tan fuchsin với ethanol; hòa tan phenol với nướccất sau đó trộn lại)

* Dung dịch xanh methylen: hoà 1g xanh methylen vào 10ml ethanol 96% Bổ sungnước cất đủ 100ml

* Dung dịch lục malachite 50%: hoà 5g lục malachite vào 100ml nước cất

* Thuốc nhuộm Nishikawa Kangen

- Dung dịch A: hoà tan 5g acid tanic vào 100ml nước cất, vừa khuấy vừa bổ sung thêmtheo thứ tự 1,5g FeCl3, 2ml Formalin, 1ml NaOH4% Giữ trong chai màu được 6 giờ

- Dung dịch B: hòa tan 2g AgNO3 vào 100ml nước cất Lấy ra 10ml cho vào 1 cốc,hêm từng giọt NH4OH, lắc đều cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt thì dừng lại (khoảng5-6 giọt) Đổ dung dịch này vào phần còn lại của dung dịch B, lắc đều Giữ trong chai màu

* Dung dịch Carbon Fuchsin:

- Dung dịch Fuchsin kiềm bão hoà trong nước cất (10%): 10 ml

- Dung dịch acid carbolic 5% trong nước cất: 100 ml

Trộn đều 2 dung dịch với nhau

2.3 Chủng giống vi sinh vật dùng quan sát

- Nấm mốc: Aspergillus niger, Aspergillus oryzea

- Nấm men: Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces vini

- Vi khuẩn: Escherichia coli, Bacillus subtilis

3.1 Làm tiêu bản nhuộm màu vi sinh vật không cố định

- Nhỏ 1 giọt thuốc nhuộm xanh methylen 0,001% lên phiến kính

- Nhỏ 1 giọt canh trường vi sinh vật hoặc hòa một ít sinh khối vi sinh vật vào giọtthuốc nhuộm

- Đậy lá kính lên giọt dịch

- Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 10) rồi (x 40)

3.2 Làm tiêu bản nhuộm màu vi sinh vật cố định

Có hai cách nhuộm chính:

- Nhuộm đơn : Chỉ dùng 1 loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản

- Nhuộm kép : Dùng đồng thời 2 hay nhiều loại thuốc nhuộm trên 1 tiêu bản (nhuộmGram, nhuộm bào tử, nhuộmZiehl – Neelsen )

Quy trình nhuộm được thực hiện như sau

a Tạo vết bôi và cố định vi sinh vật

- Lau nhẹ tiêu bản sạch bằng giấy mềm, hơ qua đèn cồn

- Dùng bút chì mỡ hoặc bút lông ghi tên mẫu, và vẽ vòng tròn đường kính ≈15mm, ởmặt dưới lame kính để đánh dấu vết khuẩn phía trên lame

- Đốt nóng đỏ que cấy (trước và sau khi thao tác), mở nút bông, hơ nhanh miệng ốngnghiệm

* Trường hợp 1: mẫu nuôi cấy trong canh dinh dưỡng, đưa đầu que cấy vào miệngống nghiệm (vẫn giữ gần ngọn lửa), nhúng vào dung dịch canh cấy, lấy 1 vòng que cấy Lấyque cấy ra, hơ nhanh miệng ống nghiệm và nút bông, đậy nút bông lại Phết canh khuẩn trênvòng que cấy vào mặt trên lam, giữa vòng tròn, dàn đều raxung quanh

* Trường hợp 2: mẫu nuôi cấy trong thạch dinh dưỡng, nhỏ giọt dung dịch NaCl 9‰

lên giữa vòng tròn (mặt trên lam) Thao tác giống trường hợp 1, nhưng dùng cạnh vòng tròncủa đầu que cấy đặt nhẹ lên khuẩn lạc vi khuẩn, rồi đặt vào giọt NaCl 9‰ trên lam, dàn mỏng

và đều

- Cố định mẫu: Mục đích giết chết vi khuẩn, làm cho vi khuẩn bám chặt vào lame vàlàm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống Cố định mẫubằng cách để khô tự nhiên hoặc hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn

1 giọt nước

1 ít vk phát triển

Dàn trãi hỗn hợp nước –vi khuẩn

Làm khô trong không khí

Hình Tạo vết bôi và cố định vi sinh vật

b Nhuộm đơn

- Đặt tiêu bản vi sinh vật cố định lên que thuỷ tinh hình chữ U (đặt nằm ngang miệngmột chậu thuỷ tinh)

- Nhỏ vào vết bôi vài giọt Fuchsin Ziehl, để yên từ 1 - 2 phút

- Rửa vết bôi bằng cách nghiêng phiến kính, dùng bình xịt cho dòng nước chảy nhẹqua vết bôi đến khi nước chảy ra không còn màu nữa

- Dùng giấy thấm khô tiêu bản hoặc hơ nhẹ tiêu bản trên đèn cồn

- Quan sát tiêu bản ở vật kính (x 40) rồi chuyển sang vật kính (x100)dùng dầu soi

Hình Quy trình nhuộm đơn

c Phương pháp nhuộm Gram

Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn

thành 2 nhóm Gram dương (Gram positive) và Gram âm (Gram negative) dựa trên các đặctính hoá lý của thành tế bào Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhàkhoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram (1853 -1938) Ông phát triển kỹ thuật nàyvào năm 1884, về sau được Hucker và nhiều người khác cải tiến Quy trình nhuộm Gram nhưsau:

- Đặt tiêu bản vi sinh vật cố định lên que thuỷ tinh hình chữ U (đặt nằm ngang miệngmột chậu thuỷ tinh) Đặt lên bề mặt vết bôi một tấm giấy thấm

- Nhuộm bằng dung dịch tím kết tinh trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước

Giá đỡ chữ U Bocan hoặc nơi để thích hợp

Bình đựng thuốc nhuộm

Bình đựng nước

Làm khô

- Cẩn màu tím kết tinh lên tế bào i sinh vật bằng cách thêm dung dịch lugol và giữtrong 1 phút, rửa nước.

- Nhỏ dịch tẩy màu, giữ khoảng 30 giây (cho đến khi vừa thấy mất màu), rửa nước

- Nhuộm bổ sung màu bằng dung dịch safranin O hoặc fuchsin Ziehl trong 1 phút, rửanước, làm khô Lần nhuộm này cả hai nhóm vi khuẩn đều bắt giữ thuốc nhuộm, nhưng vikhuẩn Gram dương không bị thay đổi màu nhiều, trong khi vi khuẩn Gram âm trở nên đỏvàng (nhuộm safranin O) hay đỏ tía (Fuchsin Ziehl)

- Quan sát tiêu bản ở vật kính dầu x90 hay x100 Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gramdương bắt màu xanh đen hay tím, Gram âm bắt màu đỏ vàng (nhuộm safranin) hay đỏ tía(fuchsin)

* Xem tiêu bản ở vật kính x90, x100

- Nâng tụ quang kính lên sát tiêu bản, mở cường độ sáng tối đa (thị trường sángnhất)

- Xoay vật kính x100 vào khớp của trụ đỡ vật kính (hướng vật kính vào tụ quang)

- Nhỏ một giọt dầu soi vào giữa tiêu bản

- Mắt nhìn vào bàn đặt tiêu bản (không nhìn vào thị kính), hai tay xoay ốc điều chỉnh

sơ cấp đưa dần vật kính hướng đến tiêu bản vừa chạm vào tiêu bản thì dừng lại

- Đặt mắt hướng vào thị kính, hai tay xoay chậm ốc điều chỉnh sơ cấp hướng ra xa tiêubản đến khi mắt thấy rõ dần tiêu bản mẫu vật thì dừng lại

- Mắt vẫn hướng vào thị kính, điều chỉnh một lần nữa khoảng cách của tụ quangkính với tiêu bản và chỉnh màng chắn sáng sao cho ảnh rõ nhất

Hình Sự biến đổi màu của vi khuẩn Gram dương, Gram âm khi nhuộm Gram

Trang 32

Bổ sung dung dịch lugol;

Rửa nước; 5 giây Tẩy màu; 15- 30 giây

Nhuộm safranin; 60-80 giây Rửa nước; 5 giây

Hình Quy trình nhuộm Gram

d Phương pháp nhuộm Ziehl – Neelsen (Nhuộm kháng acid - Dùng phân biệt

vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis với các vi khuẩn khác)

Do tế bào vi khuẩn kháng acid có lớp vỏ sáp bao bọc nên khi đã nhuộm được phứchợp màu carbolfuchsin, phức hợp này sẽ không bị tẩy màu bởi dung dịch tẩy màu mạnh (acid,alcool acid) Tuy nhiên để phức hợp màu này có thể thấm xuyên qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn,

có hai cách: (1) Đun nóng phết nhuộm với dung dịch màu carbolfuchin, nhờ đó màcarbolfuchsin thấm qua lớp vỏ sáp của vi khuẩn để nhuộm màu vi khuẩn; đây là phương phápnhuộm nóng Ziehl - Neelsen (2) Phương pháp thứ hai là phương pháp nhuộm lạnh còn gọi làphương pháp Kinyoun, trong phương pháp này người ta dùng dung dịch carbolfuchsin đậmđặc, nhờ vậy khi phủ dung dịch màu đậm đặc này lên phết nhuộm với thời gian lâu,carbolfuchsin vẫn có thể thấm qua lớp vỏ sáp để nhuộm màu vi khuẩn

Quy trình nhuộm như sau:

- Đặt tiêu bản đã phết kính và cố định mẫu lên thanh thủy tinh chữ U, đặt trên chậunhôm trên bếp điện

- Đặt miếng giấy lọc lên vòng phết kính

- Nhỏ dung dịch Fuschin đậm đặc thấm ướt hết giấy lọc, đun nóng liên tục từ 5 – 7phút (chú ý không được làm sôi thuốc nhuộm)

- Trong khi đun phải nhỏ bổ sung thuốc nhuộm liên tục để giấy lọc luôn thấm ướt

- Rửa nước, thấm khô

- Tẩy cồn – acid đến khi không còn màu hồng của Fuschin đậm đặc (khoảng 30 giây).Rửa nước

- Nhuộm bổ sung bằng xanh methylen trong thời gian 2 phút

- Rửa nước, thấm khô

- Quan sát bằng vật kính dầu x90 hay x100

- Vi khuẩn lao (vi khuẩn kháng acid) bắt màu hồng đỏ cánh sen của Fuschin, vi khuẩnkhác bắt màu xanh methylen

Trang 33

Làm lạnh và rửa với nước; 30s

Rửa với nước; 5s

Nhỏ Fucshin làm ướt giấy lọc, đun nóng 5-7 phút (không để sôi)

Tẩy màu bằng hỗn hợp acid – alcolh đến mất màu hồng; 10-30s

Nhuộm bổ sung methyl blue; 2 phút

Rửa với nước; 30s

Hình Quy trình nhuộm Ziehl – Neelsen

e Nhuộm bào tử

Một số vi khuẩn như Bacillus hay Clostridium có khả năng tạo thành bào tử Bào tử

có thể tồn tại trong môi trường thiếu chất dinh dưỡng, chịu được nhiệt và một số các hóa chất

mà thể sinh dưỡngkhông thể

Bào tử rất khó nhuộm bởi đa số các thuốc nhuộm do màng bào tử dày, chắc, khó bắtmàu và chứa nhiều lipid Vì thế, cần thiết phải có những phương pháp nhuộm đặc biệt đối vớibào tử Tuy nhiên, đối với bất kì phương pháp nào thì tế bào trước hết được xử lý bằng nhiệthay/và acid để tế bào chất bào tử dễ bắt màu Sau đó, nhuộm cả tế bào chất của bào tử và tếbào với thuốc nhuộm có tính hoạt nhuộm mạnh rồi tẩy màu của tế bào chất đi và nhuộm nóvới một thuốc nhuộm phân biệt khác Khi đó, tế bào chất sẽ mang một màu, và bào tử sẽmang màu khác Đôi khi bào tử được nhìn thấy bên trong tế bào Hình thái của bào tử còngiúp nhận diện vi khuẩn Hình dáng và kích thước bào tử phụ thuộc vào vị trí của nó trong tếbào và kích thước bề ngang của tế bào mang nó Bào tử thường nằm trong tế bào sinh dưỡng

ở ba vị tríkhác nhau: nếu nằm ở tâm tế bào thì được gọi là bào tử kiểu Bacillus, nếu nằm lệch tâm – kiểu Clostridium và nếu nằm ở cực tế bào thì gọi là bào tử kiểu Plectidium Ở một số

giống vi khuẩn khác, các bào tử có thể tồn tại tự do bởi vì các tế bào xung quanh nó đã tan rã

Có thể dùng 1 trong 3 hỗn hợp thuốc nhuộm sau để nhuộm bào tử:

- Lục malachite và thuốc nhuộm safranin

- Fuschin, HCl 0.5%, H2SO4 1%, và xanh methylene (Loeffler)

- Xanh methylene và đỏ trung tính

Quy trình nhuộm như sau:

* Với thuốc nhuộm lục malachite và thuốc nhuộm safranin

- Chẩn bị vết bôi trên phiến kính sạch và hơ nóng nhẹ

- Thêm 1 ít nước vào chậu nhôm và đun sôi

- Đặt giá nhuộm lên chậu nhôm rồi đặt phiến kính lên nó

- Đặt nhẹ mẫu giấy thấm (nhỏ hơn phấn kính một chút) lên trên phiến kính.Mẫu giấynày sẽ giúp giữ thuốc nhuộm lại trên phiếnkính

- Phủ phiến kính với thuốc nhuộm lục malachite và hơ hơi nước trong vòng 5 phút

- Tiếp tục thêm thuốc nhuộm để tránh tình trạng thuốc nhuộm bị khô trên phiếnkính

- Khử màu với nước trong 30 giây bằng cách cho nước chảy lên phiến kính Các tế bàosinh dưỡng sẽ bị mất màu, còn bào tử sẽ giữ màu lại

- Nhuộm lại với safranin trong 30 giây rồi rửa lại với nước trong 30 giây nữa Thấmkhô cẩn thận Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính đâu (x100) Bào tử sẽ có màu xanh còn

tế bào sinh dưỡng sẽ có màu hồng Ghi lại kếtquả

* Với thuốc nhuộm Fuschin, HCl 0,5, H2SO4 1% và xanh methylene

- Làm vết bôi trên mọt phiến kính sạch và để khô tự nhiên

- Nhỏ vài giọt HCl 0.5% lên vết bôi, hơ nóng trên ngọn lửa đèn cồn cho bốc hơi trong

2 phút rồi rửa với nước

- Nhuộm vết bôi với thuốc nhuộm Fuschin, qua miếng giấy lọc, hơ nóng cho đến khibốc hơi trong vòng 5 phút

- Rửa vết bôi bằng nước

- Tẩy màu bằng dung dịch H2SO4 1% trong 2 phút

- Rửa vết bôi bằng nước

- Nhuộm vết bôi bằng xanh methylene trong 5 – 15 phút

- Rửa lại với nước và để khô tự nhiên

- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100) Bào tử sẽ có màu xanh còn tếbào sinh dưỡng sẽ có màu xanh Ghi lại kết quả

* Với thuốc nhuộm Xanh methylene và đỏ trung tính

- Làm vết bôi trên một phiến kính sạch

- Cố định tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn

- Nhuộm xanh methylene trong 1 phút có hơ nóng từ bên dưới

- Rửa vết bôi bằng nước cho đến khi hết màu

- Nhuộm với đỏ trung tính 0.5% trong 1 phút

- Rửa lại bằng nước, để khô

- Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu (x100).Bào tử sẽ có màu xanh còn tế bàosinh dưỡng sẽ có màu đỏ Ghi lại kết quả

Hình Quy trình nhuộm bào tử

f Phương pháp nhuộm tiêm mao

Tiên mao là cơ quan di động của vi khuẩn Tiêm mao có kích thước rất mỏng, chiềurộng khoảng 0,01-0,05 μm, chiều dài thay đổi tùy loài

Một số loài có một tiên mao (đơn mao), một số loài mỗi đầu có một sợi (song mao),một số có một chùm ở một đầu hoặc mỗi đầu (chùm mao) và một số khác có tiên mao mọckhắp xung quanh tế bào (chu mao)…

Nhỏ malachite green làm ướt giấy lọc và đun sôi 5 phút

Rửa với nước 30s

Rửa với nước 30s

Bổ sung safranin 60-90s

Làm khô với giấy mềm

Vì tiên mao rất mảnh nên phải nhuộm bằng phương pháp đặc biệt với nguyên tắc làtăng đường kính của tiên mao bằng cách trầm hiện hóa chất và thuốc nhuộm trên tiên mao.Thao tác phải rất nhẹ nhàng, thận trọng Thường sử dụng hỗn hợp thuốc nhuộm NishizawaKangen Quy trình nhuộm như sau:

- Chuẩn bị giống vi khuẩn nuôi trên môi trường thạch 16-18 giờ

- Chuẩn bị vết bôi vi sinh vật trên lame kính

- Để vết bôi khô tự nhiên trong không khí, không được đốt

- Nhuộm bằng dung dịch A trong 15 phút

- Rửa lame kính để làm sạch thuốc nhuộm: đặt nghiêng lame kính vào một cố nướcđầy Nghiêng cốc nước về phía tấm kính để vòng thuốc nhuộm tách xa lame kính và rút từ từlame kính lên

- Nhuộm bằng dung dịch B trong 10-15 phút Theo dõi đến khi thấy vết bôi bắt đầunâu rõ thì dừng lại

- Nhúng từ từ lame kính vào một cốc nước sạch, giữ 30 giây rồi lấy lame kính ra như ởtrên

- Vỏ nhầy của một số vi khuẩn có ảnh hưởng đến kết quả nhuộm Gram Để nhuộmGram cần nuôi chúng trong các môi trường chứa ít đường để hạn chế việc hình thành vỏ nhầy

- Khử màu là bước quan trọng và cần kĩ năng nhất định, vì khả năng bắt màu Gramdương không phải là "tất cả hoặc không"

- Không được hơ tấm lam có vết bôi vi sinh vật quá nóng trên ngọn lửa, có thể làmcháy và làm thay đổi hình dạng tế bào vi sinh vật

5 Báo cáo thực tập

- Sau khi nhuộm, vi khuẩn Gram dương có màu xanh đen hay tím, Gram âm có màu

đỏ vàng hay đỏ tía Giải thich nguyên nhân?

- Nếu không nhuộm bổ sung thuốc nhuộm safranin hoặc fuchsin, vi khuẩn Gram âm

có màu gì? Tại sao?

- Vẽ hình thị trường kính hiển vi có vi sinh vật trong trường hợp nhuộm vi sinh vậtkhông cố định và nhuộm vi sinh vật cố định?

BÀI 6 PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP VI SINH VẬT

1 Nguyên tắc

Phân lập vi khuẩn là một quá trình tách rời một loại vi sinh vật từ quần thể vi sinh vật,sau đó gieo chúng lên bề mặt môi trường thạch dinh dưỡng chọn lọc Sau khi ủ ở các điềukiện thích hợp các vi vi sinh vật sẽ phân chia nhiều lần tạo thành những quần thể mọc riêngbiệt gọi là khuẩn lạc Một ít tế bào hoặc bào tử trong khuẩn lạc được cấy truyền vào ống môitrường giữ giống và ủ ở các điều kiện thích hợp để chúng phát triển thành quần thể mới Quầnthể vi sinh vật trong ống nghiệm này được gọi là một chủng vi sinh vật hoặc là ống giống.Đây là một khâu có ý nghĩa rất quan trọng trong việc nghiên cứu và ứngdụng vi sinh vật

Chủng vi sinh vật thuần khiết (hay còn gọi là chủng sạch) được hiểu là thế hệ con,cháu, dòng có nguồn gốc từ một tế bào riêng lẻ Các chủng vi sinh vật được thu nhận từ khuẩnlạc phân lập lần đầu chưa chắc đã thuần khiết vì một khuẩn lạc có thể được hình thành bởimột hoặc nhiều tế bào, bào tử, vì thế phải làm sạch nhiều lần mới thu được chủng vi sinh vậtthuần khiết

Quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết: Với hầu hết các loại mẫu nghiêncứu, quá trình phân lập vi sinh vật ở dạng thuần khiết gồm các bước cơ bản sau:

- Lựa chọn nguồn phân lập vi sinh vật

- Tạo ra các khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật ban đầu

- Phân lập vi sinh vật thuần khiết

- Kiểm tra độ tinh khiết của các khuẩn lạc

2 Dụng cụ, môi trường và hóa chất

2.1 Dụng cụ

STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú

STT Tên dụng cụ, thiết bị mỗi nhóm (3 sinh viên) Đơn vị tính Số lượng Ghi chú

2.2 Môi trường và hoá chất

- Môi trường cao thịt – pepton: dùng để nuôi cấy và phân lập vi khuẩn

- Môi trường Hansen: dùng để nuôi cấy và phân lập nấm men

- Môi trường Czapeck: dùng để nuôi cấy và phân lập nấm mốc

- Một số chủng nấm mốc như Aspergillus oryzae, Aspergillus niger và Mucor…có thể

phân lập các loài nấm mốc này trên cơm nguội, xôi làm mốc tương, bánh mì để khô ít ngày

- Thông qua màu sắc của mốc để nhận diện

+ Mốc có màu trắng: Có thể là Mucor hay Rhizopus.

+ Mốc có màu đen là Aspergillus niger.

+ Mốc có màu xanh lục là Penicillium italicum Loại mốc này thường có trên

vỏ cam, chanh để lâu ngày

b Nguồn phân lập nấm men

- Có thể phân lập nấm men dễ dàng từ các môi trường như: bề mặt trái cây và dịch épmột số trái cây như táo, lê, nho, dâu, mơ, dứa, trong rượu nếp, trong các bánh men rượu, trongbia, trong nước mía, trong hạt kefia

- Nấm men này khi quan sát trên kính hiển vi thường có dạng hình cầu hay hình trứng

Tế bào có kích thước lớn, có khả năng nảy chồi Khuẩn lạc cho màu trắng sữa

c Nguồn phân lập vi khuẩn

- Có thể phân lập vi khuẩn từ đất, nước giải khát (nước mía), nước thải, thực phẩm

tươi (thịt, cá, sữa tươi, rau quả tươi…), thực phẩm bị ôi thiu…

Hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn trên môi trường thạch

3.2 Kỹ thuật cuôi cấy tạo khuẩn lạc riêng rẽ từ quần thể vi sinh vật trên các môi trường phân lập

+ Cấy mẫu trên môi trường đặc trưng của nó

- Nếu nguồn mẫu phân lập ở dạng lỏng có thể cấy trực tiếp hoặc pha loãng để làmgiảm mật độ

Hình Kỹ thuật pha loãng thập phân

b Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn các vi sinh vật hiệu khí

- Có nhiều kỹ thuật ria khác nhau để thực hiện hộp ria và tạo khuẩn lạc đơn Một số

kỹ thuật ria thường dùng: kỹ thuật ria chữ T, kỹ thuật ria bốn góc, kỹ thuật ria tia, kỹ thuật rialiên tục

Thao tác kỹ thuật tạo khuẩn lạc đơn được thực hiện như sau:

* Kỹ thuật hộp ria

- Dùng que cấy vòng thao tác vô trùng thu giống

- Ria các đường trên đĩa pêtri chứa môi trường thích hợp (ria chữ T và ria bốn góc).Sau mỗi đường ria, đốt khử trùng đầu que cấy và làm nguội trước khi thực hiện đường ria tiếptheo

- Bao gói đĩa pêtri, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủ ấm

Hình Kỹ thuật hộp ria

* Kỹ thuật hộp trải

- Dùng micropipette và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 0,1 ml dịch chứagiống vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri

- Nhúng đầu thanh gạt (que trải) thuỷ tinh vào cồn 70o, hơ qua ngọn lửa để khử trùng

Để đầu thanh gạt nguội trong không gian vô trùng của ngọn lửa

- Mở đĩa pêtri, đặt nhẹ nhàng thanh gạt lên bề mặt thạch của đĩa petri Dùng đầuthanh gạt xoay, trải đều dịch giống lên bề mặt thạch Trong khi trải, thực hiện xoay đĩa mộtvài lần, mỗi lần khoảng 1/2 chu vi đĩa tạo điều kiện cho thanh gạt trải dịch giống đều khắp bềmặt môi trường

- Rút thanh gạt khỏi đĩa, đậy đĩa, gói và ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợp trong tủấm

* Kỹ thuật hộp đổ

- Dùng micropipette và đầu típ vô trùng, thao tác vô trùng chuyển 1 m dịchchứa giống

vi sinh vật lên bề mặt môi trường trong đĩa pêtri

- Đổ khoảng 15 - 20 ml môi trường đã đun chảy và để nguộ đến 45 - 550C vào đĩapetri đã cấy mẫu

- Xoay nhẹ đia petri cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần để dung dịchgiống được trộn đều trong môi trường cấy

- Đậy nắp đĩa pêtri, để đông tự nhiên

c Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn các vi sinh vật kị khí

- Dùng môi trường đặc trong ống nghiệm đem chưng cách thuỷ để loại bỏ không khítrong môi trường

- Để nguội môi trường còn 45 - 500C

- Hút 0,1 ml dịch nghiên cứu cho vào ống môi trường, đậy nút lại, lắc tròn quanh trụcống nghiệm

- Rót nhanh môi trường ở ống nghiệm vào nắp dưới của đĩa pêtri và đậy thật nhanhnắp trên lại, sao cho giữa mặt nắp và môi trường không còn khôngkhí

- Dùng parafin hàn kín phần tiếp xúc giữa 2 nắp của đĩa petri và ủ ở nhiệt độ thíchhợp

- Nuôi trong bình yếm khí: sau khi cấy vi khuẩn xong, cho vào bình yếm khí Thoamột lớp parafin lỏng lên miệng bình, đốt đèn cồn hay đèn cầy lên và đặt vào bình, đậy nắplại, hoặc dùng máy hút chân không hoặc dùng túi kỵ khí Cho vào tủ ấm, ủ ở nhiệt độ và thờigian thích hợp

- Sau khi vi sinh vật phát triển, chọn các khuẩn lạc riêng rẽ trong khối môi trường,dùng que cấy cắt cả khối môi trường rồi cấy vào môi trường lỏng thích hợp