Sản xuất protein g CSF

Trang 1

SẢN XUẤT PROTEIN G-CSF

Granulocyte-colony stimulating factor

Nhóm 3

Trang 2

Giới thiệu về GCSF và các đặc điểm

I

Tạo dòng vi sinh vật biểu hiện GCSF tái tổ hợp

Quy trình lên men

Trang 3

Hóa trị (điều trị ung

thư)

Hóa trị (điều trị ung

thư)

Bạch cầu giảm (Bệnh Neutropania)

 G-CSF(Granulocyte-Colony Stimulating Factor) chức năng kích thích nguyên bào tủy tái sinh, phát triển và

biệt hóa tạo bạch cầu hạt trung tính.

 Bối cảnh:

Trang 4

I/ Giới thiệu G-CSF và các đặc điểm

G-CSF giúp tế bào gốc máu biệt hóa thành tế bào bạch cầu hạt trung tính

Trang 5

1 Đặc điểm gen

Mã hóa cho hai mRNA khác nhau

Thuộc locut q21-22

Gồm 5 exon và 4 intron Kích thước: 2.5 Kb

Trang 6

Glu, Ser, Val

Trang 8

b Cấu trúc không gian ba chiều

Cấu trúc protein G-CSF

A Mô hình cấu trúc phẳng B Cấu trúc không gian

- 4 xoắn α đối song và xoắn trái

- Một xoắn phụ nhỏ nằm trong vùng vòng nối giữa xoắn A và xoắn B

Trang 10

II/ Nghiên cứu tạo dòng vi sinh vật biểu hiện G-CSF tái tổ hợp

Trang 11

1/ Hệ thống tế bào chủ

 Hệ thống TB chủ nào phù hợp?

Quy trình sản xuất:

_ Tốc độ tăng trưởng tb chủ cao

_ Dễ kiểm soát quy trình uôi cấy

_ Lượng G-CSF được tạo ra lớn

x x x

x x Không đạt

Biến đổi G-CSF sau dịch mã

Trang 12

 Tại sao không chọn các chủng chủ khác như động vật hữu nhũ hoặc tế bào côn trùng?

• Tế bào chuyển gen không ổn đinh.

• Glycolsyl hóa không ảnh hưởng tới hoạt tính GCSF không cần sử dụng tế bào ĐV

• Quá trình nuôi cấy và chuyển gene phức tạp.

• Thời gian nuôi cấy lâu

Trang 13

Các chiến lược biểu hiện

E coli

Dạng tiết ra ngoại bào

P pastoris

Dạng thể vùi trong tế bào chất

Dạng tan trong tế bào chất

Dạng tiết ra chu chất

1/ Hệ thống tế bào chủ

Trang 14

2/ Tối ưu hóa và dung hợp gen với các phần phụ

2.1/ Tối ưu hóa gen mục tiêu

Trình tự gen G-CSF người được lấy từ ngân hàng gen trên NCBI

-> cần tối ưu hóa để có thể biểu hiện trên E coli và P pastoris.

o Dùng phần mềm tin sinh học để phân tích, thay đổi vài codon dựa theo tần số sử dụng codon ở tế bào chủ biểu hiện:

• g-csfmE : tế bào chủ biểu hiện gene là E coli

• g-csfmY : tế bào chủ biểu hiện gene là P pastoris

o Đánh giá độ tương đồng của protein G-CSF được dịch mã so với protein ban đầu

Trang 15

2.2/ Dung hợp gen với các phần phụ

Các gen sẽ được dung hợp thêm với các thành phần đề phù hợp với 4 chiến lược biểu hiện:

Trang 16

Chiến lược Thành phần Plasmid bổ sung

Thể vùi

6HIS: thẻ tinh chế TEV: trình tự nhận biết của TEV

protease

protein trong E coli

plasmid pDnaK: chứa gen

mã hóa cho chaperone DnaK hỗ trợ gấp cuộn

Trang 17

a Thể vùi: Do E coli không có chaperon gấp cuộnprotein không tantạo thể vùi.

Việc loại bỏ thẻ HIS ảnh hưởng tới hiệu suất thu nhận protein

Tiến hành nghiên cứu theo hai hướng:

 Có thẻ HIS

 Không có thẻ HIS

b Tan trong tế bào chất:

Trang 18

c Tiết ra chu chất:

• Giúp protein được nhận diện bởi hệ thống vận chuyển màng

• Giúp protein giữ được cấu trúc sơ cấp trong suốt qúa trình vận chuyển.

Chức năng của SP

Oxi hóa: hình thành cầu nối disulfide giữa các cysteine

Đồng phân hóa: sửa chữa các cầu nối không chính xác

Vai trò của họ protein Dsb

Trang 19

Trang 20

1 Quy mô

III QUY TRÌNH LÊN MEN

Trang 21

Tổng lượng protein thu được trong các pha chưa

G-CSF của 1 lít dịch lên men (g)

Tiến hành đo và so sánh các dạng biểu hiện:

 Kết quả: xác định được dạng biểu hiện G-CSF ở thể vùi trong tế bào chất) là tối ưu nhất.

Trang 22

2 Phương pháp thu và phá vỡ tế bào, thu nhận chu chất

a Phương pháp thu tế bào

Hai phương thức thu sinh khối đối với E.coli được dùng rộng rãi:

 ly tâm

 lọc tiếp tuyến.

 lọc tiếp tuyến giảm thể tích ở giai đoạn ban đầu và ly tâm thu nhận sinh khối ở giai đoạn sau

Trang 23

Phương thức thu sinh khối bằng phương pháp lọc tiếp tuyến (bên phải)

Trang 24

b Phá vỡ tế bào và thu nhận chu chất

Các phương pháp phá màng: máy phá tế bào, sử dụng dung môi, sử dụng các loại enzyme …

Nhược điểm: giá thành cao, chỉ áp dụng cho mẫu nhỏ!

Phương pháp tối ưu: công nghệ bơm dịch treo tế bào dưới áp lực qua một khe nhỏ.

Thu nhận chu chất: sử dụng sốc thẩm thấu

Trang 25

Chu chất của vi khuẩn gram âm (hình dưới)

• Tế bào chỉ bị phá vỡ lớp màng ngoài (outer membrane)

• Màng trong (plasma membrane) vẫn không bị vỡ  chỉ protein ở chu chất (periplasmic space) được giải phóng

Thu nhận G-CSF ở chu chất bằng sốc thẩm thấu

Trang 26

IV TINH CHẾ

Từ Thể Vùi Không tan trong nội bào, gấp cuộn không chính xác

• Phương pháp: Ly tâm thu tủa  rửa tủa

• Cần quá trình tái gấp cuộn  pha loãng và thẩm

tích trong dd tái gấp cuộn

1 Tinh chế trung gian

Nguyên lý chung của quá trính tái gấp cuộn:

• Dd protein được pha loãng trong lượng lớn dd tái gấp cuộn.

• Dd tái gấp cuộn có thế oxi hóa- khử thích hợp cho việc tái gấp cuộn protein.

Vấn đề: sự kết cụm protein (do tương tác kị nước liên phân tử của các dạng tái gấp cuộn trung gian)

 Giải pháp: ngăn ngừa các liên kết kị nước bằng cách pha thật loãng dung dịch hòa tan protein trong dung dịch tái gấp cuộn

Trang 27

IV TINH CHẾ

Phương pháp thẩm tích dùng trong quá trính tái gấp cuộn

Trang 28

IV TINH CHẾ

Từ TB Chất

Từ Môi Trường

Tan, đã gấp cuộn chính xác

Tan ở ngoại bào, đã gấp cuộn chính xác

• Phương pháp: phá vỡ TB hoặc màng ngoài, ly tâm thu dịch nổi

• Phương pháp: ly tâm loại bỏ sinh khối

Từ Chu Chất

Trang 29

IV TINH CHẾ

• Trường hợp có thẻ His: dùng sắc

kí ái lực

• Trường hợp không có thẻ His: do

4 His và 1 Cys được đưa ra bề mặt,

trong đó, 2 His số 52 và 156 nằm kế

nhau  có thể dùng sắc kí ái lực

• Dùng sắc kí trao đổi cation

Lý do: sau quá trình tái gấp cuộn, pH của dd bằng 4.0 < pI của GCSF (5.5

- 6.1)  GCSF tích điện dương

2 Tinh chế hoàn tất

Trang 30

Tối ưu hóa gen

Tóm Tắt Quy Trình

Trang 31

Biểu hiện gen

Trang 32

Tinh chế và kiểm tra hoạt tính

Trang 33

Tài liệu tham khảo

• Báo cáo tổng hợp kết quả khoa công nghệ đề tài nghiên cứu công nghệ sản xuất Granulocyte-Colony Stimulating Factor (G-CSF) người tái tổ hợp để hỗ trợ điều trị bệnh giảm bạch cầu hạt- Trường ĐH Khoa

học Tự Nhiên, ĐH Quốc Gia Tp HCM, TS Võ Minh Trí, 2010

• Tạo dòng và biểu hiện protein G-CSF ở người bằng các hệ thống biểu hiện khác E.coli- Liên Thúy Linh,

Trang 34

Thank You !

Định dạng
Số trang	34
Dung lượng	2,51 MB