Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ đông lạnh tinh dịch chó berger bảo tồn ở 196 oc

Công nghệ đông lạnh tinh dịch chó và phương pháp thụ tinh nhân tạo cho chó được cho là giải pháp hiệu quả với những khó khăn trong công tác lưu giữ và phát triển đàn chó thuần chủng đã đ

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

Lời cảm ơn

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới người thầy của tôi TS Đỗ Văn Thu người đã hướng cho tôi những ý tưởng khoa học, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể phòng Sinh học tế bào sinh sản, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa học và luận văn này

Tôi xin trân trọng cảm ơn tập thể cán bộ công nhân viên Cục Quản lý, huấn luyện và sử dụng chó ngiệp vụ - Bộ Công an đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện nghiên cứu này

Tôi xin cảm ơn tất cả các thầy cô giáo Đại học Thái Nguyên Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam

đã dạy dỗ, chia sẻ, động viên, giúp tôi vượt qua mọi khó khăn để hoàn thành tốt khóa học và nghiên cứu của mình

Cuối cùng, tôi xin tỏ lòng biết ơn đến bố mẹ, gia đình, bè bạn, những người luôn bên tôi, động viên, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Tác giả

Trần Xuân Khôi

Lời cam đoan

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các đồng sự khác Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Tác giả

Trần Xuân Khôi

MỤC LỤC

MỤC LỤC i

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC BẢNG vii

DANH MỤC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

Mục tiêu 2

CHƯƠNG I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU 3

1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 3

1.1 Nghiên cứu sinh học tinh dịch và môi trường bảo tồn 4

1.2 Thụ tinh nhân tạo sử dụng tinh đông lạnh 10

2 Tình hình phát triển và sử dụng chó Berger ở Việt Nam 11

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP 13

1 Đối tượng nghiên cứu 13

2 Nội dung nghiên cứu 14

2.1 Đánh giá một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý hóa học của tinh dịch chó Berger 14

2.2 Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Berger và ứng dụng sản xuất tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196 C 14

2.2.1 Nghiên cứu về môi trường 14

2.2.2 Nghiên cứu điều hòa cân bằng nhiệt 14

2.3 Sản xuất tinh chó Berger đông lạnh 15

2.3.1 Theo dõi chất lượng tinh chó Berger đông lạnh trong quá trình bảo tồn ở -196 0 C 15

2.3.2 TTNT cho chó Berger để thử nghiệm tinh đông lạnh sản xuất được 15

3 Phương pháp nghiên cứu 15

3.1 Phương pháp lấy tinh: 15

3.2 Phương pháp nghiên cứu sinh học tinh dịch chó 16

3.2.1 Lượng tinh dịch (V) 16

3.2.2 Hoạt lực tinh trùng (A) 16

3.2.3 Nồng độ tinh trùng (C) 16

3.2.4 Tổng số tinh trùng tiến thẳng (V.A.C) 17

3.2.5 Tỷ lệ tinh trùng sống (LS) 18

3.2.6 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình (K) 18

3.3 Nghiên cứu môi trường bảo tồn 19

3.3.1 Xác định pH 19

3.3.2 Áp lực thẩm thấu (posm) 19

3.3.3 Tỷ trọng (d) 19

3.3.4 Độ nhớt ( ) 19

3.3.5 Năng lực đệm ( ) 20

3.3.6 Môi trường đông lạnh tinh dịch chó ở -196 0 C 21

3.3.7 Đông lạnh tinh dịch chó ở -196 0 C 21

3.3.8 Phương pháp TTNT chó Berger sử dụng tinh đông lạnh 26

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀO THẢO LUẬN 29

1 Sinh học tinh dịch chó Berger 29

1.1 Một số đặc điểm sinh học tinh dịch chó berger 29

1.2 Tính chất lý hóa của tinh dịch chó Berger 34

2 Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ đông lạnh tinh dịch chó và ứng dụng sản xuất tinh chó Berger đông lạnh bảo tồn ở -196 C 36

2.1 Tính chất hóa - lý của một số môi trường đông lạnh tinh dịch 36

2.2 Ảnh hưởng của glycerol và dimethyl sulfoxide(DMSO) lên chất lượng tinh dịch chó Berger 36

2.3 Ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên chất lượng tinh dịch 38

2.4 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung phần môi trường có glycerol lên chất lượng tinh đông lạnh. 40

2.5 Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên phẩm chất tinh đông lạnh 42

2.6 Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh 44

2.7 Ảnh hưởng của tốc độ giải đông lên phẩm chất tinh đông lạnh 45

2.8 Kết quả sản xuất đông lạnh tinh dịch của chó 47

2.8.1 Hoạt lực tinh trùng trong quá trình đông lạnh 47

2.8.2 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong quá trình đông lạnh 48

2.8.3 Tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh 49

2.9 Kết quả kiểm tra định kỳ chất lượng tinh chó đông lạnh 50

2.9.1 Hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng chó đông lạn trong thời gian bảo tồn ở -196 0 C 50

2.9.2 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -196 0 C 51

2.10 Đánh giá chất lượng tinh đông lạnh - giải đông ủ ở 370 C 52

2.10.1.Hoạt lực tinh trùng sau giải đông ủ ở 37 0 C 52

2.10.2.Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông ủ ở 37 0 C 53

2.10.3.Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông ủ ở 37 0 C 54

3 Kết quả thụ tinh nhân tạo cho chó Berger 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 58

1 Kết luận 58

2 Kiến nghị 58

TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

Tài liệu trong nước 59

Tài liệu nước ngoài 59

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT : Năng lực đệm

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1: Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch chó Berger (n=40) 29

Bảng 2: Tính chất lý hóa của tinh dịch chó Berger (n= 40) 34

Bảng 3 Một số tính chất hoá - lý của các môi trường đông lạnh tinh dịch 36

Bảng 4 So sánh ảnh hưởng của glycerol và DMSO lên chất lượng tinh dịch 37 Bảng 5 Ảnh hưởng của nồng độ glycerol trong môi trường lên chất lượng tinh đông lạnh 39

Bảng 6 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung môi trường có glycerol lên chất lượngtinh chó đông lạnh 41

Bảng 7 Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước đông lạnh lên phẩm chất tinh đông lạnh 43

Bảng 8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên chất lượng tinh đông lạnh 44

Bảng 9 Ảnh hưởng của tốc độ giải đông (nhiệt độ và thời gian) lên chất lượngtinh đông lạnh 45

Bảng 10 Hoạt lực tinh trùng trong quá trình đông lạnh 48

Bảng 11 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình trong quá trình đông lạnh 48

Bảng 12 Tỷ lệ sống của tinh trùng trong quá trình đông lạnh 49

Bảng 13 Hoạt lực tinh trùng của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -1960C 50

Bảng 14 Tỷ lệ tinh trùng kỳ hình của tinh đông lạnh trong thời gian bảo tồn ở -1960C 51

Bảng 15 Hoạt lực tinh trùng sau giải đông ủ ở 370C 52

Bảng 16 Tỷ lệ sống của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông ủ ở 370C 53

Bảng 17 Tỷ lệ kỳ hình của tinh trùng sau đông lạnh - giải đông ủ ở 370C 54

Bảng 18: Kết quả thụ tinh nhân tạo bằng tinh chó Berger đông lạnh 57

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Chó Berger đực tham gia nghiên cứu 13

Hình 2 Tinh trùng sống - chết 32

Hình 3 Tinh trùng kỳ hình của chó Berger 33

Hình 4 Ảnh hưởng của chất bảo vệ lạnh lên hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh 38

Hình 5 Ảnh hưởng của nồng độ glycerol lên hoạt lực tinh trùng trước và sau đông lạnh 40

Hình 6 Ảnh hưởng của thời điểm bổ sung môi trường có glycerol lên hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh 42

Hình 7 Ảnh hưởng của thời gian ủ tinh dịch trước khi đông lạnh lên hoạt lực tinh trùng 44

Hình 8 Ảnh hưởng của nhiệt độ đông lạnh lên hoạt lực của tinh trùng 45

Hình 9 Chó Berger mang thai nhờ TTNT 56

Hình 10 Chó con sinh ra nhờ TTNT 56

MỞ ĐẦU

Từ xa xưa chó luôn là loài gần gũi và gắn bó với con người nhất trong tất cả các loài động vật Nhờ các đặc điểm nổi bật hơn các loài vật khác, chó được sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực phục vụ con người Ngày nay, một số giống chó đã được huấn luyện, biệt hóa trở thành chó nghiệp vụ phục vụ cho công tác an ninh, quốc phòng Trong đó, chó Berger nổi bật hơn cả bởi lòng dũng cảm, trí thông minh, sự trung thành tuyệt đối và khả năng học tập tiếp thu cao

Chó Berger thuộc nhóm chó chăn gia súc, ban đầu được gây giống để chăn cừu Do có sức lực, thông minh và có khả năng tuân thủ mệnh lệnh trong huấn luyện, chúng thường được dùng trong lực lượng cảnh sát và quân sự Vì chúng rất trung thành và có bản năng bảo vệ chủ, Chó Berger là một trong các loài chó được yêu thích nhất trên toàn thế giới

Giống chó Berger Việt Nam là con lai hỗn hợp từ chó Berger Trung Quốc (được nhập từ những năm 1960), Berger Liên Xô và CHDC Đức (nhập

từ những năm 1970, 1980) Đây là hai giống chó chủ lực, được huấn luyện trang bị cho các đơn vị, quản lý sử dụng chó nghiệp vụ của công an các tỉnh, thành phố và các cơ sở giam giữ thuộc ngành Công an và các đồn biên phòng, cửa khẩu của lực lượng Bộ đội biên phòng Ngoài ra, hiện nay chúng ta còn

có thêm giống chó Berger Bỉ thuần chủng được nhập khẩu và nuôi dưỡng tại Cục Quản lý, huấn luyện và sử dụng chó nghiệp vụ (C69) – Bộ Công an

Đàn chó Berger hiện tại ở nước ta có hàng nghìn con được nuôi tại Cục Quản lý, huấn luyện và sử dụng chó nghiệp vụ - Bộ Công an, trường D24 Bộ đội biên phòng, và khá nhiều trong khu vực nhân dân Tại C69, hiện nay đang nuôi dưỡng và huấn luyện một đàn chó Berger tương đối thuần nhưng số lượng không nhiều Trong khu vực nhân dân, chúng khá phổ biến và được dùng trong việc bảo vệ, trông nhà và làm kinh tế Tuy nhiên, chúng bị lai tạp khá nhiều và không được chọn lọc do việc nhân giống tự phát của

người dân Xét về số lượng, đàn chó Berger nước ta có số lượng lớn, nhưng

do chưa có một hệ thống nhân giống theo quy hoạch nên đã làm mất đi nhiều đặc điểm quý báu và khả năng vốn có của giống chó này Mặt khác, hiện nay việc nhập khẩu chó Berger thuần chủng gặp rất nhiều khó khăn do giá thành rất cao (10.000 – 15.000 USD/con) và khả năng thích nghi của chó với điều kiện khí hậu nước ta chưa cao

Công nghệ đông lạnh tinh dịch chó và phương pháp thụ tinh nhân tạo cho chó được cho là giải pháp hiệu quả với những khó khăn trong công tác lưu giữ và phát triển đàn chó thuần chủng đã được các nhà khoa học thuộc Phòng Sinh học tế bào sinh sản, Viện Công nghệ sinh học tiến hành nghiên cứu từ những năm 2005 Trải qua gần 1 thập kỉ nghiên cứu và phát triển, các nhà khoa học đã cho ra những kết quả nghiên cứu vô cùng khả quan và từng bước đang hoàn thiện những kết quả nghiên cứu của mình Tuy nhiên, những kết quả nghiên cứu về đông lạnh tinh dịch chó hiện vẫn áp dụng cho tất cả các giống chó nghiên cứu Do vậy, việc có một nghiên cứu chuyên sâu để hoàn thiện được công nghệ đông lạnh tinh dịch cho từng giống chó là rất cần thiết

để có thể nâng cao hiệu quả của việc lưu giữ và bảo tồn tinh dịch chó

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đòi hỏi, tiếp nối từ những nghiên cứu của các bậc tiền bối đi trước, tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Berger bảo tồn ở -1960C ”

Mục tiêu

Hoàn thiện công nghệ đông lạnh tinh dịnh chó Berger để sản xuất và bảo tồn tinh dịch chó Berger ở -1960C phục vụ cho công tác an ninh, quốc phòng

CHƯƠNG I TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU

1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Chó Berger là một giống chó tương đối mới, phát sinh từ năm 1899 tại

Đức Chó Berger thuộc nhóm chó chăn gia súc, ban đầu được gây giống để chăn cừu Do có sức lực, thông minh và có khả năng tuân thủ mệnh lệnh trong huấn luyện, chúng thường được dùng trong lực lượng cảnh sát và quân sự Vì chúng rất trung thành và có bản năng bảo vệ chủ, Chó Berger là một trong các

loài chó được yêu thích nhất trên toàn thế giới

Chó Berger được sinh sản và phát triển nhanh vì sự thông minh đặc biệt của nó, một đặc tính đã làm cho nó nổi danh Nó được coi là loài chó thông

minh thứ ba, chỉ đứng sau Border Collie và Poodle Trong quyển The Intelligence of Dogs, tác giả Stanley Coren đánh giá loài chó này đứng thứ ba

về trí thông minh Ông nhận thấy chúng có khả năng học các nhiệm vụ đơn giản chỉ sau năm lần nhắc lại mệnh lệnh, và tuân thủ lệnh đầu tiên trong 95% trường hợp Cùng với sức vóc, đặc tính này khiến cho chúng được ưa chuộng

sử dụng làm chó cảnh sát, chó bảo vệ và chó cứu hộ, vì chúng có khả năng học nhanh chóng các nhiệm vụ khác nhau và hiểu hướng dẫn tốt hơn các loài chó khác Chúng rất có tiếng trong ngành cảnh sát, sử dụng để lần theo dấu tội phạm, tuần tra các khu vực mất an ninh, phát hiện và kiềm chế tội phạm Thêm vào đó, hàng ngàn Chó Berger được sử dụng bởi quân đội Chúng thường được sử dụng để trinh sát, cảnh báo cho binh lính khi kẻ địch xuất hiện hay có mìn bẫy hoặc các hiểm nguy khác Chó Berger cũng được huấn luyện để tham gia nhẩy dù từ máy bay

Ngoài ra, chó Berger là một trong các giống chó hay được sử dụng nhất trong các nhiệm vụ đánh hơi Các nhiệm vụ này bao gồm tìm kiếm và cứu hộ, tìm kiếm xác chết, ma túy, thuốc nổ, chất gây cháy, và nhiều nhiệm vụ khác Chúng rất thích hợp cho nhiệm vụ này, vì khả năng đánh hơi nhạy bén và làm việc tập trung bất kể những gì dễ gây sao nhãng xảy ra xung quanh

Với công tác hỗ trợ, có thời gian chỉ có chó Berger được chọn làm chó dẫn đường cho người mù Là một giống chó linh hoạt thông minh, chúng có khả năng xuất sắc trong nhiệm vụ này nhờ tinh thần trách nhiệm, thần kinh vững vàng, tinh thần dũng cảm và lòng gắn bó với chủ nhân

Hiện nay, Tại một số quốc gia, chó Berger bị chỉ trích là cho nhân giống không kiểm soát chặt chẽ Việc cho nhân giống thiếu cẩn trọng đã tạo điều kiện cho bệnh tật và các khiếm khuyết khác nảy sinh Các vấn đề về gene như nhạt màu, lệch xương chậu, thiếu tinh hoàn, thiếu thần sắc, thiếu răng, trở nên phổ biến, cũng như việc tai gãy hay gập xuống, thậm chí cả khi chó đã trưởng thành

Vì vậy hiện nay chính phủ nhiều nước đã tiến hành những dự án kiểm soát chặt chẽ việc nhân giống của chó Berger để bảo vệ loài chó này

1.1 Nghiên cứu sinh học tinh dịch và môi trường bảo tồn

Nghiên cứu các đặc điểm sinh học tinh dịch của chó có vai trò rất quan trọng, là cơ sở khoa học để pha chế các môi trường pha loãng và đông lạnh tinh dịch thích hợp Căn cứ vào các chỉ tiêu sinh học tinh dịch, có thể đánh giá phẩm chất tinh dịch, giúp tuyển chọn được đực giống có phẩm giống tốt phục

vụ cho thụ tinh nhân tạo và bảo tồn quỹ gen

Kojima E (2001) (dẫn từ Đỗ Văn Thu (2010) [2]) nghiên cứu về đặc điểm tinh dịch chó đã nhận thấy rằng: thể tích tinh dịch và tổng số tinh trùng trong một lần lấy tinh thấp, nhưng nồng độ tinh trùng, hoạt lực, sức sống và hình thái của tinh trùng chó là tương đương với các loài khác Một số chỉ tiêu sinh học tinh dịch đã được nghiên cứu: pH 7,6; thể tích tinh dịch 0,212 ml; nồng độ tinh trùng 361 triệu/ml; tổng số tinh trùng 84 triệu/ml; hoạt lực tinh trùng 77%; sức sống tinh trùng 77%; tỷ lệ tinh trùng kỳ hình 11%

Thông số về các chỉ tiêu sinh học tinh dịch biến đổi khi sử dụng các phương pháp khai thác tinh dịch khác nhau So sánh đặc điểm sinh học tinh dịch chó khi lấy tinh bằng phương pháp kích thích xung điện so với phương

pháp kích thích bằng tay đã cho thấy, nồng độ tinh trùng và tổng số tinh trùng trong một lần lấy tinh theo phương pháp kích thích xung điện thấp hơn so với lấy tinh bằng tay Tuy nhiên, hoạt lực tinh trùng tiến thẳng, sức sống tinh trùng và hình thái tinh trùng đều giống nhau giữa hai phương pháp Tác giả cho rằng, có thể lấy tinh chó bằng kích thích xung điện

Thụ tinh nhân tạo chó đã được Spallanzani (dẫn từ Đỗ Văn Thu (2010) [2]) thực hiện lần đầu tiên vào năm 1779, nhưng cho đến năm 1957 việc đông lạnh tinh dịch chó mới được thực hiện Các nghiên cứu cho thấy, chó có nhiều đặc điểm có lợi cho việc đông lạnh tinh dịch để bảo tồn nguồn gen Goodrone (2000); Watson (2001) (dẫn từ Đỗ Văn Thu (2010) [2]) Ngày nay, các loài chó xám (Canis lupus), chó hung đỏ (Canis rufus), chó Mêhicô (Canis lupus baileyi), chó hoang Mỹ (Lyaon pictus), chó Châu âu (Canis semensis), đều được nghiên cứu sinh sản để tránh nguy cơ tuyệt chủng Việc nghiên cứu bảo tồn tinh dịch chó đã được nhiều nhà khoa học quan tâm Những thành tựu khoa học đạt được trong nghiên cứu bảo tồn tập trung vào một số vấn đề then chốt như: môi trường pha loãng và đông lạnh tinh dịch, thành phần và tỷ lệ các chất tạo môi trường, đặc biệt là các tác nhân chống hiện tượng sốc lạnh của tinh trùng trong quá trình đông lạnh và bảo tồn ở nhiệt độ thấp Kết quả thụ thai khi thụ tinh nhân tạo sử dụng tinh dịch sau giải đông là khá cao Andersen (1976) [4] đã sử dụng môi trường có thành phần Tris - citric acid, lòng đỏ trứng gà 20% và glycerol 8% để đông lạnh tinh dịch Tỷ lệ đẻ do thụ tinh nhân tạo đạt 80,8%, trung bình 3,9 con một lứa Takeishi và cộng sự (1976) (dẫn từ Đỗ Văn Thu (2010) [2]) sử dụng môi trường có chứa 12% sữa tách chất béo, 4% lòng đỏ, 1,2% glucose - Na- Citrate phosphate và 4% glycerol để đông lạnh tinh dịch chó và kết quả là tỷ lệ sinh đạt 75% Rota (2001) [19] đã nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường sữa đến sức sống tinh trùng chó sau giải đông Kết quả cho thấy sữa tách chất béo có ảnh hưởng tốt tương tự môi trường Tris trong bảo tồn tinh dịch chó Môi trường sữa duy trì sức sống tinh trùng tốt hơn so với môi trường có cả sữa và Tris với tỉ lệ 1/1

Tsutsui T (2003) [27] đã nghiên cứu bảo tồn tinh dịch chó trong 3 môi trường khác nhau: EY-Citrate-glycine-glucose; EY Tris-fructose-Citrate(YET- FC); EY-Natricitrate dihydrat(EYCD) Các số liệu ghi lại cho thấy, ở 40C tinh dịch

có chất lượng tốt nhất khi bảo quản trong môi trường EYCD Sau 4 ngày bảo tồn tinh dịch trong môi trường này, hoạt lực tinh trùng tiến thẳng đạt trên 60%

và trên 20% sau 12 ngày

Chất chống sốc lạnh cho tinh trùng trong quá trình đông lạnh và bảo tồn đã giúp cho tinh trùng không bị phá vỡ cấu trúc tế bào khi nhiệt độ hạ thấp, đây là vấn đề đã được nhiều tác giả quan tâm nghiên cứu và thu được nhiều kết quả có ích Chất chống sốc lạnh cho tinh trùng được nghiên cứu và

sử dụng nhiều trong đông lạnh tinh dịch là glycerol và dimethyl sulforxide Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng, chất lượng tinh trùng chó sau đông lạnh không phụ thuộc vào số lần pha glycerol vào môi trường Silva (2003) [23] Các nghiên cứu sử dụng môi trường nước dừa và glycerol ở các nồng độ 4%, 6%

và 8% đã đưa ra kết quả không có sự khác nhau về tỷ lệ sống và tỷ lệ tinh trùng vận động Tuy nhiên, trong môi trường có nồng độ glycerol lớn hơn 6% thì có tỷ lệ tinh trùng kỳ hình thấp nhất Cardoso Rde (2003) [5]

Rohloff (1978) [18] đã nghiên cứu ảnh hưởng của glycerol và DMSO lên phẩm chất tinh trùng trong đông lạnh tinh dịch chó Kết quả thu được là glycerol có tác dụng bảo vệ lạnh tốt hơn so với DMSO Thêm vào đó, việc sử dụng kết hợp hai chất này có ảnh hưởng tốt hơn lên phẩm chất tinh dịch sau đông lạnh so với bổ sung riêng lẻ từng chất với điều kiện tinh pha được ủ ở

50C trong vòng 50 phút Nghiên cứu cũng đưa ra kết luận là bổ sung glycerol 8% và DMSO 1% vào tinh dịch đã pha với môi trường sau đó ủ trong thời gian 30 phút có khả năng bảo quản tinh dịch đông lạnh tốt nhất

Silva AR (2003) [23] đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung glycerol vào môi trường đông lạnh có thành phần cơ bản là Tris- lòng đỏ trứng gà đến chất lượng tinh trùng sau đông lạnh Glycerol được bổ sung một

lần hoặc bổ sung làm 3 lần, khoảng cách giữa các lần là 5 phút Kết quả nhận được là sau đông lạnh hoạt lực tinh trùng tiến thẳng và sức sống của tinh trùng khác nhau không có ý nghĩa giữa hai phương pháp bổ sung glycerol Glycerol có thể bổ sung và môi trường đông lạnh tinh dịch chó một lần hoặc nhiều lần, nhưng bổ sung một lần thuận tiện và dễ áp dụng trong thực tế

Yildiz C (2000) [28] đã chỉ ra rằng các loại đường có ảnh hưởng đáng

kể đến chất lượng tinh trùng trong suốt quá trình cân bằng và đông lạnh Các loại đường glactose, lactose, trehalose, maltose và sucrose được bổ sung vào môi trường bảo quản làm giảm tỷ lệ phần trăm acrosom bị phá huỷ trong các mẫu được cân bằng Sự bổ sung đường không giúp cải thiện sức vận động và khả năng sống sót trong quá trình cân bằng Các disaccarit, ngoại trừ lactose,

đã làm giảm tỷ lệ tinh trùng chết đồng thời làm giảm tỷ lệ acrosom bị phá huỷ sau giải đông Tuy vậy, sự bổ sung này không có tác dụng cải thiện khả năng vận động của tinh trùng sau giải đông

Tsutsui T (2000) [27] nhận thấy bổ sung 0,5 - 1% OEP (orvus Es Paste) vào môi trường đông lạnh tinh dịch chó giúp cải thiện được sức sống của tinh trùng sau giải đông

Milovanov (1962) (dẫn từ Đỗ Văn Thu (2010) [1]) đã nghiên cứu và ứng dụng rất sớm sữa vào môi trường pha loãng tinh dịch, Ngày nay, trên thế giới sữa tách chất béo được sử dụng nhiều trong môi trường pha loãng tinh dịch chó bảo tồn ở nhiệt độ 00

C - 50C trong thời gian vài ngày Ngoài ra, sữa còn được sử dụng trong môi trường đông lạnh tinh dịch chó Sữa tách chất béo rất dễ tìm, là nguyên liêụ rất sẵn lại cho kết quả rất khả quan nên nhiều tác giả sử dụng sữa tách chất béo trong môi trường bảo quản tinh dịch chó: A Lopez- Saez và cộng sự (2000) [3] sử dụng sữa tách chất béo để bảo quản tinh dịch chó ở 50

C cho kết quả tốt đến ngày thứ 5 vẫn đạt A > 50% Pena A (2000) [14]nghiên cứu ảnh hưởng của việc bổ sung Equex vào môi trường Tris, pha loãng tinh dịch theo một và hai bước, đông lạnh theo hai

phương pháp, giải đông ở hai tốc độ khác nhau đến sức sống của tinh trùng chó sau giải đông ở 380

C Kết quả cho thấy bổ sung Equex vào môi trường pha loãng đông lạnh tinh dịch đã có tác dụng tốt lên sức sống tinh trùng sau đông lạnh Pha môi trường với tinh dịch theo hai bước cho sức sống tinh trùng sau đông lạnh cao hơn so với pha một bước Tinh đông lạnh dạng cọng rạ được giải đông ở nhiệt độ 700C trong khoảng thời gian 8 giây

Koutsarova (1997) (dẫn từ Đỗ Văn Thu (2010) [2]) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của pentoxifylline đến sức sống tinh trùng của chó trong tinh tươi và tinh giải đông sau đông lạnh Nồng độ pentoxifylline 0,0036 mol/l hoặc 0,0072 mol/l đã được thêm vào tinh tươi Nồng độ pentoxifylline 0,0072 mol/l đã được thêm vào tinh dịch trước khi đông lạnh Kết quả cho thấy bổ sung pentoxifylline vào môi trường có ảnh hưởng làm tăng đáng kể tỷ lệ tinh trùng tiến thẳng trong tinh tươi và ảnh hưởng có lợi đến việc duy trì hoạt lực trong quá trình đông lạnh tinh dịch chó

Nghiên cứu nhằm xác định ảnh hưởng của tinh thanh đối với sự vận động, sức sống và tính nguyên vẹn acrosom của tinh trùng pha loãng và đông lạnh của Sirivaidyapong (2001) [25] đã chỉ ra rằng, tinh pha loãng bảo tồn ở

40C trong 6 giờ hoặc bảo quản ở 40C trước khi đông lạnh thì hoạt lực tinh trùng, sức sống tinh trùng và tính nguyên vẹn của acrosom khác nhau không

có ý nghĩa thống kê trong điều kiện để tinh thanh hay loại bỏ tinh thanh trước khi pha loãng tinh dịch với môi trường Tuy nhiên hoạt lực tinh trùng và sức sống tinh trùng giảm có ý nghĩa thống kê sau khi đông lạnh tinh dịch khi mà môi trường bảo quản có tinh thanh Tinh thanh được loại bỏ bằng cách ly tâm Tốc độ ly tâm tinh dịch là 720 vòng/phút trong thời gian 5 phút cho hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh tốt nhất (Rijsselaere 2002) [17], Platz CC (1977) [16] đã ly tâm để điều chỉnh nồng độ tinh trùng trước khi thụ tinh, kết quả thu được 92% chó thụ thai Chó con sinh trưởng phát triển bình thường Nghiên

cứu cũng chỉ ra rằng, dịch tiết của tuyến tiền liệt không có ảnh hưởng lên tinh trùng bảo quản ở 4 C, nhưng có ảnh hưởng đối với tinh trùng đông lạnh

Pena A (2000) [14] so sánh tỷ lệ pha loãng giải đông và nồng độ tinh trùng (50.106, 100 106, 200 106, 400 106) trong đông lạnh tinh chó, kết quả sau đông lạnh cho thấy: đông lạnh ở nồng độ tinh trùng 200.106/ml cho kết quả tốt nhất, tỷ lệ pha loãng giải đông 1:4 hoặc 1:2 cho sức sống tinh trùng cao hơn tỷ lệ 1:1

Tốc độ đông lạnh tinh dịch có ảnh hưởng lên chất lượng tinh trùng sau đông lạnh Tác giả Yu (2002) (dẫn từ Đỗ Văn Thu (2010) [2]) khi tiến hành đông lạnh tinh dịch chó với tốc độ giảm nhiệt độ -0,5, -3, -11, -58 hoặc -

209 C/phút đã thấy rằng hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh thấp trong trường hợp tốc độ đông lạnh thấp, hoạt lực cao nhất khi tốc độ giảm nhiệt độ là -

11 C/phút Hoạt lực tinh trùng giảm có ý nghĩa khi tốc độ đông lạnh cao Các phương pháp đông lạnh tinh dịch đã được Nizanski (2001) [13] so sánh trong thí nghiệm đông lạnh tinh dịch dạng viên hoặc dạng cọng rạ loại 0,25 ml hoặc cọng rạ loại 0,5 ml Kết quả cho thấy sau đông lạnh, ở dạng viên hoạt lực tinh trùng tiến thẳng và tỷ lệ tinh trùng có acrosom bình thường cao hơn có ý nghĩa so với dạng cọng rạ có kích thước 0,25 ml, nhưng khác nhau không có

ý nghĩa giữa dạng viên so với dạng cọng rạ 0,5 ml Burgess (2001) (dẫn từ Đỗ Văn Thu (2010) [2]) nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc của tinh trùng trong quá trình đông lạnh tinh dịch cho thấy trong thời gian ủ tinh trùng ở 37 C, tinh trùng không bị thay đổi về cấu trúc, nhưng đông lạnh tinh dịch ở nhiệt độ thấp

đã làm thay đổi cấu trúc tinh trùng, tăng số tinh trùng có acrosom không bình thường, tỷ lệ tinh trùng sống giảm so với trước khi đông lạnh

Tinh đông lạnh được giải đông ở 700C trong 8 giây hoặc 370

C trong 1 phút Sức vận động của tinh trùng được kiểm tra hàng giờ từ lúc giải đông đến

7 giờ sau giải đông, tinh giải đông được ủ ở 38 0C Tính nguyên vẹn của màng

và trạng thái acrosom được đánh giá ở các thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 6 giờ sau

giải đông Sức sống tinh trùng sau giải đông tốt nhất trong trường hợp giải đông tinh đông lạnh ở 370

C trong 1 phút giây

1.2 Thụ tinh nhân tạo sử dụng tinh đông lạnh

Thụ tinh nhân tạo chó bằng tinh đông lạnh trên đá nitơ khô đã thu được kết quả cách đây ba mươi năm Seager (1977) [22] Tuy nhiên tỷ lệ thụ thai thấp hơn so với tinh nguyên Linde-Forsberg (1991) [12] Silva (1996) [24] cho rằng: thụ tinh nhân tạo chó bằng tinh nguyên hoặc tinh đông lạnh, chó cái được thụ tinh kép vào ngày thứ 3 và ngày thứ 5 sau khi xác định được đỉnh của LH Tổng thể tích tinh dịch để phối giống đối với thụ tinh âm đạo là 5ml, đối với thụ tinh dạ con là 2ml Chó cái được thụ tinh bằng tinh đông lạnh đạt

tỷ lệ thụ thai là 60%, chó được thụ tinh với tinh tươi đạt tỷ lệ thụ thai là 100% Fontbonne (1993) (dẫn từ Đỗ Văn Thu (2010) [2]) đã so sánh hai phương pháp thụ tinh âm đạo và thụ tinh dạ con cho chó bằng tinh đông lạnh, kết quả cho thấy thụ tinh dạ con cho tỷ lệ thụ tinh (75,3%) cao hơn có ý nghĩa

so với thụ tinh âm đạo (52,6%) Linde-Forsberg (1993) [10] thụ tinh cho chó bằng tinh tươi và thụ tinh âm đạo, thụ tinh bằng tinh đông lạnh và thụ tinh dạ con Tỷ lệ thụ thai đối với tinh nguyên và tinh đông lạnh tương ứng là 54,7%

và 39% Nếu xác định được chính xác chu kỳ động dục, các tỷ lệ này là 62,3% và 51,1% Tỷ lệ thụ thai ở chó cho phối tự nhiên cao hơn thực sự (88,6%) so với thụ tinh nhân tạo bằng tinh tươi Tỷ lệ thụ thai và số con trong một lứa tăng lên khi phối giống kép so với phối đơn Farstad W (1989) [7] đã tiến hành thụ tinh nhân tạo chó với tinh đông lạnh, hoạt lực tinh trùng sau đông lạnh đạt 60%, thụ tinh đơn và thụ tinh kép với khoảng cách hai lần là 1-

2 ngày, kết quả thu được cho thấy: tỷ lệ thụ thai khi được thụ tinh đơn thấp hơn so với thụ tinh kép (64% so với 69%) Việc xác định đúng thời điểm thụ tinh là cần thiết cho thụ thai khi thụ tinh với tinh đông lạnh Tsutsui (2000) [27] nghiên cứu thụ tinh nhân tạo sử dụng tinh đông lạnh Tinh dịch được đông lạnh trong môi trường có chứa 7% glycerol và 0,7% Orvus ES Paste (OEP) Thụ tinh nhân tạo trong dạ con có tỷ lệ thụ thai cao (90%), số con

trung bình/lứa: 3,6 Chó cái được thụ tinh sử dụng tinh đông lạnh mà trong môi trường không được bổ sung OEP đều không thụ thai Khi thụ tinh âm đạo với các nồng độ khác nhau thấy rằng nồng độ tinh trùng 20.106

có thể đạt được sự thụ thai Nhưng tốt nhất là thụ tinh trong dạ con bằng tinh đông lạnh

mà trong môi trường có bổ sung OEP Linde-Forsberg (1999) [11] đã tiến hành thụ tinh nhân tạo trong tử cung trên 167 chó và thụ tinh âm đạo trên 141 chó Tỷ lệ đẻ sau khi thụ tinh nhân tạo trong tử cung đạt 84,4% cao hơn hẳn

so với thụ tinh âm đạo (58,9%) Số con/lứa cũng có sự khác nhau thực sự, đạt 5,4 - 3,0 con /lứa khi thụ tinh tử cung và đạt 4,0 - 2,7 con/ lứa khi thụ tinh âm đạo Thomassen (2001) [26] đã thử nghiệm thụ tinh nhân tạo cho chó bằng tinh đông lạnh trên 312 con, thuộc 70 giống khác nhau (183 liều tinh nhập ngoại và 129 liều tinh sản xuất trong nước) thu được tỷ lệ đẻ 70%, số con trung bình một lứa là 5,3 con Thụ tinh trong cổ tử cung kết quả tỷ lệ đẻ (71%) cao hơn thụ tinh trong âm đạo (29%) Thời điểm thụ tinh chính xác sẽ cho tỷ lệ đẻ và số con trong một lứa cao hơn Thụ tinh kép cho tỷ lệ đẻ và số con trong một lứa cao hơn thụ tinh đơn Tinh đông lạnh có hoạt lực tinh trùng thấp hơn 50% hoạc tỷ lệ kỳ hình lớn hơn 20% cho tỷ lệ thụ tinh thấp Tinh đông lạnh có hoạt lực tinh trùng lớn hơn 50% hoặc tỷ lệ tinh trùng kỳ hình thấp hơn 20% thu được tỷ lệ mang thai cao hơn Pinto (1999) [15] đã tiến hành thụ tinh nhân tạo chó bằng tinh bảo quả lạnh (bảo quản ở 50C), kết quả đạt được 95% chó cái thụ tinh; số con trung bình một lứa là 7,1, kết quả này không khác nhau so với thụ tinh nhân tạo bằng tinh nguyên

2 Tình hình phát triển và sử dụng chó Berger ở Việt Nam

Năm 1960 chúng ta đã xây dựng đàn chó nghiệp vụ từ các nguồn giống nhập và lai tạo Giống chó đang được sử dụng nhiều và có khả năng nhất là chó Berger Việt Nam

Giống chó Berger Việt Nam là con lai hỗn hợp từ chó Berger Trung Quốc (được nhập từ những năm 1960), Berger Liên Xô và CHDC Đức (nhập

từ những năm 1970, 1980) Đây là hai giống chó chủ lực, được huấn luyện trang bị cho các đơn vị, quản lý sử dụng chó nghiệp vụ của công an các tỉnh, thành phố và các cơ sở giam giữ thuộc ngành Công an và các đồn biên phòng, cửa khẩu của lực lượng Bộ đội biên phòng Giống chó này hiện tại ở nước ta

có tới hàng nghìn con được nuôi tại Cục Quản lý, huấn luyện và sử dụng chó nghiệp vụ của Bộ Công an, trường D24 Bộ đội biên phòng và trong khu vực nhân dân Ngay từ những năm đầu chúng ta đã tiến hành giữ giống thuần, lai tạo cho sinh sản và phát triển Cho tới nay, chúng đã có ngoại hình, thể chất

và năng lực làm việc không kém so với giống gốc ban đầu, chúng đã thích nghi tốt trong điều kiện khí hậu, nuôi dưỡng ở nước ta và đã có những thành tích xuất sắc trong phục vụ chiến dấu Tại Cục Quản lý, huấn luyện và sử dụng chó nghiệp vụ của Bộ Công an có một đàn chó tương đối thuần, nhưng

số lượng rất ít Trong khu vực nhân dân, chúng khá phổ biến và được nuôi dưỡng dùng trong việc bảo vệ và làm kinh tế, nhưng lai tạp khá nhiều và không được chọn lọc do việc nhân giống tự phát Tuy đàn chó Berger có số lượng lớn, nhưng do chưa có một hệ thống nhân giống theo quy hoạch, việc nuôi dưỡng tự phát, do đó đã làm mất đi những đặc điểm, khả năng vốn có của giống chó nổi tiếng thế giới này

Với vai trò quan trọng của chó Berger nói riêng và chó nghiệp vụ nói chung, trong thời gian vừa qua, Phòng sinh học tế bào sinh sản, Viện Công nghệ Sinh học đã được giao nhiệm vụ thực hiện đề tài: “Nghiên cứu công nghệ bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo chó nghiệp vụ của ngành Công an” và “Ứng dụng công nghệ bảo tồn tinh dịch và thụ tinh nhân tạo chó để nhân giống và bảo tồn một số giống chó nghiệp vụ của ngành Công an” do tiến sĩ Đỗ Văn Thu làm chủ nhiệm Kết quả của 2 đề tài trên đã bảo tồn được tinh dịch ở dạng pha loãng và đông lạnh, thành công trong thụ tinh nhân tạo chó góp phần phát triển đàn chó có chất lượng cao phục vụ cho công tác an ninh và Quốc phòng

Tuy nhiên, công nghệ đông lạnh tinh dịch chó hiện nay vẫn được áp dụng trên tất cả các giống chó nghiên cứu Do vậy, việc có được công nghệ đông lạnh tinh dịch dành riêng cho chó Berger việc làm rất cần thiết

CHƯƠNG II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

1 Đối tượng nghiên cứu

- Chó Berger được nuôi tại Cục Quản lý, huấn luyện và sử dụng chó nghiệp vụ (C69) – Bộ Công an Chó đực giống khỏe mạnh, có khả năng khai thác tinh

- Địa điểm nghiên cứu:

+ Phòng Sinh học tế bào sinh sản, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

+ Cục Quản lý, huấn luyện và sử dụng chó nghiệp vụ (C69) – Bộ Công

an

+ Thời gian: tháng 6/2012 – tháng 9/2013

Hình 1 Chó Berger đực tham gia nghiên cứu

2 Nội dung nghiên cứu

2.1 Đánh giá một số chỉ tiêu sinh học và tính chất lý hóa học của tinh dịch chó Berger

- Nghiên cứu, đánh giá một số đặc điểm tinh dịch: lượng tinh dịch, hoạt lực của tinh trùng, nồng độ tinh trùng, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, tổng số tinh trùng tiến thẳng trong lần lấy tinh

- Nghiên cứu, đánh giá tính chất lý - hóa học tinh dịch: áp lực thẩm thấu, năng lực đệm, độ nhớt, tỷ trọng, pH tinh dịch

2.2 Nghiên cứu hoàn thiện công nghệ đông lạnh tinh dịch chó Berger

và ứng dụng sản xuất tinh chó đông lạnh bảo tồn ở -196 C

2.2.1 Nghiên cứu về môi trường

- Nghiên cứu hoàn thiện môi trường đông lạnh tinh dịch: thành phần, tỷ

lệ các chất tạo môi trường, xác định một số tính chất lý – hóa học (áp lực thẩm thấu, năng lực đệm, độ nhớt, tỷ trọng, pH môi trường) của môi trường

- Nghiên cứu hoàn thiện về chất bảo vệ lạnh (Glycerol, DMSO) trong quá trình đông lạnh và bảo tồn tinh dịch chó ở -1960

2.2.2 Nghiên cứu điều hòa cân bằng nhiệt

- Nghiên cứu hoàn thiện cân bằng nhiệt (thang nhiệt độ, thời gian ủ tinh dịch) đối với tinh pha loãng trước khi đông lạnh

- Nghiên cứu hoàn thiện tốc độ giảm nhiệt độ trong quá trình đông lạnh tinh dịch

- Nghiên cứu tốc độ giải đông (nhiệt độ và thời gian) tinh chó đông lạnh

2.3 Sản xuất tinh chó Berger đông lạnh

2.3.1 Theo dõi chất lượng tinh chó Berger đông lạnh trong quá trình bảo tồn ở -196 0 C

- Đánh giá chất lượng tinh trùng chó sau đông lạnh thông qua các chỉ tiêu: hoạt lực của tinh trùng sau, sức sống của tinh trùng sau giải đông và ủ ở

37 C, tỷ lệ tinh trùng sống, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình

2.3.2 TTNT cho chó Berger để thử nghiệm tinh đông lạnh sản xuất được

3 Phương pháp nghiên cứu

3.1 Phương pháp lấy tinh:

Sau khi xem xét, lựa chọn chó đực đạt yêu cầu, tiến hành khai thác tinh dịch Trong quá trình khai thác tinh dịch không cho chó đực giao phối trực tiếp ít nhất là 3 ngày trước thời điểm lấy tinh Thời gian khai thác tinh vào buổi sáng, tinh dịch được khai thác bằng phương pháp massage trong một không gian yên tĩnh

Quá trình khai thác tinh gồm các bước sau:

- Kích thích ở phần tự do của quy đầu cho đến khi nó xuất ra chất dịch trong (tinh thanh), đó là pha thứ nhất của quá trình xuất tinh

- Khi chó đực bắt đầu dập mạnh để chuẩn bị xuất tinh ở pha thứ hai thì thôi không kích thích nữa mà phải bóp chặt, tạo một áp lực mạnh ở tuyến hành dương vật để xuất toàn bộ tinh dịch của pha này

- Sau khi chó đực xuất hết tinh thì tiếp tục kích thích cho đến khi tinh thanh ra hết, mục đích là giúp rửa sạch lòng dương vật của chó đực

Chú ý: người khai thác tinh chỉ dùng lọ hứng phần tinh dịch của pha thứ hai của quá trình phóng tinh (vì pha này chứa nhiều tinh trùng) còn những pha khác thì bỏ qua

3.2 Phương pháp nghiên cứu sinh học tinh dịch chó

3.2.1 Lượng tinh dịch (V)

Theo phương pháp của Milovanov (1926) và Chemineau (1991) [6]: xác định thể tích tinh dịch qua ống hút pipet thuỷ tinh có chia độ hoặc xác định qua phễu hứng tinh đã chia độ, đặt lọ thuỷ tinh trên mặt phẳng nằm ngang và đọc kết quả ở vạch cong dưới của mặt tinh dịch

3.2.2 Hoạt lực tinh trùng (A)

Theo phương pháp của Milovanov (1926) và Chemineau (1991) [6]: sức hoạt động được tính bằng tỷ lệ % tinh trùng có hoạt động tiến thẳng so với tổng số tinh trùng có trong vi trường quan sát được

Đánh giá theo thang điểm 1,0 như sau:

Điểm 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1

A (%) 100-95 95-85 85-75 75-65 65-55 55-45 45-35 35-25 25-15 15-5

Phương pháp đánh giá hoạt lực tinh trùng

Dùng đũa thuỷ tinh sạch lấy một giọt tinh dịch lên phiến kính sạch, ấm

(30 - 350C) Dùng một lá kính khô, sạch đậy lên giọt tinh dịch sao cho giọt tinh dịch được dàn đều và không lẫn bọt khí Đặt tiêu bản lên kính hiển vi (Olympus) và xem với độ phóng đại 100 - 400 lần Trong khi kiểm tra, tiêu bản được sưởi ấm ở 37 -380

C

Tinh trùng có 3 hình thức vận động: tiến thẳng, xoay vòng, lắc lư

3.2.3 Nồng độ tinh trùng (C)

Theo phương pháp của Milovanov (1926) và Chemineau (1991) [6]: dùng buồng đếm hồng cầu và bạch cầu (kiểu Neubouer) và ống pha loãng hồng cầu Pha loãng tinh dịch 100-200 lần bằng dung dịch NaCl 3% (hút tinh dịch đến vạch 0,5-1,0 rồi hút NaCl 3% đến vạch 101)

Trộn đều tinh dịch được pha loãng, bỏ 3 - 4 giọt đầu, nhỏ một giọt vào buồng đếm đã chuẩn bị Đếm tinh trùng trong các ô đếm hồng cầu (4 ô trung bình ở 4 góc và một ô ở giữa Mỗi ô trung bình có 16 ô nhỏ, mỗi ô nhỏ có diện tích 1/400mm2

và độ sâu 1/10mm)

Nguyên tắc đếm:

Đếm tinh trùng theo đầu: đếm tinh trùng theo hàng, đếm hết hàng nọ đến hàng kia theo hình chữ chi Những tinh trùng nằm trên cạnh ô nhỏ chỉ đếm hai cạnh (thường là cạnh trên và cạnh phải) Đếm cả hai buồng, đếm xong lấy kết quả trung bình, nếu kết quả của hai bên chênh nhau 30% thì phải làm lại Nếu tinh trùng tụ thành đám thì phải làm lại

Công thức tính:

C= x1000

N4000

D.n

Trong đó: C: Nồng độ tinh trùng trong tinh dịch

n: Số tinh trùng đếm được

D: Mức độ pha loãng

N: Số ô con đã đếm

Công thức đơn giản (nếu độ pha loãng 200 lần ): C= n x107

3.2.4 Tổng số tinh trùng tiến thẳng (V.A.C)

Theo John B.Herrick và Self (1962) (dẫn từ Đỗ Văn Thu (2010) [1]), tổng số tinh trùng tiến thẳng trong một lần lấy tinh = lượng tinh dịch (ml) x nồng độ tinh trùng/ml x hoạt lực tinh trùng tiến thẳng (%)

3.2.5 Tỷ lệ tinh trùng sống (LS)

Theo phương pháp của Chemineau (1991)[6]

Dung dịch nhuộm: Eosin 1g; Nigrosin 2g; Natri - citrate 5,5; H20 3,57g; nước cất 2 lần: 100 ml

pH dung dịch nhuộm: 6,7 - 6,8; áp suất thẩm thấu 310 miliosmol/kg Tiến hành:

- Sau khi pha trộn để 50 giây

- Dùng phiến kính thứ hai nhẹ nhàng san đều hỗn hợp đã nhuộm

- Đếm tổng số không dưới 150 tinh trùng, đều ở các vùng, tinh trùng sống không bắt màu

5 - 10 phút với thuốc nhuộm (Xanh Metylen, đỏ Fucxin, hỗn hợp Eosin và Nigrosin) Rửa tiêu bản bằng sức loang của giọt nước cất, hong khô

- Quan sát bằng kính hiển vi Olympus với độ phóng đại 400-1000 lần

- Đếm: lấy ngẫu nhiên, đếm lần lượt 300 - 500 tinh trùng bất kỳ, cả tinh trùng bình thường lẫn tinh trùng kỳ hình

- Tính: (%) 100

NnK

Sử dụng nhớt kế Oswald hoặc micropipet, xác định độ nhớt ở 200

C Công thức tính:

=

o

o tdtd

độ chênh lệch pH (dpH)

Công thức tính:

.1000 vdpHna

3.3.6 Môi trường đông lạnh tinh dịch chó ở -196 0 C

- Môi trường 1: Tris 3,634 g - Citric acid 1,99 g - fructose 0,5 g - lòng đỏ trứng gà 14 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần

đủ 100 ml Phần A của môi trường không chứa Glycerol, phần B chứa 13%(v/v) Glycerol

- Môi trường 2: Tris 1,3625 g - fructose 0,375 g - lactose 1,5 g - raffinose 2,7 g - citric acid 0,7615 g - lòng đỏ trứng gà 20 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml Phần A của môi trường không chứa Glycerol, phần B chứa 13%(v/v) Glycerol

Dụng cụ kiểm tra tinh dịch: kính hiển vi có độ phóng đại từ 40 đến

1000 lần, lam kính, lamen, bộ đếm hồng cầu, các ống eppendorf 1,5ml

Các dụng cụ bằng thuỷ tinh được rửa sạch, tráng lại bằng nước cất sau

đó bằng cồn, và sấy khô Các dụng cụ bằng nhựa được rửa sạch, tráng bằng nước cất và bằng cồn sau đó để khô tự nhiên

b Hoá chất:

Tris(hydroxymethyl)aminomethane, citric acid, fructose, Raffinose, penicillin, streptomycin, glycerol, lòng đỏ trứng gà, nước cất hai lần, eosin 5%, dung dịch nước muối sinh lý 0.85%, dung dịch nước muối 3%, cồn sát trùng 70%

Pha môi trường đông lạnh

Chuẩn bị môi trường đông lạnh: môi trường đông lạnh có các thành phần gồm: Tris 3,634 g - Citric acid 1,99 g - fructose 0,5 g - lòng đỏ trứng gà

14 ml - penicillin 100 mg - streptomycin 100 mg - nước cất hai lần đủ 100 ml

Để pha môi trường, nước cất hai lần được đun cách thuỷ đến sôi Pha tris, citric acid, fructose với lượng nước vừa đủ, dùng đũa thuỷ tinh đánh tan, để nguội, sau đó bổ sung các kháng sinh, lòng đỏ trứng gà và dùng khuấy từ khuấy đều trong 30 phút Sau khi pha, môi trường được chia làm 2 phần (môi trường A và môi trường B), môi trường B được bổ sung glycerol với nồng độ

13 % (v/v) sau đó tiếp tục dùng khuấy từ khuấy đều trong 45 phút (chú ý: không khuấy quá mạnh để không làm chín lòng đỏ trứng) Môi trường sau khi pha được bảo quản ở 40

C

Thu nhận tinh dịch

Cần thiết có tối thiểu 1 người tham gia lấy tinh dịch và 1 người sẵn

sàng kiểm tra mẫu Tinh dịch được thu nhận bằng phương pháp massage, tinh được phóng trực tiếp vào cốc thuỷ tinh đã làm ấm ở 320

C Chỉ thu tinh dịch ở pha thứ hai của quá trình xuất tinh (pha giàu tinh trùng nhất)

Kiểm tra tinh dịch

Ngay sau khi thu nhận, tinh dịch được ghi lại thể tích trên cốc hứng tinh, chuyển tinh dịch vào cốc đựng mẫu, đưa vào nước ấm 34 0C đã chuẩn bị

sẵn Kiểm tra ngay pH của tinh dịch bằng giấy đo pH (pH của tinh dịch chó

ổn định và dao động trong khoảng 6,5-7,0 Khi pH tinh dịch nằm ngoài khoảng dao động đó, tinh dịch thường có chất lượng không tốt)

Kiểm tra hoạt lực tinh trùng tiến thẳng: một giọt tinh dịch được lấy ra

và nhỏ lên lam kính, đậy lamen và đưa lên kính hiển vi kiểm tra ở độ phóng đại 100 và 400 lần Hoạt lực được đánh giá theo phần trăm, với thang điểm 100%

Kiểm tra nồng độ tinh trùng: tinh dịch được pha loãng 200 lần với dung dịch NaCl 3% bằng ống trộn hồng cầu và được đếm ngay, sử dụng buồng đếm Newbouer

Tỷ lệ tinh trùng sống và tỷ lệ tinh trùng kỳ hình: một giọt tinh dịch được nhuộm bằng thuốc nhuộm eosin, làm tiêu bản quét Tỷ lệ tinh trùng sống được đếm ngay lập tức trong vòng 1- 2 phút sau khi nhuộm, đếm tối thiểu 200 tinh trùng có trên tiêu bản Sau 2 phút, không nên đếm tiếp vì có thể

sẽ không còn chính xác Tiêu bản kỳ hình được làm cùng với tiêu bản sống chết, nhưng được để lại kiểm tra trong thời gian ủ mẫu ở 40C

Pha loãng tinh dịch với môi trường

Sau khi đã xác định được nồng độ tinh dịch, pha loãng tinh dịch với môi trường A đã được cân bằng nhiệt trong cùng bể nước ấm ủ tinh dịch Khi pha môi trường nên để môi trường chảy từ từ theo thành cốc đựng mẫu và lắc nhẹ cốc để tinh dịch hoà tan vào môi trường một cách từ từ Lượng môi trường được tính toán để sao cho trong một cọng rạ có tổng số khoảng 150 triệu tinh trùng Cốc chứa tinh đã pha loãng được đặt vào trong một cốc khác

có chứa nước được lấy từ chính bể cân bằng tinh dịch và được chuyển vào tủ bảo ôn ở nhiệt độ 40C

Chú ý: tất cả các thao tác kiểm tra tinh dịch và pha loãng nên được làm trong khoảng từ 5 - 10 phút

Các bước chuẩn bị và đông lạnh tinh dịch chó

Bước 1 In cọng rạ

Cọng rạ được đánh dấu bằng những màu sắc khác nhau tuỳ theo từng giống Đưa cọng rạ vào máy in, các thông số trên cọng rạ gồm: giống, tên (số hiệu), nơi lấy tinh, ngày sản xuất tinh, nơi sản xuất

Bước 2 Cân bằng tinh dịch và cọng rạ trong tủ bảo ôn ở 40

C trong 2 giờ Sau đó bổ sung môi trường B và tiếp tục ủ thêm 2 giờ

Bước 3 Nạp tinh pha loãng vào cọng rạ:

Đưa cọng rạ đã được in số liệu vào máy, sau đó đưa tinh pha loãng của những con có số hiệu tương ứng lên máy lắc từ và để máy đóng cọng tự động Sau khi nạp tinh, các cọng rạ được xếp lên khay và đưa ngay vào tủ cân bằng

ở 40

C

Bước 4 Ủ tinh cọng rạ trong tủ cân bằng nhiệt độ 4 0

C trong thời gian 3 giờ

Bước 5 Đông lạnh tinh cọng rạ

Bước 6 Thả tinh cọng rạ ở -1650C vào nitơ lỏng -1960

C Tinh cọng rạ được đựng trong các ống Tinh cọng rạ sau 24 giờ bảo tồn trong nitơ lỏng, một cọng rạ được lấy ra một cách ngẫu nhiên từ mỗi mẫu tinh để giải đông và đánh giá hoạt lực tiến thẳng, tỷ lệ tinh trùng kỳ hình, tỷ lệ tinh sống của tinh trùng

Bước 7 Giải đông tinh cọng rạ ở nước ấm 370

C trong khoảng 30 giây -

60 giây

Bước 8 Kiểm tra chất lượng định kỳ: tinh cọng rạ bảo tồn ở -196 0

C được kiểm tra sau 3 tháng, sau 6 tháng, sau 12 tháng và kiểm tra định kì hàng năm

Chuẩn bị thí nghiệm

Môi trường A

Môi trường B

Môi trường Thu nhận tinh dịch

Kiểm tra tinh dịch

3.3.8 Phương pháp TTNT chó Berger sử dụng tinh đông lạnh

a Dụng cụ, hoá chất và vật liệu

- Súng bắn tinh

- Vaseline

- Cồn khử trùng 70%

- Nitơ lỏng và hộp đựng, panh sắt, kéo

- Tinh cọng rạ bảo quản trong nitơ lỏng ở -1960C

- Nước ấm 370C

- Đồng hồ bấm giờ

- Nhiệt kế có thang độ 100

- Các thiết bị khác phục vụ cho giải đông, đánh giá chất lượng tinh dịch

và thụ tinh nhân tạo

b Tiến hành

- Kiểm tra chất lượng tinh dịch trước khi sử dụng thụ tinh nhân tạo (chỉ

sử dụng tinh dịch có hoạt lực tinh trùng sau giải đông ≥ 30%)

- Tinh đông lạnh dạng cọng rạ được giải đông bằng cách nhúng vào nước

ấm ở 370

C trong 1 phút

- Lắp cọng rạ vào súng bắn tinh đã được khử trùng bằng cồn 70% và được bôi trơn bằng vaseline

Thao tác thụ tinh nhân tạo

Giữ chó cái ở tư thế đứng, toàn bộ thân tạo thành một đường thẳng, điều này giúp cho việc đưa súng bắn tinh vào tử cung một cách dễ dàng

Tay thuận cầm súng bắn tinh, tay còn lại kích thích nhẹ vào âm đạo của chó cái

Tay thuận đưa súng bắn tinh vào âm đạo Hướng súng bắn tinh chết từ dưới lên trên với góc 45 độ, sau khi đưa được súng bắn tinh vào âm đạo, súng bắn tinh có hướng song song với lưng của chó cái, tay kia vẫn kích thích nhẹ nhàng vào âm đạo

Súng bắn tinh được đưa vào khoảng 15-30 cm thì gặp cổ tử cung (cảm giác khựng lại do gặp cổ tử cung) Thao tác nhẹ nhàng đưa đầu súng bắn tinh qua cổ tử cung Tiếp theo đó tay kia cố định súng bắn tinh ở điểm gần âm đạo, tay thuận nhẹ nhành đẩy tinh dịch trong cọng rạ vào trong tử cung của chó cái Sau đó nhẹ nhàng đưa súng bắn tinh ra khỏi âm đạo, vỗ nhẹ vào hông

để tạo phản xạ đóng cổ tử cung, tránh tinh dịch chảy ra ngoài

Theo dõi chó cái đã phối giống Sau một tháng phối giống, khám thai cho chó

Toàn bộ qui trình thụ tinh nhân tạo cho chó sử dụng tinh đông lạnh dạng cọng rạ được tóm tắt theo sơ đồ dưới đây:

A ≥ 30%

Chuẩn bị dụng cụ thụ tinh nhân tạo Giải đông tinh cọng rạ bằng

nước ấm 370

C trong 1 phút

Khử trùng và bôi vaseline cho súng bắn tinh Lắp tinh cọng rạ vào

súngbắn tinh

Dẫn tinh cho chó cái

thụ tinh nhân tạo

Theo dõi chó cái sau phối giống

QUY TRÌNH THỤ TINH NHÂN TẠO CHÓ SỬ DỤNG TINH

ĐÔNG LẠNH

* Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý theo chương trình phần

mềm Excel 2003 và minitab 15.0

Trình bày kết quả: X S x

n i i

n x

x x n

X

1 2

1

1

1

n n x x S

n i