BÁO cáo SEMINAR CHUYÊN đề AFLATOXIN , đh nông lâm tphcm

GVHD: PHÙNG VÕ CẨM HỒNG SINH VIÊN THỰC HIỆN: ĐỖ XUÂN ĐỊNH 09139034 ĐẶNG ĐÌNH SOÁI 09139146 NGUYỄN THỊ KIM LOAN 09139192 NGUYỄN NGỌC THÚY HÀO 0913904 LÊ VĂN HÀO 09139045 VÕ TUẤN HÙNG 09139069 NỘI DUNG I II ĐẶT VẤN ĐỀ KHÁI QUÁT VỀ AFLATOXIN NGUỒN GỐC AFLATOXIN CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT VẬT LÝ - HÓA HỌC CỦA AFLATOXIN III PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH VÀ ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH IV HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO NGUYÊN TẮC DỤNG CỤ VÀ THIẾT BỊ HÓA CHẤT DUNG DỊCH CHUẨN CHUẨN BỊ MẪU THỬ LÀM SẠCH DỊCH CHIẾT PHÂN TÍCH TRÊN HPLC YÊU CẦU VỀ ĐỘ TIN CẬY CỦA PHÉP PHÂN TÍCH KẾT QUẢ I ĐẶT VẤN ĐỀ  Aflatoxin nhóm chất độc mạnh hình thành tự nhiên Chúng bao gồm họ độc tố sinh từ nấm aspergillus flavus aspergillus paraticus điều kiện khí hậu nóng ẩm  Những thực phẩm thường nhiễm aspergillus flavus đậu Phộng, lúa mì… nhóm bị nhiễm aflatoxin Aspergillus fumigatus  Aflatoxin gây tổn thương gan, gây ung thư, gây giảm sức đề kháng cho thể Trong nhiều loại aflatoxin tự nhiên aflatoxin B1 coi chất độc nguy hiểm  Do việc kiểm soát dư lượng aflatoxin cần thiết quan trọng  Thông thường nồng độ nhiễm độc tố aflatoxin thực phẩm thấp Do để xác định xác độc tố aflatoxin có thực phẩm cần chọn phương pháp phù hợp  Xác định aflatoxin thực phẩm phương pháp sắc kí nhằm định lượng hàm lượng aflatoxin có thực phẩm chiết tách aflatoxin khỏi thực phẩm II KHÁI QUÁT VỀ AFLATOXIN NGUỒN GỐC AFLATOXIN  Aflatoxin độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên số loài Aspergillus, loại nấm mốc, đáng ý Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus Aflatoxin độc tố tác nhân gây ung thư  Aspergillus flavus aspergillus parasiticus thuộc họ nấm cúc, loại nấm sản sinh aflatoxin tự nhiên môi trường nuôi cấy nhân tạo  Aflatoxin thường có loại hạt có dầu lạc đậu nành, hạt điều, hạt hướng dương, vừng… hay loại hạt ngũ cốc, bột dinh dưỡng, thức ăn gia súc 2 CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT VẬT LÝ - HÓA HỌC CỦA AFLATOXIN  Các nhà hóa học xác định hai aflatoxin có công thức C17H12O6 (aflatoxin B1) C17H12O7 (aflatoxin G1) Trong cấu trúc phân tử có nhóm lacton metoxyl, nhóm hidroxyl tự  Aflatoxin B1 có màu huỳnh quang xanh da trời, aflatoxin G1 có màu huỳnh quang xanh Aflatoxin G1 có chứa hai vòng lacton, aflatoxin B1có chứa vòng lacton Cấu trúc 3D aflatoxin B1  Sau đó, hai aflatoxin B2, G2 phát Chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống aflatoxin B1, G1, khác nối đôi vòng hidrofuran bị khử Bảng: Tính chất lí hóa aflatoxin Aflatoxin Công thức Trọng lượng phân tử Điểm nóng chảy Huỳnh quang Hấp thụ tiaUv etoh Aflatoxin B1 C17H12O6 321 268-269 Xanh lam 223.2 Aflatoxin B2 C17H14O6 314 286-269 Xanh lam 243.2 Aflatoxin G1 C17H12O7 328 244-246 Xanh lục 222.2 Aflatoxin G2 C17H34O7 330 229-231 Xanh lục 221.2 Aflatoxin M1 C17H12O7 328 299 Xanh tím 226.2 Aflatoxin C17H14O7 330 293 Xanh tím 221.2 III PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH VÀ ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH  Tiến hành phân tích aflatoxin phương pháp sắc ký lỏng     hiệu cao Đối tượng xác định độc chất loại nguyên liệu thức ăn chăn nuôi: Khô dầu đậu tương, khô dầu lạc Cỏ khô, phụ phẩm nông nghiệp Các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm IV HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO  Nguyên tắc  Aflatoxin có mẫu thức ăn chăn nuôi bao gồm nhóm B1, B2, G1 G2 chiết tách clorofom Dịch chiết đựơc làm phương pháp chiết pha rắn (SPE) silicagel  Hàm lượng aflatoxin có dịch chiết xác định hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang, giới hạn phát phương pháp 0,3ppb Hệ thống sắc ký lỏng cao áp Dụng cụ thiết bị           Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x ID 25cm x 4,6 mm, đường kính hạt từ đến 10 µm Cân phân tích có độ xác 0,0001 g Máy li tâm tốc độ 3000 vòng/phút Hệ thống cô quay chân không Cột thủy tinh có khóa Teflon , kích thước L x ID 500 x 20 mm 500 x mm Ống li tâm thủy tinh dung tích 250 ml Bình cầu thủy tinh dung tich 100 ml 250 ml Bình định mức dung tích ml 10 ml Máy nghiền đồng thể tốc độ 10.000 vòng/ phút 3 Hóa chất Nước cất loại dung cho HPLC  Metanol loại dung cho HPLC  Clorofrom loại dung cho HPLC  Axetonitril loại dung cho HPLC  N- hexan tinh khiết loại dung cho phân tich  Ete- etilic tinh khiết  Natri sunphat khan  Silicagel đươc hoạt hóa  Dung dịch chuẩn dung dịch thử Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100 ppb), B2 (nổng độ 20 ppb), G1 (nồng độ 100 ppb), G2 (nồng độ 20 ppb) Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ B1 (10ppb), B2(2ppb), G1(10ppb), G2(2ppb): hút xác 1ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 10ml định mức tới vật Metanol Dung dịch chuẩn: hút xác 0ml, 1ml, 2ml, 4ml, 8ml, 10ml, dung dịch chuẩn trung gian vào bình định mức 10ml định mức tới vạch Metanol Các dung dịch chuẩn thu có nồng độ Aflatoxin sau : o o Chuẩn 1: B1(0ppb), B2(0ppb), G1(0ppb), G2(0ppb) o Chuẩn 2: B1(1ppb), B2(0,2ppb), G1(1ppb), G2(0,2ppb) o Chuẩn 3: B1(2ppb), B2(0,4ppb), G1(2ppb),G2(0,4ppb) o Chuẩn 4: B1(4ppb), B2(0,8ppb), G1(4ppb), G2(0,8ppb) o Chuẩn 5: B1(8ppb), B2(1,6ppb), G1(8ppb), G2(1,6ppb) o Chuẩn 6: B1(10ppb), B2(2ppb), G1(10ppb), G2(2ppb) o Dung dịch pha động : pha hỗn hợp dung môi methanol, nước cất theo tỉ lệ 2:3 5.Chuẩn bị mẫu thử  Dùng cân phân tích cân xác 50,0 g mẫu (m) băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml  Thêm 100,0 ml clorofom vào ống trộn khoảng phút máy nghiền đồng thể ly tâm ống máy ly tâm khoảng 10 phút tốc độ 3000 vòng/phút Tiến hành lọc dịch chiết rửa phần bã clorofom cho tất dịch thu vào bình cầu thuỷ tinh dung tích 250 ml Làm dịch chiết 6.1 Chuẩn bị cột  Ðặt lớp thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon Ðóng khóa cho clorofom tới khoảng 2/3 cột thêm 5,0 g sulfat natri khan , 20,0g silicagel hoạt hóa , 15 g sulfat natri khan  Chú thích: để tránh khô cột giữ mực clorofom cao lớp sulfat natri khan khoảng 1,5 cm 6.2 Làm dịch chiết  Cô dịch chiết thu hệ thống cô quay chân không khoảng 5,0 ml nhiệt độ 40 oC  Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình cầu vào cột làm chuẩn bị tráng rửa bình cầu clorofom Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy dung dịch khỏi cột khoảng từ 0,8 đến 1,2 ml/phút Trong giai đoạn này, aflatoxin hấp phụ lên hạt silicagel  Thêm vào cột 50,0 ml n-hexan, 50,0 ml ete etylic Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột 0,8 ml/phút Sau loại bỏ dịch chảy khỏi cột  Giải hấp aflatoxin khỏi cột làm 50,0 ml hỗn hợp clorofom metanol theo tỉ lệ thể tích 97: với tốc dộ 0,8 ml/phút  Hứng dung dịch chảy khỏi cột vào bình cầu dung tích 100 ml Cô dịch thu hệ thống cô quay chân không nhiệt độ 40o C khô hoàn toàn Cột sắc ký 7.2 Tiến hành thực  Tiêm dung dịch chuẩn vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao  Mỗi dung dịch tiêm lần, tính diện tích pic trung bình  Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ diện tích pic thu nồng độ loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc (phương trình y = ax + b) Yêu cầu độ tin cậy phép phân tích 8.1 Độ lặp lại hai lần tiêm  Độ lệch chuẩn tính theo diện tích pic sắc ký hai lần tiêm dung dịch chuẩn phải nhỏ 0,5% 8.2 Độ thu hồi (R)  Độ thu hồi tính phải nằm khoảng từ 85 -115%, độ thu hồi trung bình phải lớn 90%  Đường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R2) phải lớn 0,99 Đường chuẩn Aflatoxin B2 Tính kết  Hàm lượng aflatoxin có mẫu tính sở đường chuẩn thu Với đường chuẩn dạng y = ax + b, hàm lượng aflatoxin có mẫu tính theo công thức sau: Trong đó: C= (Y-b)xF a • C nồng độ aflatoxin có mẫu (ppb) • Y hiệu số diện tich pic dịch chiết diện tích pic có mẫu trắng tiêm vào HPLC, tinh theo đơn vị diện tich • a, b thông số đường chuẩn y = ax + b • F hệ số pha loãng mẫu có giá trị tỉ số thể tích dịch chiết thu sau làm (V) khối lượng mẫu (m) sử dụng [...]... Aflatoxin lần lượt như sau : o o Chuẩn 1: B1(0ppb ), B2(0ppb ), G1(0ppb ), G2(0ppb) o Chuẩn 2: B1(1ppb ), B2( 0,2 ppb ), G1(1ppb ), G2( 0,2 ppb) o Chuẩn 3: B1(2ppb ), B2( 0,4 ppb ), G1(2ppb),G2( 0,4 ppb) o Chuẩn 4: B1(4ppb ), B2( 0,8 ppb ), G1(4ppb ), G2( 0,8 ppb) o Chuẩn 5: B1(8ppb ), B2( 1,6 ppb ), G1(8ppb ), G2( 1,6 ppb) o Chuẩn 6: B1(10ppb ), B2(2ppb ), G1(10ppb ), G2(2ppb) o Dung dịch pha động : pha hỗn hợp dung môi methanol,... chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100 ppb ), B2 (nổng độ 20 ppb ), G1 (nồng độ 100 ppb ), G2 (nồng độ 20 ppb) Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ là B1 (10ppb ), B2(2ppb ), G1(10ppb ), G2(2ppb): hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 10ml rồi định mức tới vật bằng Metanol Dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 0ml, 1ml, 2ml, 4ml, 8ml, 10ml, dung dịch chuẩn trung gian vào các bình... khỏi cột khoảng từ 0,8 đến 1,2 ml/phút Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel  Thêm vào cột lần lượt 5 0,0 ml n-hexan, 5 0,0 ml ete etylic Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột ở 0,8 ml/phút Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột  Giải hấp các aflatoxin khỏi cột làm sạch bằng 5 0,0 ml hỗn hợp clorofom và metanol theo tỉ lệ về thể tích là 97: 3 với tốc dộ 0,8 ml/phút  Hứng dung... được phải nằm trong khoảng từ 85 -115 %, độ thu hồi trung bình phải lớn hơn 90%  Đường chuẩn phải có độ tuyến tính tốt, hệ số tương quan hồi quy tuyến tính (R2) phải lớn hơn hoặc bằng 0,9 9 Đường chuẩn của Aflatoxin B2 9 Tính kết quả  Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính theo... Ðóng khóa và cho clorofom tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần lượt 5,0 g sulfat natri khan , 2 0,0 g silicagel đã hoạt hóa , 15 g sulfat natri khan  Chú thích: để tránh khô cột luôn giữ mực clorofom cao hơn lớp sulfat natri khan trên cùng khoảng 1,5 cm 6.2 Làm sạch dịch chiết  Cô dịch chiết thu được trên hệ thống cô quay chân không còn khoảng 5,0 ml ở nhiệt độ 40 oC  Dùng pipet chuyển dung dịch từ bình... thiết bị           Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x là ID là 25cm x 4,6 mm, đường kính hạt từ 5 đến 10 µm Cân phân tích có độ chính xác 0,0 001 g Máy li tâm tốc độ 3000 vòng/phút Hệ thống cô quay chân không Cột thủy tinh có khóa Teflon , kích thước L x ID là 500 x 20 mm và 500 x 8 mm Ống li tâm thủy tinh dung tích 250 ml Bình cầu thủy tinh dung tich 100... dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình  Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện tích pic thu được và nồng độ từng loại aflatoxin theo quan hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b) 8 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích 8.1 Độ lặp lại của hai lần tiêm  Độ lệch chuẩn tính theo diện tích pic sắc ký của hai lần tiêm cùng một dung dịch chuẩn phải nhỏ hơn 0,5 % 8.2 Độ thu hồi... G2(2ppb) o Dung dịch pha động : pha hỗn hợp dung môi methanol, nước cất theo tỉ lệ là 2:3 5.Chuẩn bị mẫu thử  Dùng cân phân tích cân chính xác 5 0,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích 250 ml  Thêm 10 0,0 ml clorofom vào ống rồi trộn đều trong khoảng 2 phút bằng máy nghiền đồng thể ly tâm ống bằng máy ly tâm trong khoảng 10 phút ở tốc độ 3000 vòng/phút Tiến hành lọc dịch... dạng y = ax + b, hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính theo công thức sau: Trong đó: C= (Y-b)xF a • C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu (ppb) • Y là hiệu số giữa diện tich pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tinh theo đơn vị diện tich • a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b • F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết ... DUNG I II ĐẶT VẤN ĐỀ KHÁI QUÁT VỀ AFLATOXIN NGUỒN GỐC AFLATOXIN CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT VẬT LÝ - HÓA HỌC CỦA AFLATOXIN III PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH VÀ ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH IV HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG... Phộng, lúa mì… nhóm bị nhiễm aflatoxin Aspergillus fumigatus  Aflatoxin gây tổn thương gan, gây ung thư, gây giảm sức đề kháng cho thể Trong nhiều loại aflatoxin tự nhiên aflatoxin B1 coi chất độc... phương pháp sắc kí nhằm định lượng hàm lượng aflatoxin có thực phẩm chiết tách aflatoxin khỏi thực phẩm II KHÁI QUÁT VỀ AFLATOXIN NGUỒN GỐC AFLATOXIN  Aflatoxin độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên