BÁO cáo SEMINAR CHUYÊN đề AFLATOXIN , đh nông lâm tphcm

Do đó để xác định chính xác độc tố aflatoxin có trong thực phẩm cần chọn phương pháp phù hợp.. Xác định aflatoxin trong thực phẩm bằng các phương pháp sắc kí nhằm định lượng được hàm lư

GVHD: PHÙNG VÕ CẨM HỒNG

SINH VIÊN THỰC HIỆN:

NỘI DUNG

I ĐẶT VẤN ĐỀ

II KHÁI QUÁT VỀ AFLATOXIN

1 NGUỒN GỐC AFLATOXIN

2 CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT VẬT LÝ - HÓA HỌC CỦA AFLATOXIN

III PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH VÀ ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH

IV HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN CHĂN NUÔI

PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.

Aflatoxin gây tổn thương gan, gây ung thư, gây giảm sức đề kháng cho cơ thể Trong rất nhiều loại aflatoxin trong tự nhiên thì aflatoxin B1 được coi là chất độc nguy hiểm nhất.

 Do đó việc kiểm soát dư lượng aflatoxin là cần thiết và quan trọng.

Thông thường nồng độ nhiễm độc tố aflatoxin trong thực phẩm rất thấp Do đó để xác định chính xác độc tố aflatoxin có trong thực phẩm cần chọn phương pháp phù hợp

Xác định aflatoxin trong thực phẩm bằng các phương pháp sắc

kí nhằm định lượng được hàm lượng aflatoxin có trong thực phẩm và chiết tách aflatoxin ra khỏi thực phẩm

II KHÁI QUÁT VỀ AFLATOXIN

 Aflatoxin là độc tố vi nấm sản sinh tự nhiên bởi một số loài

Aspergillus, là một loại nấm mốc, đáng chú ý nhất là

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Aflatoxin là

độc tố và là tác nhân gây ung thư

 Aspergillus flavus và aspergillus parasiticus thuộc họ nấm

cúc, là loại nấm sản sinh ra aflatoxin trong tự nhiên và trong môi trường nuôi cấy nhân tạo

 Aflatoxin thường có trong các loại hạt có dầu như lạc đậu

nành, hạt điều, hạt hướng dương, vừng… hay trên các loại hạt ngũ cốc, bột dinh dưỡng, thức ăn gia súc

2 CẤU TẠO VÀ TÍNH CHẤT VẬT LÝ - HÓA HỌC CỦA AFLATOXIN

Aflatoxin B1 có màu huỳnh

quang xanh da trời, aflatoxin G1

có màu huỳnh quang xanh lá

cây Aflatoxin G1 có chứa hai

vòng lacton, aflatoxin B1có

chứa 1 vòng lacton Cấu trúc 3D của aflatoxin B 1

Sau đó, hai aflatoxin B2, G2 cũng được phát hiện Chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống aflatoxin B1, G1, chỉ khác

là nối đôi trong vòng hidrofuran đã bị khử

Bảng: Tính chất lí hóa của các aflatoxin

Aflatoxin Công thức Trọng lượng

phân tử Điểm nóng chảy Huỳnh quang Hấp thụ tiaUv trong

etoh

III PHƯƠNG PHÁP TIẾN HÀNH VÀ ĐỐI TƯỢNG PHÂN TÍCH

 Tiến hành phân tích aflatoxin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

 Đối tượng xác định độc chất là các loại nguyên liệu và thức ăn chăn nuôi:

 Khô dầu đậu tương, khô dầu lạc

 Cỏ khô, phụ phẩm nông nghiệp

 Các loại thức ăn cho gia súc, gia cầm

IV HÀM LƯỢNG AFLATOXIN TRONG THỨC ĂN

CHĂN NUÔI – PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO.

 1 Nguyên tắc

 Aflatoxin có trong mẫu thức

ăn chăn nuôi bao gồm các nhóm

B1, B2, G1 và G2 được chiết tách

ra bằng clorofom Dịch chiết

đựơc làm sạch bằng phương pháp

chiết pha rắn (SPE) trên silicagel

 Hàm lượng aflatoxin có trong

dịch chiết được xác định trên hệ

thống HPLC với đầu dò huỳnh

quang, giới hạn phát hiện của

phương pháp là 0,3ppb Hệ thống sắc ký lỏng cao áp

2 Dụng cụ và thiết bị

 Hệ thống HPLC với đầu dò huỳnh quang

 Cột sắc ký pha đảo LC18 kích thước L x là ID là 25cm x 4,6 mm,

đường kính hạt từ 5 đến 10 µm

 Cân phân tích có độ chính xác 0,0001 g

 Máy li tâm tốc độ 3000 vòng/phút

 Hệ thống cô quay chân không

 Cột thủy tinh có khóa Teflon , kích thước L x ID là 500 x 20 mm

và 500 x 8 mm

 Ống li tâm thủy tinh dung tích 250 ml

 Bình cầu thủy tinh dung tich 100 ml và 250 ml

 Bình định mức dung tích 5 ml và 10 ml

 Máy nghiền đồng thể tốc độ 10.000 vòng/ phút

 Ete- etilic tinh khiết.

 Natri sunphat khan.

 Silicagel đã đươc hoạt hóa.

4 Dung dịch chuẩn và dung dịch thử

Dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp gồm: B1 (nồng độ 100 ppb), B2 (nổng độ 20 ppb), G1 (nồng độ 100 ppb), G2 (nồng độ 20 ppb)

Dung dịch chuẩn trung gian có nồng độ là B1 (10ppb),

B2(2ppb), G1(10ppb), G2(2ppb): hút chính xác 1ml dung dịch chuẩn gốc hỗn hợp vào bình định mức 10ml rồi định mức tới vật bằng Metanol.

Dung dịch chuẩn: hút chính xác lần lượt 0ml, 1ml, 2ml, 4ml, 8ml, 10ml, dung dịch chuẩn trung gian vào các bình định mức 10ml rồi định mức tới vạch bằng Metanol Các dung dịch chuẩn

thu được có nồng độ Aflatoxin lần lượt như sau :

5.Chuẩn bị mẫu thử

 Dùng cân phân tích cân chính xác 50,0 g mẫu (m) đã được băm nhuyễn cho vào ống ly tâm thuỷ tinh dung tích

250 ml.

 Thêm 100,0 ml clorofom vào ống rồi trộn đều trong

khoảng 2 phút bằng máy nghiền đồng thể.

 ly tâm ống bằng máy ly tâm trong khoảng 10 phút ở tốc

độ 3000 vòng/phút

 Tiến hành lọc dịch chiết và rửa phần bã bằng clorofom

rồi cho tất cả dịch thu được vào bình cầu thuỷ tinh dung

tích 250 ml

6 Làm sạch dịch chiết

6.1 Chuẩn bị cột

 Ðặt 1 lớp bông thủy tinh vào đáy cột thủy tinh có khóa teflon Ðóng khóa và cho clorofom tới khoảng 2/3 cột rồi thêm lần

lượt 5,0 g sulfat natri khan , 20,0g silicagel đã hoạt hóa , 15 g

sulfat natri khan

 Chú thích: để tránh khô cột luôn giữ mực clorofom cao hơn lớp sulfat natri khan trên cùng khoảng 1,5 cm

Ðiều chỉnh khoá để tốc độ chảy của dung dịch ra khỏi cột

khoảng từ 0,8 đến 1,2 ml/phút Trong giai đoạn này, aflatoxin sẽ hấp phụ lên các hạt silicagel

 Thêm vào cột lần lượt 50,0 ml n-hexan, 50,0 ml ete etylic Ðiều chỉnh tốc độ dung môi chảy qua cột ở 0,8 ml/phút Sau đó loại bỏ dịch chảy ra khỏi cột

 Giải hấp các aflatoxin khỏi cột làm sạch bằng 50,0 ml hỗn hợp clorofom và metanol theo tỉ lệ về thể tích là 97: 3 với tốc

dộ 0,8 ml/phút

 Hứng dung dịch chảy ra khỏi cột vào bình cầu dung tích 100

ml Cô dịch thu được trên hệ thống cô quay chân không ở nhiệt

độ 40o C cho đến khô hoàn toàn

Cột sắc ký

7.2 Tiến hành thực hiện.

 Tiêm các dung dịch chuẩn vào máy HPLC theo thứ tự nồng độ từ thấp đến cao

Mỗi dung dịch tiêm 2 lần, tính diện tích pic trung bình

Dựng đường chuẩn biểu thị mối quan hệ giữa các diện

tích pic thu được và nồng độ

từng loại aflatoxin theo quan

hệ tuyến tính bậc 1 (phương trình y = ax + b)

8 Yêu cầu về độ tin cậy của phép phân tích

8.1 Độ lặp lại của hai lần tiêm.

 Độ lệch chuẩn tính theo diện

tích pic sắc ký của hai lần tiêm

cùng một dung dịch chuẩn phải

nhỏ hơn 0,5%.

8.2 Độ thu hồi (R)

 Độ thu hồi tính được phải nằm

trong khoảng từ 85 -115%, độ thu

hồi trung bình phải lớn hơn 90%.

 Đường chuẩn phải có độ tuyến

tính tốt, hệ số tương quan hồi quy

tuyến tính (R 2 ) phải lớn hơn hoặc

bằng 0,99. Đường chuẩn của Aflatoxin B2

9 Tính kết quả

 Hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính trên cơ sở đường chuẩn thu được Với đường chuẩn ở dạng y = ax + b, hàm lượng các aflatoxin có trong mẫu được tính theo công thức sau: Trong đó: C= (Y-b)xF

a

• C là nồng độ aflatoxin có trong mẫu (ppb).

• Y là hiệu số giữa diện tich pic của dịch chiết và diện tích pic có trong mẫu trắng tiêm vào HPLC, tinh theo đơn vị diện tich.

• a, b là các thông số của đường chuẩn y = ax + b.

• F là hệ số pha loãng mẫu và có giá trị bằng tỉ số giữa thể tích dịch chiết thu được sau khi làm sạch (V) và khối lượng mẫu (m) sử dụng