66 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sinh trưởng của nâm men 66 4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sử dụng cơ chất trong
Trang 1Mttận íUỈn tết nghiệp.
LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin cảm ơn các thầy cô trường Đại học Bách Khoa Tp.HCM đã tận tình dạy bảo, xây dựng những kiến thức cơ bản cần thiết cho em trong quá trình học tập và nghiên cứu tại trường.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến cô Tôn Nữ Minh Nguyệt và thầy Lê Văn Việt Mẫn vì sự giúp đỡ và hướng dẫn tận tình mà thầy cô đã dành cho em trong suốt quá trình làm luận văn.
Mặc dù gặp nhiều khó khăn trong thời gian vừa qua, nhưng sự động viên, giúp đỡ của các thầy cô, bạn bè và gia đình đã giúp em hoàn thành tốt nhiệm vụ được giao Em xin chân thành cảm ơn tất cả những người đã giúp đỡ em hoàn thành tốt luận văn này.
Tp Hồ Chí Minh, tháng 1/2008
Nguyễn Đức Ninh
Trang 2MỊJC LỊJC
Chương 1: GIỚI THIỆU 1
Chương 2: TỔNG QUAN 3
2.1 TỔNG QUAN VE RƯỢU VANG, NHO VÀ NAM MEN DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU VANG 3
2.1.1 Rượu vang 3
2.1.2 Nho 7 4
2.1.3 Nấm men 8
2.2 CỐ ĐỊNH NẤM MEN 11
2.2.1 Sơ lược một sô" vân đề về kỹ thuật cô" định tê" bào 11
2.2.2 Các chất mang cô" định nâ"m men trong sản xuất rượu vang 13
2.2.3 Cô" định nâ"m men trong gel alginate 18
2.2.4 Một sô" tính chất của nâm men cô" định 24
2.3 ẢNH HƯỞNG CỦA CÁC YÊU Tố CÔNG NGHỆ ĐEN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG 30
2.3.1 Ảnh hưởng của hàm lượng đường 30
2.3.2 Ảnh hưởng của pH 34
2.3.3 Ảnh hưởng của hàm lượng SOỊ 36
2.3.4 Anh hưởng của tannin 38
2.3.5 Ánh hưởng của nhiệt độ 39
2.4 ỨNG DỤNG CỦA KỸ THUẬT cố ĐỊNH TRONG SẢN XUAT RƯỢU VANG 42 2.4.1 Dùng kỹ thuật cô" định để khắc phục một sô" vân đề trong sản xuất rượu vang42 2.4.2 Dùng kỹ thuật cô"định trong một sô"phương pháp lên men 45
2.4.3 Dùng kỹ thuật cô" định trong sản xuất một sô" loại rượu vang 48
Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 51
3.1 NGUYÊN LIỆU 51
3.1.1 Nho 51
3.1.2 Nấm men 52
3.1.3 Alginate 52
3.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52
3.2.1 Mục đích và nội dung nghiên cứu 52
3.2.2 Phương pháp cô" định nấm men trong gel alginate 54
3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá trình lên men rượu vang nho sử dụng nấm men cô" định trong gel alginate 55
3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến động học quá trình lên men rượu vang nho, sử dụng nấm men cô định trong gel alginate 56
3.2.5 Xử lý kết quả 56
3.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 58
3.3.1 pH 58
3.3.2 Nồng độ chất khô 58
3.3.3 Hàm lượng đường khử 58
3.3.4 Hàm lượng nitơ amin tự do 59
1
Trang 3Mttận íUỈn tết nghiệp.
3.3.5 Hàm lượng nitơ ammonium 61
3.3.6 Hàm lượng tannin 62
3.3.7 Hàm lượng sulfur dioxide 62
3.3.8 Hàm lượng ethanol 63
3.3.9 Hàm lượng acid tổng 65
3.3.10Hàm lượng acid dễ bay hơi 65
3.3.11 Mật độ tế bào 65
Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 66
QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG sử DỰNG NAM MEN cố ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE
66 4.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sinh trưởng của nâm men 66 4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình sử dụng cơ chất trong quá trình lên men 69
4.1.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến động học quá trình tạo sản phẩm 76
4.1.3 Kết luận chung 83
3.2 KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA HÀM LƯỢNG TANNIN ĐEN ĐỘNG HỌC QUÁ TRÌNH LÊN MEN RƯỢU VANG sử DỤNG NÂM MEN cố ĐỊNH TRONG GEL ALGINATE 84
4.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình sinh trưởng của nấm men 84
4.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình sử dụng cơ chất trong quá trình lên men 86
4.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tannin đến động học quá trình tạo sản phẩm 91
3.2.4 Kết luận chung 97
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ KIEN NGHỊ 98
5.1 KẾT LUẬN 98
5.2 KIẾN NGHỊ 98
TÀI LIỆU THAM KHẢO 99
11
Trang 4Bảng 2.6: Tô"c độ sử dụng cơ chất và hình thành sản phẩm của nâ"m mencô" địnhtrong gelalginate và nâ"m men tự do 26
Bảng 2.7: Các hợp châ"t hương chính của rượu vang tạo bởi nâ"m men cô" định và nâ"m men
tự do trong khoảng nhiệt độ 15 - 20°c 29Bảng 2.8: Thành phần của rượu vang trắng lên men bằng 4 loại nâm men cô định tronggel alginate và nâ"m men tự do 30Bảng 2.9: Ấnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến động học quá trình lên men trongquá trình lên men tĩnh rượu vang ở 30°c bởi tê" bào cô" định sây thăng hoa (freeze-driedgluten supported biocatalyst - FGB), tê" bào tự do sây thăng hoa (freef reeze-dried cells -ffdc) và tê" bào cô" định chưa qua sây (wet gluten supported biocatalyst - WGB) 33Bảng 2.10: Các nguyên nhân cơ bản gây ra hiện tượng kéo dài thời gian lên men hoặc quátrình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn rất cao 44Bảng 2.11: Năng suất sinh cồn trong quá trình lên men dịch nho bởi nấm men cô" định trênkissiris, Ỵ-alumina và alginate tại 7, 13 và 27°c 47Bảng 2.12: Các hợp chất dễ bay hơi tạo thành trong suốt quá trình lên men liên tục rượuvang sử dụng nâ"m men cô" định trên miếng táo và quá trình lên men tĩnh sử dụng nâ"mmen tự do Quá trình lên men được thực hiện ở 30°c 48
Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 51
Bảng 3.1: Thành phần của dịch nho sau khi ép 52Bảng 3.2: Các chất bổ sung vào dịch nho khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đườngban đầu đến quá trình lên men 56Bảng 3.3: Các châ"t bổ sung vào dịch nho khi khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng tanninban đầu đến quá trình lên men 56
Chương 4: KẾT ỌUẢ và BÀN LUẬN 66
Bảng 4.1: Anh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh trưởng riêng cực đạicủa nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nâ"m men tự do và nâ"m men cô"định trong gel alginate 68
Trang 5Mttận íUỈn tết nghiệp.
Bảng 4.2: Anh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng đường sót trong quá
trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nâm men cô định trong gel alginate
7 7 ! 7.7 77 70
Bảng 4.3: Ấnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường cực đại
của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cốđịnh trong gel alginate 71
Bảng 4.4: Ẩnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường riêng cực
đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định tronggel alginate 71
Bảng 4.5: Độ lên men ứng vđi hàm lượng đường ban đầu khác nhau 72 Bảng 4.6: Anh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến thời gian lên men rượu vang sử
dụng nấm men tự do và nấm men cô" định trong gel alginate 72
Bảng 4.7: Anh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình
trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gelalginate 73
Bảng 4.8: Anh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng cồn đạt được trong
quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gelalginate 76
Bảng 4.9: Anh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại
trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gelalginate 77
Bảng 4.10: Anh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng
cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cô" địnhtrong gel alginate 78
Bảng 4.11: Anh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung
bình của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nám men tự do và nấm men
cố định trong gel alginate 79
Bảng 4.12: Anh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn
trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nâm men tự do và nâm men cô định trong gelalginate 81
Bảng 4.13: Anh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tôc độ sinh trưởng riêng cực đại
trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cô" định trong gelalginate 86
Bảng 4.14: Anh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hàm lượng đường sót trong quá
trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nâm men cô định trong gel alginate 87
Bảng 4.15: Anh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tô"c độ sử dụng đường cực đại
trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nâm men tự do và nâm men cô định trong gelalginate 87
Trang 6Bảng 4.16: Anh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường riêng cực
đại (chỉ xét cho giá trị cực đại đầu tiên) trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấmmen tự do và nấm men cố định trong gel alginate 88
Bảng 4.17: Ấnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến thời gian lên men rượu vang sử
dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate 89
Bảng 4.18: Ấnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình
trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gelalginate 90
Bảng 4.19: Ấnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tô"c độ sinh tổng hợp cồn cực
đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cô" định tronggel alginate 92
Bảng 4.20: Ấnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng
cực đạitrong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cô" địnhtrong gel alginate 93
Bảng 4.21: Ẩnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung
bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nâ"m men tự do và nấm men cố định trong
gel alginate 94
Bảng 4.22: Anh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn
trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cô" định trong gelalginate 94
Trang 7ẨUiậtĩ oăn tết nụhìệp
Danh mục các hình vẽ
Chương 2: TỔNG QUAN .3
Hình 2.1: Nho xanh và nho đỏ 4
Hình 2.2: Cơ chế của quá trình biến đổi các hợp chất nitơ bởi nấm men 6
Hình 2.3: Các acid không bay hơi trong rượu vang 6
Hình 2.4: cấu trúc phân tử của acid tannic 8
Hình 2.5: Các kỹ thuật cơ bản để cố định tế bào 11
Hình 2.6: cấu trúc của alginate 18
Hình 2.7: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài 19
Hình 2.8: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong 20
Hình 2.9: Con đường hình thành các chất tạo hương vị cho rượu vang 28
Hình 2.10: Hàm lượng ethanol (P) thay đổi theo thời gian ứng với các nồng độ cơ chất khác nhau 31
Hình 2.11: Tốc độ sử dụng glucose cực đại và tốc độ tạo thành ethanol cực đại khi hàm lượng đường thay đổi 31
Hình 2.12: Sự thay đổi hàm lượng đường theo thời gian 32
Hình 2.13: Sự sử dụng glucose trong suốt quá trình lên men 33
Hình 2.14: Khả năng tạo cồn của nấm men trong suốt quá trình lên men 33
Hình 2.15: Ẩnh hưởng của pH đến tốc độ lên men của nấm men cô" định và nâ"m men tự do 35
Hình 2.16: Ấnh hưởng của pH đến khả năng sông sót của nấm men cô" định 35
Hình 2.17: Ấnh hưởng của pH đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lên men .7 36
Hình 2.18: Ấnh hưởng của hàm lượng SƠ2 đến quá trình lên men rượu vang trắng 37
Hình 2.19: Ẩnh hưởng của SO2 đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lên men : 7 38
Hình 2.20: Ấnh hưởng của tannin đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lên men 39
Hình 2.21: Anh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng cồn tạo thành trong suốt quá trình lên men 40
Hình 2.22: Anh hưởng của nhiệt độ đến động học quá trình lên men rượu vang sử dụng nâ"m men cô" định trênDCM và nâ"m men tự do 41
Trang 8Hình 2.23: Sự chuyển hóa acid malic bởi nấm men tự do và nấm men
Schiiosaccharomyces pombe cô" định khi sử dụng các hàm lượng đường ban đầu khác nhau.
! „ 7 43
Hình 2.24: Động học của quá trình lên men rượu vang ở những nhiệt độ khác nhau sử dụng nấm men cô" định trên gluten 46
Chương 3: NGUYÊN LIỆU và PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 51
Hình 3.1: Quy trình ép nho 51
Hình 3.2: Sơ đồ nghiên cứu 53
Hình 3.3: Quy trình cô" định nấm men trong gel alginate bằng phương pháp tạo gel từ bên ngoài 54
Chương 4: KẾT QUẢ và BÀN LUẬN 66
Hình 4.1: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nâ"m men tự do và nâ"m men cỗ" định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 67
Hình 4.2: Sự thay đổi tô"c độ sinh trưởng riêng của nâ"m men trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nâ"m men tự do và nấm men cô" định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 67
Hình 4.3: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nâ"m men cô" định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 69
Hình 4.4: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nâ"m men tự do và nâ"m men cô" định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 69
Hình 4.5: Sự thay đổi tô"c độ sử dụng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nâ"m men tự do và nâ"m men cỗ" định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 70
Hình 4.6: Sự thay đổi tô"c độ sử dụng đường riêng trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nâ"m men tự do và nâ"m men cô" định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 70
Hình 4.7: Ẩnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tô"c độ sử dụng đường trung bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nâm men tự do và nâm men cô định trong gel alginate 73
Hình 4.8: Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin tự do trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nâm men tự do và nâm men cô định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 74
vii
Trang 9Mttận íUỈn tết nghiệp.
Hình 4.9: Sự thay đổi hàm lượng nitơ ammonium trong quá trình lên men rượu vang sử
dụng nấm men tự do và nấm men cô định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu
thay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 75
Hình 4.10: Sự thay đổi hàm lượng cồn trong trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng
nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổitrong khoảng 200 - 360g/L) 76
Hình 4.11: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn trong trong quá trình lên men rượu vang,
sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầuthay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 77
Hình 4.12: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng trong trong quá trình lên men rượu
vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đườngban đầu thay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 77
Hình 4.13: Anh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung
bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định tronggel alginate 78
Hình 4.14: Ấnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn
trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gelalginate 79
Hình 4.15: Sự thay đổi pH trong trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự
do và nấm men cô" định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trongkhoảng 200- 360g/L) 7 ĩ I 81
Hình 4.16: Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong trong quá trình lên men rượu vang sử
dụng nâm men tự do và nâm men cô định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầuthay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 81
Hình 4.17: Sự thay đổi hàm lượng acid dễ bay hơi trong quá trình lên men rượu vang sử
dụng nâm men tự do và nâm men cô định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầuthay đổi trong khoảng 200 - 360g/L) 82
Hình 4.18: Sự thay đổi mật độ tế bào nấm men trong quá trình lên men rượu vang, sử
dụng nâm men tự do và nâm men cô định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầuthay đổi trong khoảng 1,8 - 17,8g/L) 85
Hình 4.19: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu
vang, sử dụng nâm men tự do và nâm men cô định trong gel alginate (hàm lượng tanninban đầu thay đổi trong khoảng 1,8 - 9,8g/L) 85
Hình 4.20: Sự thay đổi tốc độ sinh trưởng riêng của nấm men trong quá trình lên men rượu
vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate khi hàm lượng tannin
ban đầu là 17,8g/L 86
viii
Trang 10Hình 4.21: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm
men tự do và nấm men cô" định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi
trong khoảng 1,8 - 17,8g/L) 86
Hình 4.22: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm
men tự do và nấm men cô" định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổitrong khoảng 1,8 - 17,8g/L) 87
Hình 4.23: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong quá trình lên men rượu vang sử dụng
nấm men tự do và nấm men cô" định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổitrong khoảng 1,8 - 17,8g/L) 87
Hình 4.24: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường riêng trong quá trình lên men rượu vang sử
dụng nấm men tự do và nâ"m men cô" định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầuthay đổi trong khoảng 1,8 - 17,8g/L) 88
Hình 4.25: Ánh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình
trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nâ"m men tự do và nấm men cô" định trong gelalginate 90
Hình 4.26: Sự thay đổi hàm lượng nitơ amin tự do trong quá trình lên men rượu vang, sử
dụng nâ"m men tự do và nâ"m men cô" định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầuthay đổi trong khoảng 1,8 - 17,8g/L) 90
Hình 4.27: Sự thay đổi hàm lượng nitơ ammonium trong quá trình lên men rượu vang sử
dụng nâm men tự do và nấm men cô định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầuthay đổi trong khoảng 1,8 - 17,8g/L) 91
Hình 4.28: Sự thay đổi hàm lượng cồn trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm
men tự do và nâ"m men cô" định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổitrong khoảng 1,8 - 17,8g/L) 92
Hình 4.29: Sự thay đổi tô"c độ sinh tổng hợp cồn trong quá trình lên men rượu vang sử
dụng nấm men tự do và nâm men cô định trong gel alginate khi hàm lượng tannin ban đầuthay đổi trong khoảng 1,8 - 17,8g/L 92
Hình 4.30: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng trong quá trình lên men rượu vang
sử dụng nâm men tự do và nâm men cô định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầuthay đổi trong khoảng 1,8 - 17,8g/L) 92
Hình 4.31: Ẩnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến tô"c độ sinh tổng hợp cồn trung
bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nâm men cô định tronggel alginate 93
Hình 4.32: Ẩnh hưởng của hàm lượng tannin ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn
trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nâ"m men cô" định trong gelalginate 94
Trang 11Mttận íUỈn tết nghiệp.
Hình 4.33: Sự thay đổi pH trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và
nâm men cô định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổi trong khoảng 1,8
- 17,8g/L) 7 7.96
Hình 4.34: Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong quá trình lên men rượu vang sử dụng
nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầu thay đổitrong khoảng 1,8- 17,8g/L) 96
Hình 4.35: Sự thay đổi hàm lượng acid dễ bay hơi trong quá trình lên men rượu vang, sử
dụng nấm men tự do và nấm men cô định trong gel alginate (hàm lượng tannin ban đầuthay đổi trong khoảng 1,8 - 17,8g/L) 96
Trang 12«- DCM : Delignified Cellulosic Material
Ffdc : free freeze-đried cells, là tế bào tự do sây thăng hoa
«■ NS : non -Sa ccharomyces, là những loài nâm men không thuộc giông
Saccharomyces.
«■ TD : Nấm men tự do
WGB : wet gluten supported biocatalyst, là tê" bào cô" định chưa qua sây
^ p : Tốc độ sinh trưởng riêng tức thời của tế bào, là tô"c độ sinh trưởng
tính trên một đơn vị tê bào tại một thời điểm nhất định Đơn vị: h’1
^ M-inax
: Tồ"c độ sinh trưởng riêng cực đại của tê" bào, là tốc độ sinh trưởngriêng lớn nhâ"t trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị: h'1
^ gs
: Tốc độ sử dụng đường tức thời của nâ"m men, là hàm lượng đường
mà nâ"m men sử dụng trong một đơn vị thời gian Đơn vị: g/L/h
^ Ỵsmax
: Tô"c độ sử dụng đường riêng cực đại của nâ"m men, là tô"c độ sử dụngđường riêng lớn nhâ"t trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị:g/h/1012 tê" bào
^ T : Tổng thời gian lên men, được xác định từ độ lên men Đơn vị: h
Ks
: Tôc độ sử dụng đường trung bình, là hàm lượng đường trung bìnhđược nâ"m men sử dụng trong một đơn vị thời gian lên men Đơn vị:g/L/h
gp : Tốc độ sinh tổng hợp cồn tức thời của nâ"m men, là hàm lượng cồn
mà nâ"m men sinh tổng hợp được trong một đơn vị thời gian Đơn vị:g/L/h
Trang 13<ễr CT
gpmax : Tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại của nấm men, là tốc độ sinh tổng
hợp cồn lớn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị: g/L/h
Ỵp
: Tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng tức thời của nấm men, là tốc độ sinhtổng hợp cồn tính trên một đơn vị tế bào tại một thời điểm nhấtđịnh Đơn vị: g/h/1012 tế bào
^ ỴPmax
: Tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng cực đại của nấm men, là tốc độ sinhtổng hợp cồn riêng lđn nhất trong toàn bộ quá trình lên men Đơn vị:g/h/1012 tế bào
®- Kp
: Tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình, là hàm lượng cồn trung bìnhđược nấm men sinh tổng hợp trong một đơn vị thời gian lên men.Đơn vị: g/L/h
^ T|
: Hiệu suất sinh tổng hợp cồn, là sô" mol ethanol được tạo thành từmột mol glucose được nấm men sử dụng Đơn vị: mol ethanol/ molglucose
Xll
Trang 14Chương 18 GIỚI THIỆU
Như chúng ta đã biết, rượu vang là một trong những sản phẩm lên men có lịch sử lâuđời nhất Theo các tài liệu cổ, rượu vang có xuất xứ từ các nước Á Rập vào khoảng thế kỷ
18 hay 19 trước Công nguyên và cho đến nay, rượu vang đã trở nên phổ biến khắp nơitrên thế giới Rượu vang được ưa thích trước hết là do hương vị hết sức đặc trưng màkhông loại sản phẩm nào có thể thay thế, sau đó là do nó đem lại cảm giác sảng khoái vàsức khỏe cho người uống
Đầu tiên, rượu vang được tạo ra bằng quá trình lên men tự phát Sau đó, người ta đã
tiến hành phân lập các chủng nấm men và cấy vào dịch lên men loài Saccharomyces
cerevisiae thuần thiết để thúc đẩy quá trình lên men và tăng chất lượng của rượu vang.
Tuy nhiên, việc sử dụng nấm men tự do để lên men có khá nhiều nhược điểm:
- Thời gian lên men dài, năng suất lên men thấp
- Tiêu tốn nhiều năng lượng để tách nấm men ra khỏi rượu vang sau quá trình lênmen
- Khả năng tái sử dụng nấm men rất thấp
- Khó tự động hóa quá trình lên men
Để khắc phục các nhược điểm này, nhiều nghiên cứu về việc sử dụng nấm men cốđịnh trong sản xuất rượu vang đã được thực hiện Các nghiên cứu này đều cho thấy nấmmen cô" định có nhiều ưu điểm hơn hẳn so với nấm men tự do:
- Tăng tốc độ sử dụng cơ chất, rút ngắn thời gian lên men
- Ôn định hoạt tính của nấm men Các chất mang cô" định có tác dụng như là một tácnhân bảo vệ tê" bào chông lại những ảnh hưởng bâ"t lợi của pH, nhiệt độ, dung môi và ngay
cả các kim loại nặng
- Dễ dàng tách nấm men ra khỏi sản phẩm sau quá trình lên men, do đó làm giảmchi phí về thiết bị và năng lượng
- Có thể tái sử dụng nâ"m men nhiều lần
- Tạo điều kiện thuận lợi cho việc tôi ưu hóa và tự động hóa quá trình lên men
Các nghiên cứu trước đây về ứng dụng nâ"m men cô" định trong sản xuất rượu vang chủyêu khảo sát quá trình sử dụng đường, quá trình sinh tổng hợp cồn và sự hình thành cáchợp châ"t hương mà ít đề cập đến động học quá trình sinh trưởng của nâ"m men, quá trình
sử dụng các hợp châ"t nitơ cũng như sự chuyển hóa của các acid hữu cơ trong suô"t quá trìnhlên men chính Chúng tôi cũng tìm thây râ"t ít các nghiên cứu về ảnh hưởng của một sôyêu tô" công nghệ trong quá trình sản xuất đến động học quá trình lên men rượu vang sửdụng nấm men cô" định như ảnh hưởng của hàm lượng tannin, hàm lượng SƠ2 trong dịchnho ban đầu Tuy nhiên, các nghiên cứu này cũng chỉ khảo sát quá trình sinh tổng hợp cồn
Qỉvanạ 1
Trang 15(UuíơtUỊ 1: £ịìâi thiệu
mà chưa khảo sát một cách toàn diện ảnh hưởng của các yếu tô" này đến tất cả các mặttrong quá trình lên men chính
Trên cơ sở đó, chúng tôi đề xuất đề tài nghiên cứu “Khảo sát ảnh hưởng của các yếutô" công nghệ đến động học quá trình lên men rượu vang nho sử dụng nâ"m men cô" định”.Chúng tôi tiến hành khảo sát ảnh hưởng của 4 yếu tô" công nghệ, bao gồm: pH, hàm lượngđường, hàm lượng SƠ2 và hàm lượng tannin ban đầu Tuy nhiên, trong phạm vi bài luậnvăn này, tôi chĩ xin trình bày sư ảnh hưởng của 2 yếu tô" là hàm lượng đường và hàm lượngtannin ban đầu Kết quả về sự ảnh hưởng của pH và hàm lượng SO2 trong dịch nho đếnquá trình lên men sẽ do một bạn khác trình bày
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chất mang là alginate - một polysacchariđethu được từ rong mơ phân bô" dọc theo bờ biển miền Trung của Việt Nam Chúng tôi lầnlượt khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường và hàm lượng tannin ban đầu đến các vân
đề sau:
- Động học quá trình sinh trưởng của nâ"m men
- Động học quá trình sử dụng cơ châ"t: đường khử, nitơ arnin và nitơ vô vơ
- Động học quá trình hình thành sản phẩm: do thời gian hạn hẹp và chưa có điều kiện
về kinh phí nên trong phạm vi bài luận văn này, chúng tôi chỉ trình bày sản phẩmquan trọng nhất của quá trình lên men là cồn mà chưa trình bày các hợp chất hương
Và chúng tôi cũng khảo sát thêm sự chuyển hóa của các acid hữu cơ trong suô"t quátrình lên men chính
&rang 2
Trang 16Acid hữu cơ
(tartaric, malic và một ít lactic, succinic, oxalic, )
0,9
0,6Khoá ng
(potassium, calcium và một ít sodium, magnesium,
iron, )
Phenols
(các rìavonoid như là các chất màu cùng với các
nonílavonoid như là cinnamic acid và vanillin)
Trang 17'~ĩl r tuu/ 3
(Htiíơng 2: Cĩổng tỊMtut
2.1.2.1 Phân loại
Phân loại khoa học của nho [217]:
• Giới (regnum) : Plantae
• Ngành (divisio) : Magnoliophyta
• Lớp (clciss) : Magnoỉìopsida
• Bộ (ordo) : Viíales
• Họ ựamilia) : Vitaceae
• Chi (genus) : Vitis
Trong đó, loài Vitis viniýera là thích hợp nhất để sản xuất rượu vang vì loài này
chứa [216]:
- Hàm lượng các chất dinh dưỡng cao, cần thiết cho sự phát triển của nấm men vang
- Hàm lượng acid khá cao, đủ để ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không mongmuôn trong và sau quá trình lên men
- Hàm lượng đường đủ để tạo ra hàm lượng cồn cao, nhờ đó ức chế được các vi sinhvật gây hư hỏng trong rượu vang
- Các hợp chất hương với thành phần và lượng thích hợp, vì thế rượu vang tạo thành
có tính chất cảm quan tốt
Dựa vào nguồn gốc giông nho, có thể chia thành 2 nhóm cơ bản là [1] :
• Nho trắng: trái nho khi chín vỏ không có màu hoặc màu vàng lục nhạt
• Nho đỏ: trái nho khi chín vỏ có màu đỏ - tím ở những mức độ khác nhau (Hình
tj*ang 4
Trang 182.1.2.2 Thành phần hóa học
Thành phần hóa học của nho thay đổi theo giông, độ chín, thời vụ thu hoạch, điều kiệnđất đai, khí hậu, kỹ thuật canh tác Thành phần cơ bản của nho được nêu ra như trongbảng 2.1
Một số các hợp chất quan trọng trong nho và rượu vang:
Dịch nho trưđc khi lên men thường chứa tỷ lệ cân bằng của glucose và íructose Trong
suốt quá trình lên men, tất cả các chủng Saccharomỵces cerevisiae đều ưu tiên sử dụng
glucose hơn là ửuctose Hàm lượng ethanol cao có tác động ức chế mạnh sự sử dụngíructose hơn là glucose Trong khi đó, bổ sung nitơ vào dịch nho sẽ kích thích sự sử dụngíructose hơn là glucose [26, 491-
ị- Nitơ
Các hợp chất nitơ rất cần cho sự phát triển và trao đổi chất của nấm men Trong sô"các chât dinh dưỡng mà nâm men có thể sử dụng được trong suôt quá trình lên men dịchnho, về sô" lượng, nitơ là thành phần quan trọng thứ hai sau các hợp chất carbon Có nhiềuhợp châ"t chứa nitơ có mặt trong dịch nho, với hàm lượng thay đổi từ 60 - 2400mg/L [85]
Saccharomyces cerevisiae có khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau để phát
triển, nhưng không phải tất cả các nguồn nitơ đều hỗ trợ phát triển tô"t như nhau Cácnguồn nitơ tô"t là ammonium, glutamine và asparagine, trong khi đó proline và urea đượcxem như là những nguồn nitơ kém chât lượng [24, 85]
Tất cả các hợp chất chứa nitơ tích lũy trong dịch nho bị biến đổi thành một trong haisản phẩm cuô"i là ammonium hoặc glutamate (Hình 2.2) Glutamate cùng với glutamineđóng một vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi nitơ của nâ"m men Từ 2 amino acidnày tất cả các hợp châ"t chứa nitơ trong tê"bào được tạo ra [85]
ị~ Acid hữu cơ
Trong nho và rượu vang, 6 aciđ chiếm thành phần chính là acid tartaric, acid malic,acid citric, acid lactic, acid succinic và acid acetic (Hình 2.3, bảng 2.2) Trong đó, acidacetic là hợp chất dễ bay hơi còn các acid khác là acid không bay hơi
Độ phân ly của các acid này giảm theo thứ tự sau: acid citric, acid tartaric, acidmalic,acid succinic, acid lactic, và acid acetic
tj*ang 5
Trang 19Acid hữu cơ Dịch nho đỏ Rượu vang đỏ
tj*ang ổ
Trang 20i- S0 2
Sulíur dioxide được sử dụng rộng rãi trong rượu vang như là một chất chông oxy hóa,tác nhân kháng khuẩn và đồng thời cũng là tác nhân cho việc chọn lọc các loài hoặcchủng có thể phát triển và đóng góp vào quá trình lên men Trong rượu vang, SƠ2 tồn tại
ở 2 dạng: tự do và liên kết Nhưng chỉ SO2 tự do mđi có tính khử và diệt khuẩn Mặc dùvậy, một vài dạng SO2 liên kết có thể chuyển hóa thành SO2 tự do và có thể bù lại cholượng SO2 bị giảm trong quá trình lên men Vì thế, SO2 là một thông số quan trọng ảnhhưởng đến động học quá trình lên men và chất lượng rượu vang [22, 30, 48, 58, 63, 79, 90,143]
Bên cạnh đó, SO2 còn có ảnh hưởng xấu đến quá trình lên men rượu vang: dẫn tới kéodài thời gian lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn cao,
và ảnh hưởng đến tính chất cảm quan của rượu vang [48, 81 ]
ị~ Tannin
Trong các thập kỷ qua, thành phần polyphenolic được quan tâm do nó ảnh hưởng đếngiá trị cảm quan của rượu vang (màu sắc và mùi vị) và các giá trị dinh dưỡng khác (theoquan điểm về y học, tannin được xem là chất chống oxi hóa, chống khôi u và bệnh mạchvành) [64,31,51, 165,80, 174,29,99, 157]
Tannin xuất phát từ chữ “tanning” có nghĩa là thuộc da vì tannin có khả năng phảnứng và kết tủa vđi các protein có trong da động vật [87] Tannin có ở 2 dạng là tanninngưng tụ và tannin thủy phân [216]:
— Tannin thủy phân: có nguồn gốc từ các acid phenolic như là acid gallic và acidellagic
- Tannin ngưng tụ: là polymer của flavan-3-ol (epicatechin, catechin và
gallocatechin) và flavan-3,4-diol
Tannin có ở trong nho và rượu vang chủ yếu là các tannin ngưng tụ
[2161-Tannin có thể được thêm vào rượu vang dưới dạng acid tannic (Hình 2.4) để phản ứng
và kết tủa với protein và để cải thiện độ trong của rượu vang Trong suốt quá trình ủ, sựthay đổi hàm lượng tannin ngưng tụ sẽ ảnh hưởng đến màu sắc và tính chất cảm quan củarượu vang, và khi đó, khối lượng phân tử của tannin có thể tăng lên [216]
2.1.2.3 Tình hình trồng nho trên thế giới và Ở Việt Nam
Theo sô" liệu của FAO, 75.866km2 đâ"t trên thế giới được dùng để trồng nho Khoảng71% sản lượng nho được dùng sản xuất rượu vang, 27% được dùng để ăn dưới dạng quảtươi và 2% được sử dụng làm nho khô [217]
Khác với các loại trái cây khác của Việt Nam, nho là loại trái cây được du nhập từ cácnước trên thê giới vào Việt Nam từ những năm 1960 Nho trồng tập trung chủ yêu ở NinhThuận và Bắc Bình Thuận với diện tích khoảng 2.500 — 7.000 ha Đặc biệt tại vùng NinhThuận, cây nho rất có tiềm năng, năng suất khá cao, trên một hecta có thể thu được 30 -
40 tân mỗi năm Giông nho đầu tiên được trồng là giông nho đỏ ăn tươi Red Cardinal Cho
Qivanq 7
Trang 21(UníơtỉíỊ 2: Cĩổng tỊMtut
tới bây giờ, đây vẫn là giông nho chủ lực do sản lượng tương đôi cao Giông này tồn tạitrên 30 năm Trước năm 2000, giông này chiếm 100% diện tích trồng nho tại Việt Nam,nhưng hiện nay chỉ chiếm khoảng 80% Giống nho xanh NH01 - 48 được nhập từ TháiLan từ năm 1997 chiếm gần 20% diện tích trồng nho hiện nay Ngoài ra, chúng ta cũng cómột sô giông mới nhập khác nhưng chỉ chiếm một diện tích trồng rất nhỏ [215]
HO OH
HO ÒH Hình 2.4: cấu trúc phân tử của acid tannic
Nấm men là vi sinh vật quan trọng, kiểm soát quá trình lên men cồn trong sản xuấtrượu vang Nấm men trong quá trình lên men rượu vang có thể có từ 3 nguồn gốc khácnhau: bề mặt trái nho, bề mặt thiết bị và từ canh trường được cấy vào Thành phần và chấtlượng của rượu vang có liên quan chặt chẽ đến nấm men Trong quá trình lên men, bên
cạ nh các sản phẩm chính là ethanol và CƠ2, nâm men tạo thành nhiều sản phẩm phụ, ví
dụ như glycerol, acid acetic, acid succinic và đặc biệt là các hợp chất hương, góp phầnđáng kể vào chất lượng của rượu vang [9, 89, 92, 151, 163]
Nấm men có thể được phân thành 2 nhóm:
- Thứ nhất gọi là non-Saccharomyces (NS - là những loài nấm men không thuộc giông Saccharomyces), thường xuất hiện trên bề mặt của trái nho cùng vđi nhiều
loại vi sinh vật khác Hầu hết các loài NS không có khả năng tồn tại khi nồng độ
cồn cao hơn 6%v/v (ngoại trừ Brettanomyces bruxellensis có thể phát triển trong
môi trường có nồng độ cồn lên đến 12%) Trước đây, nấm men NS được xem là các
It íU ỈÍỊ s
Trang 22vi sinh vật gây hư hỏng Tuy nhiên, những nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, mộtsô" loài nấm men NS có lợi cho chất lượng rượu vang, giúp tăng cường hương vị củarượu vang [23,41,42, 45, 149, 166, 207].
- Nhóm khác góp phần vào hương vị rượu vang, cũng là nhân tô" chính của quá trình
lên men cồn là các loài thuộc giông Saccharomyces Saccharomỵces có khả năng
chịu đựng sự thay đổi của điều kiện môi trường với nồng độ ethanol và acid hữu cơtăng và sự cạn kiệt châ"t dinh dưỡng (Pretorius, 2000) Như vậy, mặc dù có nhiều
giông và loài nâ"m men trong dịch nho, nhưng giông Saccharomỵces, mà chủ yếu là loài Saccharơmỵces cerevisiae mới là loài đảm nhiệm việc thực hiện các quá trình chuyển hóa sinh học quan trọng trong lên men vang Chính vì thế, Saccharomyces
cerevisiae còn được gọi là “nấm men vang” [58,85,92, 149, 166, 199].
2.1.3.2 Trình tự lên men của các giông nấm men trong quátrình lên men vang
Quá trình lên men rượu vang có thể được tiến hành một cách tự nhiên mà không cầncây giông hoặc bằng cách cây vào dịch nho các nâm men vang chọn lọc Việc lên mendịch nho được thực hiện bởi một hệ vi sinh vật phức tạp, trong đó các chủng nâ"m men pháttriển và chết tùy theo sự thích nghi của chúng đôi với môi trường Tương tác nâ"m men-nâ"m men xảy ra trong suốt quá trình sản xuất rượu vang ngay từ khi bắt đầu quá trình lênmen cồn Trong quá trình lên men tự nhiên, các nấm men có mặt trong nho nguyên liệu
như là Kloeckera apỉculata, Hansenula, Hanseniaspơra uvarum, Pichia và Candida spp.
khởi đầu quá trình lên men cồn từ dịch nho Các nấm men này chết dần khi hàm lượng
cồn tăng, chỉ còn lại Saccharomyces cerevisiae có khả năng chịu được hàm lượng cồn cao
tiếp tục quá trình lên men cho đến khi kết thúc Sự chuyển biến này rất quan trọng vì các
chủng non-Saccharomyces thường tạo ra các hợp châ"t không mong muôn như rượu bậc
cao, acid acetic và acetaldehyde Sự biên mất hoặc giảm mật độ của giông
non-Saccharomyces có thể là do khả năng chịu đựng cồn thâ"p, hoặc bị ức chê" bởi các châ"t diệt
men (acid béo mạch ngắn và trung bình, glycoprotein, ) hoặc do hàm lượng oxy vànitrogen còn lại thấp Các quá trình lên men có kiểm soát thường được thực hiện bằng
cách cây canh trường Saccharomyces cerevisicie thuần khiết, nhờ đó quá trình lên men
diễn ra nhanh hơn và có thể tạo ra rượu vang với hương vị đặc trưng [25, 42, 44, 46, 48,
61, 84, 85, 89, 90, 92, 122, 139^ 149, 151, 161, 163,
1661-Tuy nhiên, theo nhiều tác giả thì khi có các loài nâ"m men non-Saccharomyces phát
triển trong rượu vang với một mức độ vừa phải, hương vị của rượu vang sẽ phong phú hơn
và được ưa thích nhiều hơn so với rượu vang chỉ được lên men từ giông Sciccharomyces
[90]
2.1.3.3 Chỉ tiêu chọn lựa nấm men vang
Ngoài vai trò quan trọng của nấm men vang là xúc lác việc chuyển hỏa hoàn toàn và
có hiệu quả đường thành cồn mà không tạo ra các hương vị không mong muôn thì ngày
nay, do yêu cầu ngày càng cao, canh trường Saccharomyces cerevisiae cần phải có nhiều
đặc tính khác, như liệt kê trong bảng 2.3 [85] Tuy nhiên, để có thể kiểm tra hết tất cả các
'~ĩl r tuu/ Ọ
Trang 23Đặc tính lên men Đặc tính công nghệ
Thích nghi với quá trình lên men nhanh Tính ổn định cao về mặt di truyền
Tốc độ sử dụng cơ chất và tốc độ hình thành Khả năng chịu sulphite cao
Khả năng chịu cồn cao ít tạo bọt
Khả năng chịu áp suất thẩm thấu cao Có khả năng kết bông
Sinh khôi tạo thành vừa phải Kết lắng cặn nhanh
Các tính chất về hương vị Nhu cầu nitơ thấp
Tạo thành ít sulphite/DMS/thiol Các đặc tính trao đổi chất có liên quan đến
Tạo thành ít acid dễ bay hơi sức khỏe con người
Tạo thành ít rượu bậc cao Tạo thành ít sulphite
Giải phóng ra các tiền chất hương glycosylate Tạo thành ít biogenic amine
Hoạt tính esterase thấp Tạo thành ít ethyl carbamate (urea)
2.1.3.4 Kết hợp các giông nấm men và sử dụng kỹ thuật ditruyền trong sản xuất rượu vang
Theo nghiên cứu của Renouí và cộng sự (2006), việc sử dụng kết hợp Saccharomyces
cerevisiae và Brettanomyces bruxellensis sẽ rút ngắn thời gian lên men do Brettanomyces bruxellensis có khả năng chuyển hóa glucose và íructose thành ethanol và chịu được hàm
lượng cồn cao Còn kết hợp giữa Saccharomyces cerevisỉae và Candida stellata sẽ làm
tăng hàm lượng glycerol, tăng tốc độ lên men và chất lượng rượu vang [41, 42, 44, 166,194]
Trong những năm gần đây, kỹ thuật di truyền đã được ứng dụng để cải thiện các đặctính của nấm men vang:
- Shinohara và cộng sự (1994) đã nghiên cứu việc chọn lọc và lai giông các chủngnấm men vang để cải thiện tốc độ lên men, tăng khả năng chịu đựng đôi với SO2 vàlàm tăng chất lượng rượu vang [178]
- Serra và cộng sự (2005) đã nghiên cứu việc lai tạo giữa Saccharomyces cerevisiae
và Saccharomyces bciyanus var uvcirum đê kết hợp ưu điểm của 2 loài này, làm tăng
chất lượng sản phẩm trong sản xuất rượu vang có hàm lượng acid thấp (pH cao)[175]
'~ĩi r aíitf 10
Trang 24CHÁT MANG RÁN NHỐTTRONG KHUNG MẠNG XÓP
KEO TƯ TÊ BAO (TẠO HẠT I NHỐT BẰNG PHƯƠNG PH A P CƠ
Hình 2.5: Các kỹ thuật cơ bản để cô" định tê" bào [113]
$Jfang 11
Trang 25Cố định trên bề
mặt chất mang rắn
Nhốt trong khung mạng xốp
Keo tụ tế bào (tạo hạt)
Nhốt bằng phương pháp cơ học bên trong một màng chắn Nguyên
tắc Dựa vào lực hấpphụ vật lý, liên kết
tĩnh điện hoặc liên
sự vận chuyển cácchất dinh dưỡng và sựtrao đổi chất diễn ra[113]
Làm gia tăngkích thước củakhối tế bào để dễdàng sử dụngtrong các bìnhphản ứng Có thể
là keo tụ tự nhiênhoặc là keo tụnhân tạo bằngcách tạo thànhcác liên kếtngang [113]
Phương pháp này
có thể được thựchiện theo 2 cách[113]:
— Sử dụng màngmembrane vi xốp
- Chất mang có tácdụng bảo vệ tế bàochống lại thực khuẩnhoặc tế bào ngoại lạicũng như những điềukiện gây stress [1381
— Đơn giản, dễthực hiện
- Không ảnhhưởng đến quátrình truyền khôi
Canh trường lênmen không bị lẫn
tế bào, do đó sảnphẩm tạo thành cóthể không cần lọc[113, 138]
— Tế bào trên bề mặt
dễ thoát ra khỏi mạnggel và phát triển trongmôi trường như là các
tế bào tự do [113, 39]
— Do không cómàng chắn giữacác tế bào vàdung dịch chonên các tế bào
dễ bị tách ra, làmtăng hàm lượng
tế bào tự do trongdung dịch
- Khả năngtruyền khôi kém[113]
- Màngmembrane có thể
bị bám bẩn do sựhấp phụ cơ chấtlên bề mặt màng[113]
Trang 26mặt chất mang rắn mạng xô"p (tạo hạt) học bên trong
một màng chắn Chất
— Polymer tổng hợp:
polyacrylamide,polyurethane vàpolyvinyl chloride[138]
Membrane làmbằng vật liệucellulose acetate,polyamide [138]
Trang 27Phân loại chất mang Một sô chất mang chính Vi sinh vật Tác giả Tài liệu tham khảo
CHẤT MANG KHÔNG CÓ NGUồN Gốc THựC PHAM
Chất mang vô cơ Ỵ-alumina Saccharomyces cerevisiae Bakoyianis và cộng sự, 1997 14
Kourkoutas và cộng sự, 2003 108Kourkoutas và cộng sự, 2006 105Loukatos và cộng sự, 2000 125
Hydromica Saccha romyces ce re vi siae Ageeva và cộng sự, 1985 5
Kissiris Saccharomyces cerevisiae Argiriou và cộng sự, 1996 11
Bakoyianis và cộng sự, 1992 13Bakoyianis và cộng sự, 1997 14Kourkoutas và cộng sự, 2003 108Kourkoutas và cộng sự, 2006 105Loukatos và cộng sự, 2003 124
Montmorilonite Saccha romyces ce re vi siae Ageeva và cộng sự, 1985 5
Polygorskite Saccha romyces ce re vi siae Ageeva và cộng sự, 1985 5
Thủy tinh Saccha romyces ce re vi siae Hamdy, 1990 88
Chất mang hữu cơ K-carrageenan Saccharomyces cerevisiae Gòdia và cộng sự, 1991 83
Nakanishi và Yokotsuka, 1987 147Tataridis và cộng sự, 2005 193
Acid pectic Saccha romyces ce re vi siae Nakanishi và Yokotsuka, 1987 147
Qivanq 14
Trang 28Chất mang hữu cơ Agar Saccha rom yces ce re vỉsiae Nakanishi và Yokotsuka, 1987 147
Ferraro và cộng sự, 2000 66Alginate Saccharomỵces bayanus Busova và cộng sự, 1994 33
Alginate Saccharomyces cerevisiae Bakoyianis và cộng sự, 1997 14
Colagrande và cộng sự, 1994 47Ferraro và cộng sự, 2000 65Fumi và cộng sự, 1987 70Fumi và cộng sự, 1988 71Fumi và cộng sự, 1989 72Gòdia và cộng sự, 1991 83
Suzzi và cộng sự, 1996 188Silva và cộng sự, 2002 179Shimobayashi và Tominaga, 1986 177Tataridis và cộng sự, 2005 193Yokotsuka và cộng sự, 1993 212Yokotsuka và cộng sự, 1997 214Yokotsuka và cộng sự, 2003 213
Alginate Schiiosaccharomyces pombe Magyar và cộng sự, 1989 126
Rosini và Ciani, 1993 168Silva và cộng sự, 2003 180Yokotsuka và cộng sự, 1993 212
Qivanq 15
Trang 29Phân loại chất mang Một sô chât mang chính Vi sinh vật Tác giả Tài liệu tham khảo Chất mang hữu cơ Cellulose được bao phủ bởi alginate Saccharomyces cerevisiae Otsuka, 1980 153
DCM (Deligniíied Cellulosic Material) Saccharomyces cerevisiae Bardi và Koutinas, 1994 17
Bardi và cộng sự, 1997 20Balli và cộng sự, 2003 15Loukatos và cộng sự, 2003 124Mallouchos và cộng sự, 2003 135
DEAE-cellulose được bao phủ bởi lớpnhựa trao đổi ion
Saccharom vces cere visiae Lommi và Advenainen, 1990
121
Gelatin Saccharom vces cere visiae Parascandola và cộng sự, 1992 154
Gluten Saccharomyces cerevisiae Balli và cộng sự, 2003 15
Bardi và cộng sự, 1996, 1997 18, 20Iconomopoulou và cộng sự, 2000 93Loukatos và cộng sự, 2003 124Mallouchos và cộng sự, 2003 135
Đĩa thủy tinh được bao phủ bởi lớp Saccharom vces cerevisiae Ogbonna và cộng sự, 1989 152màng alginate Schizosaccharomyces pombe
Polyvinyl alcohol Saccharomyces cerevisiae Martynenko và cộng sự, 2003 137
Chất mang dạng màng Màng membrane Saccharomyces cerevisiae Takaya và cộng sự, 2002 190
Màng vi bao sinh học (biocapsule) Saccharomyces cerevisiae Peinado và cộng sự, 2005 155
Peinado và cộng sự, 2006 156
Qivanq 16
Trang 30CHẤT MANG CÓ NGUồN Gốc THựC PHAM
Miếnc lê Saccharomyces cerevisiae Kourkoutas và cộng sự, 2005 107
Nho khô Saccharomyces cerevisiae Tsakiris và cộng sự, 2004 197
Tsakiris và cộng sự, 2004 196
Vỏ nho Saccharomyces cerevisiae Mallouchos và cộne sự, 2002 132
Mallouchos và cộng sự, 2003 131Mallouchos và cộng sự, 2003 134
Qívaitq 17
Trang 31- Là polysaccharide màng bao trong các loại vi khuẩn đất.
Tuy nhiên tất cả các alginate thương mại hiện nay đều có nguồn gốc từ tảo
Alginate là một copolymer không phân nhánh, bao gồm các monomer mannuronic acid (gọi tắt là M) và a-L-guluronic acid (G) liên kết với nhau thông qua liênkết 1,4 - glucoside Các monomer này phân bố trong mạch alginate theo các block (Hình2.6) [116, 181, 186]:
P-D Block M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau
- Block G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau
- Block MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nôi vđi nhau
coo
Hình 2.6: cấu trúc của alginate: (a) các monomer của alginate, (b) chuỗi alginate, (c) sự phân bố
các block [186]
Qỉninq 18
Trang 322.2.3.2 Cơ cliế' tạo gel
Alginate có khả năng tạo gel khi kết hợp vđi các cation kim loại hóa trị cao hoặc khiphân tử alginate bị acid hóa Tuy nhiên, phương pháp tạo gel bằng cách acid hóa phân tửalginate ít được dùng vì quy trình thực hiện rất phức tạp [186]
Alginate có khả năng kết hợp nhanh với các cation kim loại hóa trị cao để tạo thànhgel đồng thể Ai lực của alginate đôi với các ion hóa trị 2 khác nhau giảm theo trình tự:
Pb2+ > Cu2+ > Cd2+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Co2+, Ni2+ > Zn2+ > Mn2+ Tùy thuộc vào loại ionliên kết và loại alginate mà gel tạo thành có tính chất khác nhau Thông thường, người tathường sử dụng calcium để làm ion tạo gel [144, 1811
Quá trình tạo gel của alginate theo phương pháp kết hợp với cation kim loại hóa trịcao có thể tiến hành theo 2 phương pháp là phương pháp tạo gel từ bên ngoài và phươngpháp tạo gel từ bên trong [186]
i- Cơ chê' tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài
Đây là phương pháp tạo gel phổ biến nhất của alginate Phương pháp này có ưu điểm
là tạo gel nhanh và thao tác rất đơn giản (Hình 2.7)
Khi nhỏ dung dịch alginate vào dung dịch có chứa cation có khả năng tạo gel (thườnggặp nhất là Ca2+), bề mặt ngoài của hạt alginate sẽ lập tức bị gel hóa Tiếp theo đó, cáccation tạo gel ở bên ngoài hạt alginate tiếp tục khuếch tán vào bên trong hạt làm cho cácphân tử alginate bên trong tiếp tục bị gel hóa Quá trình này xảy ra trên bề mặt hạt vàphát triển vào bên trong Phương pháp này tạo gel nhanh, tuy nhiên tính đồng thể của hạtgel lại không cao [100, 186, 193]
Hình 2.7: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên ngoài [186]
'~ĩi r aíitf 19
Trang 33(UníơtỉíỊ 2: Cĩổng tỊMtut
Cơ chế tạo gel theo phương pháp tạo gel từ bên trong
Cho các muối có chứa các cation tạo gel ở dạng vô hoạt (Ví dụ: CaCƠ3, CaSƠ4,EDTA-Ca, calcium citrate ) vào dung dịch alginate Thay đổi pH của dung dịch về pHacid bằng các tác nhân acid hóa (Ví dụ: D-glucono-ô-lactone (GDL)) Khi đó, do pH giảm,
mà độ hòa tan của các muôi chứa các cation tạo gel như ở trên lại phụ thuộc vào pH nêncác ion Ca2+ sẽ được giải phóng dần và tham gia vào quá trình tạo gel với alginate (Hình2.8) Phương pháp này cho hạt gel có tính đồng thể cao hơn hẳn phương pháp khuếch tán
do các ion Ca2+ phân bô" đồng đều hơn Hơn thế nữa, phương pháp này còn có thể tạo gelvới các hình dạng khác nhau như mong muôn bằng cách cho dung dịch alginate vào khuônthích hợp trước khi quá trình tạo gel diễn ra Trong khi đó, phương pháp tạo gel từ bênngoài thường chỉ tạo thành các hạt có hình cầu [67, 100, 101, 1861-
Hình 2.8: Cơ chế tạo gel của alginate theo phương pháp tạo gel từ bên trong [ 1861
Theo Anders Johansen và James M Flink (1986), khi nâm men được cô" định theophương pháp gel từ bên trong, tốc độ lên men cao hơn và độ bền gel không giảm trongsuô"t quá trình lên men khi so sánh với nâ"m men được cô" định theo phương pháp tạo gel từbên ngoài [100, 101]
2.2.3.3 Ưu nhược điểm của việc cô" định nấm men trong gelalginate
ị- Ưu điểm
- Quá trình cô"định dễ thực hiện [10, 35, 102, 103, 115, 176, 192, 194, 209]
— Điều kiện cô định ôn hòa, không phải xử lý nhiệt hay xử lý hóa chất Do đó, các têbào cô" định không bị mất hoạt tính [10, 35, 102, 103, 115, 176, 209, 211]
— Alginate là châ"t mang trơ về mặt hóa học
[1761 Alginate không có độc tính, thích hợp cho các sản phẩm thực phẩm [10, 103, 169,
176, 192]
^Tvunq 20
Trang 34- Độ xô"p của mạng gel thuận lợi cho việc khuếch tán cơ chất và sản phẩm [8, 27].
- Gel alginate vẫn giữ được độ bền khi nhiệt độ lên men cao [205]
i- Nhược điểm và cách khắc phục
- Độ bền gel giảm theo thời gian lên men do [1 13, 114, 115, 176, 194, 209, 211]:
• Các tế bào nấm men trên và gần bề mặt có khả năng sinh sôi nảy nở chiếm ưuthế so với các tế bào nằm sau bên trong hạt, do đó có thể làm phá vỡ bề mặthạt gel và dễ dàng thoát ra khỏi hạt gel, phát triển nhanh chóng trong môitrường dưới dạng các nấm men tự do Điều này làm cản trở việc đánh giá độnghọc phản ứng của nấm men cố định, đồng thời gây khó khăn cho việc táchnấm men ra khỏi môi trường lên men Để khắc phục vân đề này có nhiều cáchkhác nhau Cách thứ nhất là sử dụng kỹ thuật tạo màng bao Trong phươngpháp này, các tế bào sẽ được nhốt bên trong một nhân lỏng được bao bọc bởimột lớp mỏng gel alginate Do đó, các tế bào sẽ có khoảng không nhiều hơn
để phát triển bên trong nhân lỏng Vì thế, mật độ tế bào đạt được cao hơn màkhông bị thoát bào ra ngoài Hơn thế nữa, bằng cách này có thể sử dụng lượngalginate ít hơn Cách thứ hai là áo nấm men cô" định với mạng polymer, có thểthực hiện một bước (bằng cách sử dụng vòi đôi), hoặc hai bước (bằng cách tạolđp áo polymer sau khi đã tạo hạt nâ"m men cô" định) Đây là phương án râ"t khảthi vì nó không làm ảnh hưởng đến tô"c độ sinh tổng hợp cồn cũng như tô"c độ
sử dụng cơ chất
• Sự giải phóng CƠ2 bên trong gel làm phá vỡ câu trúc của gel Để khắc phục,
có thể làm tăng độ xô"p của gel alginate bằng cách giảm nồng độ alginate sửdụng, tuy nhiên điều này lại đồng nghĩa với việc làm yêu mạng gel Vì thế,phải tăng độ bền gel bằng cách áo các hạt alginate xô"p này với màng polymer(ví dụ, chitosan), khi đó độ bền của gel này sẽ tương tự với gel sử dụng nồng
độ alginate cao
- Gel Ca-alginate râ"t nhạy với các chất tạo chelate (hợp chất hữu cơ trong đó nguyên
tử tạo thành nhiều hơn một liên kết phôi trí với các kim loại trong dung dịch) nhưphosphate, citrate và lactate và các châ"t không tạo gel (non-gelling) như là các ionsodium và magnesium Sự có mặt của các ion này trong dung dịch sẽ làm cho cáchạt bị phồng ra, dẫn đến tăng kích thước các lỗ xô"p, làm giảm tính ổn định và phá
vỡ câu trúc hạt gel Thông thường người ta thường thêm vào môi trường lên mencác châ"t ổn định gel như là CaCẸ, celite và pectine với một hàm lượng thích hợp để
ổn định độ bền gel Hoặc cũng có thể làm cứng gel bằng cách sử dụng propyleneglycol ester, polyethelenine (PEI) và các loại vật liệu composite (colloidal silica)[10, 102, 103, 144, 193, 194]
- Không bền hóa học trong dung dịch điện phân và dung dịch có pH cao Đê khắcphục điều này, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện và có nhiều phương pháp đượcđưa ra: tạo liên kết của hạt gel với glutaraldehyde (Takata và cộng sự, 1977), vớipolycations (Birnbaum và cộng sự, 1981) và sây khô hạt gel (Klein và Wagner,1978; Burns và cộng sự, 1985) Những phương pháp này đều có thể cải thiện độ bền
\7t r attạ 21
Trang 35(UníơtỉíỊ 2: Cĩổng tỊMtut
trong dung dịch điện phân, nhưng rõ ràng là chúng rất phức tạp và tôn nhiều thờigian Một sô" tác giả đã đưa ra phương pháp khác là dùng các ion Ba2+ và Sr2+ thaycho ion Ca2+ truyền thông Các ion này có ái lực mạnh hơn đôi với alginate, vì thếhạt gel barium và strontium alginate bền hơn trong dung dịch điện phân so với hạtgel calcium alginate Tuy nhiên, các ion này vẫn không được ứng dụng rộng rãi vìđộc tính của nó đôi với nấm men và với môi trường [ 144, 183, 192, 193, 1941
2.2.3.4 Ảnh hưỏng của thành phần aỉgỉnate và các điều kiệntạo gel đến độ bền gel và quá trình lên men
ị- Ẩnh hưởng của khôi lượng phân tử
Anders Johansen và James M Flink (1986) đã nghiên cứu ảnh hưởng của khôi lượngphân tử alginate thông qua các thí nghiệm với các loại alginate có độ nhớt khác nhau Kếtquả cho thây rằng khôi lượng phân tử ít có ảnh hưởng đến tô"c độ lên men và sự tạo thànhethanol, mặc dù tốc độ lên men nhìn chung giảm khi tăng khôi lượng phân tử Trong khi
đó, độ bền gel (được đo bằng khả năng chông chịu đôi với lực nén ép) tăng đáng kể khităng độ nhớt từ 5 đến 70cP (độ nhớt là đại lượng đặc trưng cho khôi lượng phân tử củaalginate), nhưng khi độ nhớt tăng cao hơn nữa (250 đến 600cP) thì độ bền gel tăng rất ít
[101].
Kazuaki và cộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của độ nhớt đến khả năngkhuếch tán của glucose và kết quả cho thây rằng khả năng khuếch tán của glucose khôngphụ thuộc vào độ nhớt Trong quá trình xử lý nhiệt, độ nhớt của alginate giảm do giảmmức độ polymer hóa của các phân tử alginate Như vậy, việc tiệt trùng alginate không ảnhhưởng bất lợi đến khả năng khuếch tán của glucose [210]
i- Ẩnh hưởng của tỷ lệ G/M
Tỷ lệ G/M là phần mol của L-guluronic acid trên D-mannuronic acid, biểu thị thànhphần của alginate
Khi tỷ lệ G/M giảm thì:
— Tôc độ lên men có xu hướng tăng, nhưng không đáng kể [101]
- Độ bền gel giảm, vì các ion hóa trị 2 như là calcium, barium, strontium được ưu tiênliên kết vào block G hơn là block M và block MG Do đó alginate có hàm lượng Glớn sẽ tạo thành gel xốp, chắc hơn và vẫn giữ được độ cứng vững trong một thờigian dài Trong suốt quá trình tạo liên kết với Ca2+, các loại alginate này sẽ không
bị phồng nở hay co rút, vì thế vẫn giữ được hình dạng tốt hơn Thêm vào đó,alginate có hàm lượng G cao sẽ cản trở sự sinh trưởng của tê" bào nâ"m men sau khicô" định Trái lại, alginate có hàm lượng M cao tạo thành gel mềm và ít xô"p hơn và
dễ bị rã ra hơn so với các gel giàu G [101, 116, 144, 173, 181, 192, 193] Kazuaki vàcộng sự (1995) cũng đã nghiên cứu và kết luận rằng gel alginale giàu G thích hợp
để cô" định nâ"m men hơn vì gel này ít gây cản trở đến khả năng khuếch tán củaglucose và có độ bền cơ học cao hơn [210]
'~ĩvimtỊ 22
Trang 36i- Ẩnh hưởng của nồng độ alginate
Tăng nồng độ alginate trong khoảng 1 - 10% làm giảm đáng kể tốc độ lên men vàtốc độ sinh tổng hợp cồn do làm giảm sự khuếch tán nhưng lại làm tăng độ bền gel [101,
146, 205,2101
Theo nhiều nhà nghiên cứu, nồng độ alginate thích hợp để cố định nấm men là 2%
[101, 146,210]
1- Ẩnh hưởng của pH tạo gel
Theo Kazuaki và cộng sự (1995), pH của dung dịch alginate thích hợp cho quá trìnhtạo gel là từ 6,0 đến 8,0 Nằm ngoài khoảng này, khả năng khuếch tán của glucose và độbền gel đều giảm Đó là do pH đã làm thay đổi hình dạng của các phân tử alginate [210]
i- Ẩnh hưởng của nhiệt độ tạo gel
Theo Kazuaki và cộng sự (1995), khi nhiệt độ tạo gel dưới 298K, khả năng khuếch táncủa glucose gần như không đổi, nhưng khi tăng nhiệt độ trên 300K thì khả năng khuếchtán của glucose giảm nhanh Độ bền gel cũng gần như không đổi khi nhiệt độ tạo gel dưới298K, nhưng giảm nhanh khi tăng nhiệt độ trên 300K Nhiệt độ tạo gel ảnh hưởng đến khảnăng khuếch tán của glucose và độ bền gel là do nhiệt độ đã làm thay đổi hình dạng củaphân tử alginate Như vậy, nhiệt độ thích hợp cho quá trình tạo gel là nhiệt độ dưđi 298K[210]
4- Ẩnh hưởng của mật độ tế bào trong hạt
Để đánh giá ảnh hưởng của mật độ tế bào, Anders lohansen và James M Flink (1986)
đã tiến hành thí nghiệm với 2 mật độ tế bào là 0,5% và 10% (tương ứng với 2.108 và 4.109
tế bào/ g gel) Kết quả cho thấy rằng khi mật độ tế bào ban đầu cao, tốc độ lên men/ g hạtthì cao hơn nhưng năng suất/ tế bào thì thấp hơn so vđi mật độ tế bào ban đầu thấp Đó là
do sự có mặt của lớp bề mặt tế bào hoạt hóa ngay sát bề mặt hạt gel, tương tự như vớinghiên cứu của Wada và cộng sự (1979) đôi với các hạt K- carrageenan Lớp tế bào nàylàm ngăn cản sự khuếch tán của cơ chất và/ hoặc sản phẩm xuyên qua mạng gel, và do đócác tế bào bên trong gần như bị bất hoạt Trong trường hợp này, năng suất/ tế bào thấp khimật độ tế bào cao đó là do các tế bào nằm ở bên dưới lớp bề mặt cũng được tính vào mật
độ tế bào nhưng không tham gia vào quá trình tạo thành sản phẩm
Trang 37và hình thái của tê" bào cũng có một vài biến đổi
[731-Theo một sô" tác giả, khả năng sinh trưởng của nâm men cô định kém hơn so với nâmmen tự do:
- Banyopadhyay và cộng sự (1982) đã tiến hành nghiên cứu khảo sát quá trình sinhtrưởng của nâ"m men cô" định trên thủy tinh xô"p (Controled pore glass) bằng phươngpháp hâ"p phụ Khả năng sinh trưởng của nâ"m men tự do và cô" định được đánh giágián tiếp thông qua tô"c độ hâ"p thu Ơ2 và tô"c độ sinh COỊ Kết quả nghiên cứu chothây nấm men cô định có hiện tượng giảm khả năng hâp thu O2 và sinh CO2 so vớinâ"m men tự do [16]
- Doran và cộng sự (1985) cũng tiên hành khảo sát quá trình sinh trưởng của nấm
men Saccharomyces cerevỉsiae cô" định trên gelatin Kết quả thực nghiệm thu được
tương tự như kết quả của Bandyopadhyay và cộng sự (1982) Ngoài ra tác giả cònnhận thây rằng tô"c độ sinh trưởng và tỷ lệ nảy chồi của nâ"m men cô" định trêngelatin đều thấp hơn so với nâ"m men tự do [56]
Nguyên nhân của hiện tượng này là do:
— Hệ lên men sử dụng nâ"m men cô" định là một hệ phản ứng dị thể, trong đó, các chấtdinh dưỡng có xu hướng tập trung trên bề mặt chất mang, vì vậy nâ"m men hâ"p phụtrên bề mặt chất mang có điều kiện tiếp xúc với nồng độ chất dinh dưỡng cao hơn
so với trong môi trường đồng thể Chính sự thay đổi áp lực thẩm thâu một cách độtngột gây mâ"t cân bằng trao đổi châ"t qua màng tê" bào, làm ảnh hưởng đến quá trình
hô hâ"p của tế bào [16]
— Chồi có thể được hình thành ở bất kỳ vị trí nào trên bề mặt tế bào nấm men
Saccharomyces cerevisỉae, tuy nhiên phổ biến nhất là chồi sẽ mọc ở các cực
ellipsoide của tê" bào nâ"m men lưỡng bội Vì vậy khi 1 cực của tê" bào nấm men gắnvào chất mang sẽ vô tình làm mâ"t đi sự hình thành của một chồi mới [56]
Nhiều nghiên cứu cũng cho thây rằng nâ"m men cô" định luôn sinh trưởng đạt đến mộtsô" lượng tê bào không đổi và giữ nguyên như vậy cho đến khi kết thúc quá trình lên men:
— Wada và cộng sự (1980) nhận thây rằng nấm men cô" định sinh trưởng và giữ ổn
định ở khoảng 5,4.109 tê"bào/mL gel [201]
- Melzoch và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sự phát triển và hình thái của nâ"m mencô" định trong gel Ca-alginate Các tê" bào nấVn men cô" định sau khi được hoạt hóa,nêu được nuôi cây trong môi trường giàu châ"t dinh dưỡng, sô" lượng tê" bào sẽ tăng
^7rung 24
Trang 38lên rất nhanh (khoảng 1010 tế bào/mL gel) và sau đó hầu như giữ nguyên không đổi[1421.
Bên cạnh đó, Melzoch và cộng sự cũng thấy rằng 80% tế bào cô" định trong gelalginate đều duy trì hoạt tính trao đổi chất và khả năng phát triển khi nuôi cây trong thời
gian dài Saccharomyces cerevisiae cô" định trong gel alginate có thể duy trì khả năng sử
dụng đường của chúng ở mức độ tương đôi cao và ổn định, chỉ giảm khoảng 20% sau 1122giờ nuôi cây [142]
Hình thái của nâm men cô" định cũng thay đổi nhiều so vđi nâ"m men tự do:
- Banyopadhyay và cộng sự (1982) giả thuyết rằng chính sự mất cân bằng về trao đổichâ"t làm cho các chồi của nâ"m men sau khi mọc thành nhanh chóng bị tách ra khỏitê" bào mẹ, làm cho hình thái tê" bào nâ"m men bị thay đổi [16]
- Melzoch và cộng sự (1994) khảo sát sự thay đổi hình thái của tê" bào nâ"m men cô"định trong gel được tiến hành bằng cách quan sát dưđi kính hiển vi điện tử Kết quảkhảo sát cho thây tê bào nâm men cô định có hình dạng và kích thước không đồngđều Điều đó cho thây sự phát triển của các tế bào bị nhốt trong hạt gel phụ thuộcvào độ xô"p và câu trúc của mạng gel cũng như khả năng chiếm chỗ trông trong hạtgel của tê" bào nấm men Trong chất mang, các tê" bào nâ"m men có xu hướng kết tụlại với nhau [142]
2.2.4.2 Những thay đổi về hoạt dộng trao đổi chất của tê" bào
nấm men khi cô" định trên chất mang
Nhiều nghiên cứu của các tác giả cho thây rằng nâ"m men cô" định có tô"c độ sử dụngglucose, tô"c độ sinh tổng hợp ethanol và glycerol cao hơn nhiều so vđi nâ"m men tự do mặc
dù diện tích bề mặt tê" bào của nấm men cô" định dùng để vận chuyển chát dinh dưỡng nhỏhơn so với của nấm men tự do (bảng 2.6) [15, 43, 52, 56, 73, 74, 75, 131, 138, 154, 193]
Glazzo và Bailey (1990) giải thích là do quá trình cô" định làm thay đổi sự vận chuyểnproton qua màng tế bào nâ"m men (Thể hiện qua giá trị pH nội bào của nấm men cô" địnhhơi thấp hơn một chút so vđi giá trị pH nội bào của nâ"m men tự do: giá trị pH nội bào củanâ"m men tự do và nâ"m men cô" định trong gel alginate lần lượt là 6,9 và 6,8) Để duy trì ổnđịnh pH nội bào, nấm men phải tăng tô"c độ sử dụng ATP Như chúng ta đã biết, quá trìnhsinh tổng hợp ethanol bị hạn chê" khi có sự có mặt của ATP Chính vì vậy, ở nâ"m men cô"định, quá trình sử dụng ATP tăng làm giảm sự có mặt của ATP trong tế bào, kết quả dẫnđến tô"c độ sinh tổng hợp ethanol ở tê" bào nâ"m men cô" định tăng vọt [74]
Thêm vào đó, Galazzo và cộng sự (1987) cho rằng pH nội bào của tê" bào cô" định thấphơn so với tê" bào tự do, do đó làm tăng tô"c độ của các phản ứng xúc tác bởiphosphoữuctokinase và hexokinase Vì thế"làm tăng tô"c độ lên men [75]
Ngoài ra, nguyên nhân còn có thể là do nấm men cô" định đã có những thay đổi trongthành phần tê"bào:
- Thay đổi thành phần lipid của màng membrane [96, 138]
^Tvunq 25
Trang 39Nâ"m men tự do Nâm men cô định(mmol/ L/ ph) (mmol/ L/ ph)Tốc độ sử dụng glucose 21,1 42,7
Tốc độ sinh tổng hợp ethanol 37,1 70,0
Tốc độ sinh tổng hợp glycerol 3,5 6,9
Cũng giông như khi nuôi cây trên môi trường tổng hợp, nấm men cô" định khi nuôi câ"ytrong môi trường dịch nho ép trong lên men rượu vang cũng cho kết quả tương tự
Kết quả nghiên cứu của Bakoyianis và cộng sự (1997) về quá trình lên men rượu vang
sử dụng nâ"m men cô" định trên y-alumina, kissiris và alginate cho thây nâ"m men cô" định cótốc độ sử dụng đường cũng như tô"c độ sinh tổng hợp ethanol cao hơn hẳn nâ"m men tự do.Kết quả nghiên cứu cũng cho thây khi nhiệt độ giảm, hoạt động trao đổi châ"t của nấmmen cũng giảm Tuy nhiên, ở bất kỳ trường hợp nào, hoạt động trao đổi chất của nấm mencô" định cũng cao hơn nâ"m men tự do [14]
2.2.4.3 Nliững thay đổi về khả năng chông lại các yếu tô" bấtlợi trong môi trường của tê" hào nấm men cô" định
Lượng cơ chất càng cao hoặc lượng sản phẩm càng cao thì càng ức chế hoạt động sôngcủa tế bào nấm men Tuy nhiên, so với nâ"m men tự do thì nấm men cô" định có khả năngchịu được sự ức chê" cơ chất và sản phẩm cao hơn:
- Desimone và cộng sự (2002) đã cho nâ"m men tiếp xúc vđi ethanol nồng độ 80%(v/v) trong nhiều khoảng thời gian khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thây khảnăng sông sót của nâ"m men cô" định cao hơn râ"t nhiều so với nâ"m men tự do Sau 5phút tiếp xúc với ethanol, nâ"m men tự do bị tiêu diệt hoàn toàn, trong khi sô" lượngnâ"m men cô" định vẫn tương đương với thời điểm ban đầu [531-
- Nghiên cứu của Krisch và Szajáni (1997) cho thây rằng hàm lượng glucose trên16% (v/v) thì có ảnh hưởng độc đôi với các tế bào nâ"m men tự do Khi nồng độ cồnđạt 20% thì nấm men tự do không còn tồn tại Các tế bào nâ"m men được nhô"t tronggel alginate và hâ"p phụ trên cellulose thì có khả năng sông sót cao hơn nhiều so vớinâ"m men tự do, lần lượt là 72 và 62% [1171
- Holcberg và Margalith (1981) cho rằng hàm lượng glucosc 40 và 50%w/w sẽ ức chê"tê" bào tự do, làm cho quá trình lên men hầu như không xảy ra, trong khi đó tê" bàocô" định vẫn có thể lên men mặc dù tô"c độ chậm [91]
^7rung 26
Trang 40Hiện tượng này có thể được giải thích như sau:
- Sự có mặt của chất mang đã bảo vệ tế bào khỏi ảnh hưởng của hàm lượng cồn cao
và ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu cao do đường gây ra [12, 113, 117, 133, 150,206]
- Nấm men cô" định tạo thành glycerol nhiều hơn Glycerol có tác dụng làm cân bằngthê" oxy hóa khử nội bào của nâ"m men hoặc sự cân bằng NAD+/NADH và hoạtđộng như là một chất điều chỉnh áp suất thẩm thâu đôi với áp lực thẩm thâu cao củađường trong suô"t quá trình lên men Nhiều tác giả cũng cho rằng khi hàm lượngđường càng tăng thì lượng glycerol tạo thành cũng tăng [15, 43, 52, 60]
- Nâ"m men cô" định chứa lượng acid béo no cao hơn so với nâ"m men tự do, nên làmtăng khả năng chịu nồng độ cồn cao Mức độ no của acid béo càng tăng sẽ làm tăngkhả năng chịu đựng đôi với ethanol Agudo (1992) cũng nhận thây rằng các giông
Saccharomyces chịu cồn có chỉ sô" không no thấp hơn so với các chủng ít chịu cồn
và đông khô so với nâ"m men tự do [113]
2.2.4.4 Kliả năng sinh tổng hợp sản phẩm phụ tạo hương vị
cho rứựu vang của nấm men cô" định
Trong quá trình lên men rượu vang, khả năng sinh tổng hợp sản phẩm phụ tạo hương
vị cho rượu vang của nâ"m men được coi là một trong những tính chất quan trọng nhất Cácchất tạo hương vị cho sản phẩm rượu vang là một tổ hợp bao gồm rất nhiều chất thuộc họester, aldehyde, ketone, rượu cao phân tử, acid béo và các hợp chất có chứa lưu huỳnh Các chất này được hình thành trong quá trình trao đổi châ"t của nâ"m men (Hình 2.9), đặcbiệt là từ các quá trình trao đổi acid amine, và nó đặc trưng cho từng loại rượu vang khácnhau Trong đó, rượu cao phân tử và ester là thành phần chiếm phần lớn khôi lượng củacác sản phẩm phụ [28, 113, 131, 135]
Ethyl ester của các acid béo cũng như ethyl ester của rượu đóng vai trò quan trọngtrong việc tạo ra hương thơm đặc trưng sản phẩm rượu vang Ngược lại, rượu cao phân tử
và acetaldehyde lại được coi là các yếu tô" gây ảnh hưởng không tô"t đến mùi vị của sảnphẩm [28, 113, 131, 135, 139]
\7t r attạ 27