Quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm (10 TCN)

Cộng hoà x hội chủ nghĩa việt nam Bộ nông nghiệp phát triển nông thôn 10 tcn tiêu chuẩn ngành Quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm Hà nội - 2005 Quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm I Phạm vi áp dụng Quy trình đợc áp dụng để chẩn đoán bệnh Cúm gia cầm phòng xét nghiệm chẩn đoán bệnh động vật II Khái niệm Bệnh cúm gia cầm virus cúm type A, thuộc họ Orthomyxoviridae gây cho loài gia cầm chim hoang dã Bệnh có nhiều dạng khác nhau: có dạng tỷ lệ chết cao, có dạng triệu chứng Virus Cúm type A gây nhiễm cho gia cầm, lợn, ngựa loài khác kể ngời Virus cúm type A có 16 subtype kháng nguyên H (Haemaglutinin) subtype kháng nguyên N (Neuraminidase) Sự kết hợp loại kháng nguyên bề mặt tạo nên nhiều chủng virus cúm khác III Lấy mẫu bảo quản Bệnh phẩm phát virus dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản (swab), phủ tạng (Não, phổi, khí quản, lách,ruột ) Bệnh phẩm phát kháng thể huyết gia cầm nghi nhiễm cúm huyết gia cầm sau tiêm vắc xin Chi tiết cách lấy mẫu bảo quản bệnh phẩm xem phần phụ lục IV Máy móc Dụng cụ Hoá chất Nguyên liệu Máy móc * Máy móc chung - Tủ lạnh âm -15 đến -20oC - Tủ lạnh thờng +2 đến +8oC - Tủ ấm 37oC - Nồi đun cách thuỷ (water bath) - Buồng cấy vô trùng (BSC-Bio-safety cabinet) - Máy hút chân không - Máy ly tâm lạnh (ống 15 ml) - Máy trộn ống nghiệm (vortex mixer) - Máy ly tâm ống nhỏ (microcentrifuge) * Máy móc thực phản ứng huyết học - Máy lắc đĩa (orbital shaker) - Máy đọc ELISA * Máy móc thực PCR - Máy nhân gien (Thermal cycler) - Máy ly tâm spinner - Hệ thống điện di - Hệ thống chụp ảnh điện di - Buồng thao tác PCR (PCR work station PCR chamber) Dụng cụ: - Bình tam giác - ống đong thuỷ tinh - Cốc có mỏ - ống nghiệm - Lọ chắt huyết - ống eppendorf 1,5 ml (Rnase/Dnase free) - Máng trộn chất phản ứng (reagent trough) - Pipet thuỷ tinh: 1, 10 ml - Micropipet đơn: 0,5-10, 5-40, 40-200, 200-1000 àl - Micropipet nhiều đầu (8-12): 5-50, 50-300 àl - Đầu típ cỡ 10, 20, 100, 200 1000àl sử dụng cho micropipet (có lọc không lọc) - Cối chày sứ - Cát để nghiền bệnh phẩm - Dao, kéo, panh kẹp - Găng tay cao su không bột găng nitrile - Đĩa 96 giếng đáy chữ V - Đèn soi trứng - Kim 22 G, 11/2 inch - Syringe ml - Dùi đục trứng - Keo dán Hoá chất * Hoá chất thông thờng - Nớc cất nớc khử ion - Na2HPO4 - Na2HPO4.H2O - Na Cl - HCl - NaOH * Hoá chất cho PCR - Cồn Ethanol 70%, cồn Ethanol tuyệt đối - Trizolđ LS reagent Trizolđ reagent - Chloroform - Isopropanol Nguyên liệu 4.1 Nguyên liệu cho phân lập phản ứng HA, HI - Trứng gà có phôi 9- 10 ngày tuổi, khoẻ mạnh - Kháng huyết chuẩn H1-H16 (ví dụ kháng huyết H5N1 A/Chicken/scot/59) - Kháng nguyên chuẩn H1-H16 (ví dụ kháng nguyên H5N1 Weybridge UK) - Men xử lý huyết RDE (Receptor Destroying Enzyme) - Hồng cầu gà 0,5% - Kháng sinh 4.2 Nguyên liệu cho RT-PCR - Kít chiết tách RNA virus (Qiagenđ Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep #74106 250 prep) - Kít RT-PCR OneStep Qiagen (hoặc kit Invitrogen Superscript One-step RT-PCR) - Thạch điện di - Marker (100 bp DNA ladder) - RNA đối chứng dơng tính - PBS 0,01M pH 7,2 - Nớc cất xử lý DEPC V Các phơng pháp chẩn đoán Sơ đồ chẩn đoán bệnh cúm gia cầm Kiểm tra lâm sàng Đặc điểm dịch tễ học Lấy mẫu bệnh phẩm (huyết thanh, swab, phủ tạng ) Phát kháng thể (HI) Phát virus Phân lập virus RT-PCR (RRT-PCR) (-) (+) (-) Phân lập lần Giám định Phân lập virus (HI) Kết luận bệnh (+) Kiểm tra số đặc điểm dịch tễ học, triệu chứng bệnh tích 1.1 Một số đặc điểm dịch tễ hoc Bệnh Cúm gia cầm có tính lây truyền nhanh mạnh Chim hoang dã đợc coi nguồn truyền lây mầm bệnh Chim mắc bệnh truyền virus qua nớc dãi, dịch nớc mũi phân Chim gia cầm mẫn cảm bị nhiễm bệnh tiếp xúc trực tiếp với chim mắc bệnh gián tiếp qua bề mặt nhiễm bẩn Ngoài số loài khác bị mắc bệnh: ngời, lợn, ngựa 1.2 Triệu chứng - Gia cầm bị xù lông, ủ rũ, bỏ ăn, giảm đẻ - Đầu, mặt sng, phù quanh mắt Mào, tích sng, xuất huyết - Mắt bị viêm kết mạc xuất huyết - Chân vùng bàn khuỷu bị xuất huyết - Có triệu chứng hô hấp - Con vật mắc bệnh thờng chết vòng 24-48 sau xuất triệu chứng 1.3 Bệnh tích - Xuất huyết tràn lan quan nội tạng - Gia cầm phù thũng dới da vùng đầu, cổ ngực - Miệng chứa nhiều dịch - Khí quản xuất huyết chứa nhiều dịch nhày - Đờng tiêu hoá xuất huyết - Gà đẻ buồng trứng xuất huyết Chẩn đoán phòng thí nghiệm 2.1 Phát kháng nguyên 2.1.1 Phơng pháp phân lập virus cúm trứng gà có phôi a Chuẩn bị bệnh phẩm trớc phân lập: - Dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản: + Lắc mạnh ống chứa tăm dịch ngoáy máy lắc vortex mixer + Bỏ tăm ống dịch ngoáy + Bổ sung 1/10 lợng kháng sinh đậm đặc 10X (xem phụ lục), lắc + Để mẫu lắng cặn khoảng 30 phút nhiệt độ phòng Mẫu sẵn sàng để tiêm truyền - Tổ chức phủ tạng: + Nghiền bệnh phẩm cối chày sứ vô trùng thành huyễn dịch 10% với dung dịch vận chuyển PBS 0,01M pH7,2 + Bổ sung 1/10 lợng kháng sinh đậm đặc, chuyển sang ống ly tâm Ly tâm với tốc độ 400g (2.000 vòng/phút) 10 phút + Thu dịch b Tiến hành phân lập: - Chọn trứng có phôi 9-10 ngày tuổi khoẻ mạnh, trứng/bệnh phẩm - Lau trứng cồn 70% đục lỗ nhỏ phía buồng - Dùng syringe ml lắp kim hút dịch bệnh phẩm (đã xử lý trên) tiêm vào xoang niệu mô với lợng 0,2 ml/trứng - Gắn vết tiêm keo dán - ấp trứng tiếp 2-3 ngày nhiệt độ 370C - Theo dõi sau tiêm, soi trứng ngày lần Những trứng chết đợc cất vào tủ lạnh 40C để kiểm tra c Thu hoạch nớc trứng sau phân lập: - Trứng chết sống đợc cất vào tủ lạnh 40C qua đêm trớc thu hoạch - Lau trứng cồn 70% - Dùng panh kéo vô trùng cắt vỏ trứng, bộc lộ buồng hơi, gạt màng xoang niệu mô sang bên - Thu dịch niệu mô vào ống nghiệm Thu hoạch riêng trứng sống chết 2.1.2 Giám định virus phân lập a Kiểm tra nớc trứng phản ứng HA - Nhỏ 25 àl PBS 0,01M vào đĩa 96 giếng chữ V từ giếng thứ đến giếng 12 hàng - Cho 25 àl dịch niệu mô vào giếng thứ - Pha loãng kháng nguyên cách chuyển 25 àl dịch niệu mô từ giếng thứ sang giếng thứ đến giếng 11 bỏ 50 àl - Nhỏ thêm 25 àl PBS vào giếng - Nhỏ 25 àl hồng cầu gà 1% (v/v) vào tất giếng - Lắc đĩa máy tay - ủ đĩa phản ứng nhiệt độ phòng, thời gian khoảng 40 phút * Đọc kết quả: Hiệu giá HA virus đợc tính độ pha loãng kháng nguyên cao tợng ngng kết hồng cầu Ví dụ: Nếu độ pha loãng 1/128 có ngng kết hiệu giá HA 1/128 - Nếu HA(+) dơng tính, chứng tỏ có virus Tiếp tục giám định phản ứng HI với kháng huyết chuẩn số subtype H virus Cúm A kháng huyết chuẩn Newcastle để xác định loại virus phân lập - Nếu HA(-) âm tính mà phôi chết, có bệnh tích phôi, lấy nớc trứng tiêm truyền lần - Nếu HA(-) âm tính, phôi phát triển bình thờng, tiêm lại không Bảo quản virus phân lập đợc 700C b Giám định virus phân lập phản ứng ngăn trở ngng kết hồng cầu - HI - Pha kháng nguyên 4HA/25 àl: Lấy độ pha loãng cuối có phản ứng ngng kết hồng cầu chia cho Ví dụ: Hiệu giá HA dịch niệu mô 1/128 Đơn vị HA = 128: = 32 Nh trộn phần dịch nớc trứng với 31 phần PBS để đạt đợc dung dịch kháng nguyên 8HA - Chuẩn độ kháng nguyên HA: Sau pha, kháng nguyên 4HA phải đợc chuẩn độ lại Tiến hành: Nh phản ứng HA Đọc kết quả: + Pha chuẩn: Kết ngng kết xảy giếng đầu + Pha không chuẩn: Kháng nguyên đặc: Nếu ngng kết đến giếng thứ tức thừa kháng nguyên Nh vậy, kháng nguyên 8HA phải đợc pha loãng (có thể gấp đôi) để có ngng kết đến giếng thứ Kháng nguyên loãng: Nếu ngng kết đến giếng thứ tức thiếu kháng nguyên, thêm lợng kháng nguyên (bằng với lợng kháng nguyên pha ban đầu) để có ngng kết đến giếng thứ - Tiến hành phản ứng HI: Trên đĩa tiến hành phản ứng HI với nhiều kháng huyết subtype khác + Nhỏ 25 àl PBS vào giếng đĩa 96 giếng + Nhỏ tiếp 25 àl kháng huyết vào giếng + Pha loãng kháng huyết theo số 2, cách chuyển 25 àl kháng huyết từ giếng sang giếng đến giếng 11 bỏ 25 àl cuối + Nhỏ 25 àl kháng nguyên 4HA chuẩn bị vào giếng từ giếng - 11 Thêm 25 àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12) + Lắc đĩa ủ nhiệt độ phòng 30 phút + Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu vào tất giếng đĩa, lắcđều + Để đĩa nhiệt độ phòng 40 phút Đọc kết * Đọc kết quả: - Phản ứng (+) dơng tính: Hồng cầu lắng xuống đáy Nh vậy, virus phân lập kháng huyết chuẩn tơng ứng với - Xác định subtype: Một virus phân lập đợc xác định subtype phản ứng với kháng huyết chuẩn hiệu giá cao lần so với kháng huyết chuẩn khác Hiệu giá cao chứng tỏ tơng đồng virus phân lập với kháng huyết chuẩn lớn 2.1.3 Phơng pháp RT-PCR a Chiết tách RNA Có thể chiết tách RNA kít phơng pháp chiết tách Trizol Các mẫu swab nên chiết tách kít, sử dụng nên theo hớng dẫn nhà sản xuất (có thể sử dụng kít Qiagenđ Rneasy Extraction cat # 74104 50 prep #74106 250 prep) Chiết tách Trizol: Cho 0,75 ml Trizolđ LS reagent (hoặc ml Trizolđ reagent) + 0,25 ml dịch bệnh phẩm(0,1 ml dịch bệnh phẩm dùng Trizolđ reagent) vào ống 1,5 ml Lắc để nhiệt độ phòng phút Thêm 0.2 ml chloroform vào ống Lắc mạnh 15 giây để nhiệt độ phòng phút Ly tâm ống tốc độ 12.000 g 15 phút 4C Chuyển phần nớc (khoảng 500 àl) sang ống microtube Thêm 0.5 ml Isopropanol lắc Để 5-10 phút nhiệt độ phòng Ly tâm ống tốc độ 10.000 g phút 4C Bỏ dung dịch ống Rửa RNA đóng đáy ống cồn 80%, lắc mạnh ly tâm với tốc độ 10.000 g phút 4C Bỏ dung dịch ống làm khô RNA 10 phút nhiệt độ phòng hoà tan lại với 30 àl nớc cất Rnase nớc cất xử lý DEPC b Tiến hành phản ứng RT-PCR - Công thức pha: Công thức thay đổi cho phù hợp với loại primer loại kít RT-PCR khác Dới quy trình giới thiệu kit + Công thức áp dụng cho kít RT-PCR bớc hãng Qiagen H2O 5X Buffer dNTP Enzyme mix Primer forward Primer reverse Mẫu RNA Tổng cộng 12 àl àl 1àl 1àl 0,5 àl 0,5 àl àl 25 àl + Công thức áp dụng cho kít RT-PCR hãng Invitrogen H2O 2X Reaction mix RT/plat Taq mix Primer forward Primer reverse Mẫu RNA Tổng cộng àl 12,5 àl 0,5 àl 0,5 àl 0,5 àl àl 25 àl - Chu trình nhân gien: 1) 600C phút 2) 420C 10 phút 3) 500C 30 phút 4) 950C 15 phút 5) 940C 30 giây (tách sợi) 6) 500C 30 giây (gắn Primer) 7) 720C phút (kéo dài) 8) Chu trình 35-40 vòng 9) 720C 10 phút 10) Giữ 40C Quy trình nhân gien áp dụng cho primer H5 (F 936 R 1299) N1 (F6 R595), cặp primer khác quy trình thay đổi cho phù hợp c Chạy điện di: - Chuẩn bị thạch agarose 1,5% pha dung dịch TAE TBE có Ethidium Bromide (10 àg/àl) - Đổ thạch vào khuôn điện di (có lợc) - Thạch khô, rút lợc cho mẫu vào giếng (5 àl sản phẩm PCR + 2àl dung dịch loading buffer) - Sử dụng Marker trọng lợng phân tử (thang 100 bp) - Chú ý chạy PCR phải có mẫu đối chứng dơng đối chứng âm kèm (mẫu đối chứng âm tính nớc cất sạch) d Đọc kết quả: - Mẫu dơng tính: Xuất vạch giống với mẫu đối chứng dơng tính - Mẫu âm tính: Không có vạch Đánh giá kết quả: Có virus Cúm virus Cúm thuộc subtype dựa vào primer chạy mẫu 2.1.4 Phơng pháp Realtime RT-PCR Phơng pháp có giá trị chẩn đoán nh phơng pháp RT-PCR Quy trình Realtime RT-PCR (RRT-PCR) trình bày phần phụ lục 2.2 Phát kháng thể 2.2.1 Phản ứng HI phát kháng thể subtype H5 (hoặc subtype khác ) Huyết kiểm tra: Huyết gà không cần xử lý RDE, huyết vịt, ngan xử lý RDE để chống tợng ức chế ngng kết không đặc hiệu xử lý hồng cầu để chống tợng ngng kết hồng cầu giả (các phơng pháp xử lý huyết xem phần phụ lục) a Chuẩn bị kháng nguyên: - Chuẩn độ kháng nguyên Xác định hiệu giá HA (phản ứng ngng kết hồng cầu HA) xem phần 2.1.2.a - Pha kháng nguyên chuẩn 8HA/50 àl: Xem phần 2.1.2.b Chú ý: Trớc pha cần tính lợng kháng nguyên dùng cho phản ứng: mẫu huyết kiểm tra cần 175 àl kháng nguyên Tính lợng kháng nguyên cần dùng cho số mẫu huyết cộng thêm 1ml để đảm bảo lợng kháng nguyên dùng cho phản ứng Ví dụ: 30 mẫu huyết kiểm tra: 5,25ml (5.250 àl)+ 1ml(thêm) = 6,25ml - Chuẩn độ kháng nguyên 8HA trớc tiến hành phản ứng HI (phụ lục II.3.3) b Phản ứng HI: - Nhỏ 25 àl PBS vào giếng đĩa 96 giếng - Nhỏ tiếp 25 àl kháng huyết vào giếng - Pha loãng kháng huyết theo số 2, cách chuyển 25 àl kháng huyết từ giếng sang giếng đến giếng 11 bỏ 25 àl cuối - Nhỏ 25 àl kháng nguyên 4HA chuẩn bị vào giếng từ giếng - 11 Thêm 25 àl PBS vào hàng đối chứng hồng cầu (giếng 12) - Lắc đĩa ủ nhiệt độ phòng 30 phút - Nhỏ 25 àl dung dịch hồng cầu vào tất giếng đĩa, lắcđều - Để đĩa nhiệt độ phòng 40 phút Đọc kết Đọc kết quả: Phản ứng (+) dơng tính: Hồng cầu lắng xuống đáy Hiệu giá HI mẫu đợc tính độ pha loãng huyết cao có tợng ức chế ngng kết hồng cầu Huyết đợc coi dơng tính có hiệu giá huyết 1/16 Huyết đối chứng âm tính phải có hiệu giá 1/4 Chú ý: Khi kiểm tra huyết loài khác gà nên có giếng có huyết hồng cầu để kiểm tra tợng ngng kết hồng cầu không đặc hiệu Nếu phát thấy có ngng kết hồng cầu không đặc hiệu xảy với mẫu huyết cần xử lý lại mẫu huyết kiểm tra lại phản ứng HI 2.2.2 Phản ứng ELISA Hiện thị trờng có nhiều kít ELISA thơng mại Các kit phát đợc kháng thể gia cầm với kháng nguyên Nucleocapsid, tức phát đợc kháng thể cúm A mà không phân biệt đợc subtype kháng thể có huyết Khi sử dụng kít ELISA nên áp dụng theo quy trình kèm theo 2.3 Chẩn đoán phân biệt Chẩn đoán phân biệt với bệnh sau đây: - Bệnh Niu cát xơn - Bệnh Gumboro - Bệnh Dịch tả vịt - Bệnh Tụ huyết trùng VI Kết luận - Nếu kết phân lập dơng tính virus, giám định HI dơng tính với kháng huyết chuẩn, kết luận dơng tính virus cúm - Nếu kết RT-PCR (RRT-PCR) dơng tính, kết luận dơng tính virus cúm - Nếu gia cầm cha tiêm phòng, phát có kháng thể cúm, kết luận gia cầm nhiễm virus cúm - Nếu kết phân lập âm tính, RT-PCR (RRT-PCR) âm tính, kết luận âm tính virus cúm Phụ lục I Lấy Bảo quản bệnh phẩm Lấy mẫu: - Dịch ngoáy họng, khí quản: Đa tăm vào sâu họng ngoáy thu lấy dịch nhày, sau từ từ rút đa vào ống chứa dung dịch bảo quản, bẻ que vừa với chiều dài ống, đóng kín nắp - Dịch ngoáy ổ nhớp: Cho que ngoáy sâu vào hậu môn gia cầm, ngoáy quanh thành hậu môn, đa vào ống chứa dung dịch bảo quản nh - Mẫu phân: Dùng tăm ngoáy trực tiếp vào phân tơi chuồng gà, cho vào ống chứa dịch bảo quản - Mẫu tổ chức: Lấy kéo cắt phần tổ chức cần lấy cho vào túi nilon hay hộp nhựa sạch, bảo quản lạnh Mẫu tổ chức nhỏ cho vào dung dịch bảo quản - Mẫu huyết thanh: Lấy 3-5 ml máu gia cầm vào ống nghiệm, để nghiêng, chờ máu đông chắt lấy huyết Bệnh phẩm sau cho vào dung dịch vận chuyển bảo quản 40C từ 1-2 ngày, bảo quản lâu nên giữ nhiệt độ -200C Mẫu huyết để nhiệt độ 40C vòng tuần, bảo quản lâu nên giữ nhiệt độ -200C Mẫu đợc chuyển tới phòng xét nghiệm điều kiện lạnh (phích đá), sớm tốt, có phiếu gửi bệnh phẩm kèm theo Môi trờng bảo quản bệnh phẩm Bệnh phẩm dịch ngoáy ổ nhớp, họng, khí quản đợc bảo quản dung dịch vận chuyển Có thể sử dụng môi trờng 199 môi trờng glycerol có bổ sung kháng sinh, bảo quản 40C từ 1-2 ngày, lâu nên giữ nhiệt độ -200C - Môi trờng 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết bò) Bổ sung kháng sinh Penicillin G 2.000.000U/lít Streptomycin 200 mg/lít Polymyxin B 2.000.000 U/lít Gentamicin 250 mg/lít Nystatin 500.000 U/lít Ofloxacin HCl 60 mg/lít Sulfmethoxasole 200 mg/lít - Môi trờng Glycerol + Pha chế PBS NaCl 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nớc cất vđ 1000 ml 10 + Hấp vô trùng (1210C/15) phút, bổ sung kháng sinh (nh trên) trộn với glycerol theo tỷ lệ 1:1 Ngoài sử dụng môi trờng bảo quản khác nh: Muối đệm Hank, môi trờng M.E.M, PBS, Tryptose Phosphate broth, Veal Infusion Broth, Sucrose-phosphate buffer Các dung dịch đợc bổ sung bovine serum albumin (BSA), gelatin 0,51%, chất kháng sinh, kháng nấm II Chuẩn bị dung dịch xử lý huyết Dung dịch PBS 0,01M pH7.2 1,096 g Na2HPO4 0,316 g NaH2PO4.H2O Na Cl 8,5 g Nớc cất lít Chỉnh pH = 7.2 NaOH 1N HCl 1N, hấp vô trùng, bảo quản 40C không tuần Dung dịch nớc muối sinh lý 0,85%: 8,5 g NaCl lít nớc cất Hấp vô trùng, bảo quản 40C không tuần Dung dịch hồng cầu gà 0,5%: - Máu gà trống khoẻ mạnh trởng thành, kháng thể cúm newcastle - Dùng bơm tiêm 10 ml hút sẵn 1ml (10 % thể tích) dung dịch chống đông (Natri Citrat 4%, Alserver) lấy máu gà cho máu vào ống nghiệm - Ly tâm 1000 1500 vòng/phút, 15 phút, đổ bỏ huyết tơng, cho thêm nớc sinh lý (NaCl 0,85%) vào hồng cầu, lắc Ly tâm nh lần để rửa hồng cầu Sau lần ly tâm cuối hút bỏ nớc - Pha hồng cầu thành huyễn dịch 0,5% cách pha 0,5 ml hồng cầu với 99,5 ml nớc muối sinh lý - Bảo quản huyễn dịch hồng cầu nhiệt độ 80 C Hồng cầu sau pha dùng 4-5 ngày (nếu dung dịch hồng cầu bị dung huyết loại bỏ không dùng) Chuẩn độ ngợc kiểm tra kháng nguyên HA 10 11 12 HA A B C D E 16 F 32 G 64 H 11 Nếu 1, thêm lợng kháng nguyên (KN) cha pha loãng (ví dụ sử dụng 0,1ml KN trớc đó, thêm 0,7ml KN Nếu 1/2, thêm lợng KN cha pha loãng Nếu 2, thêm lợng KN cha pha loãng Nếu 1/2, thêm lợng KN cha pha loãng Nếu 3, thêm lợng tơng đơng KN cha pha loãng Nếu 1/2, thêm 1/2 lợng KN cha pha loãng Nếu 4, đạt tiêu chuẩn Nếu 1/2, thêm 1/2 lợng PBS Nếu 5, thêm lợng tơng đơng PBS 10 Nếu 1/2, thêm lợng PBS 11 Nếu 6, thêm lợng PBS 12 Nếu 1/2, thêm lợng PBS Kháng huyết chuẩn: - Kháng huyết chuẩn chế loài nh thỏ, dê, cừu cần đợc xử lý RDE (Receptor Destroying Enzyme) trớc xét nghiệm - Kháng huyết chế gà không cần xử lý RDE Tuy nhiên, phản ứng cho kết không rõ ràng, kháng huyết xử lý RDE để khẳng định kết dơng tính - Hoàn nguyên kháng huyết bảo quản nhiệt độ -200C a Xử lý kháng huyết vô hoạt yếu tố ức chế không đặc hiệu: Trộn phần RDE với phần kháng huyết (vd: 0,9 ml RDE+0,3 ml huyết thanh) ủ nhiệt độ 370C nồi đun cách thuỷ (water bath) qua đêm Sau ủ tiếp nồi đun cách thuỷ nhiệt độ 560C/30 phút để vô hoạt RDE d Kháng huyết xử lý để nguội cho thêm phần nớc muối sinh lý (0,3 ml HT + 1,8mlSL), độ pha loãng cuối kháng huyết 1/10 b Xử lý huyết chống tợng gây ngng kết hồng cầu giả Hiện tợng gây ngng kết hồng cầu giả xử lý cách hấp phụ huyết kiểm tra với hồng cầu gà Thêm 25 àl hồng cầu đặc vào 500 àl huyết thanh, lắc nhẹ để nhiệt độ phòng 30 phút, sau ly tâm tốc độ 800 g vòng 2-5 phút Thu lây huyết hấp phụ III Công thức số cặp mồi (primer) Stt Cặp mồi Trình tự chuỗi Kích thớc 12 H5-219f H5-515r IVA-D150-H5f IVA-D151-H5r AI N1-f6 AI N1-595 NP1200f NP 1529r M52C M253R H5F 936 H5R 1299 GAG TGA AGC GTC TCA TTT TG GAT CTT CTT GGT TGG TAT TAT GTA GCT CC GGA ATG CCC CAA ATA TGT GAA ATC TCT ACC ATT CCC TGC CAT CC AGC AGG AGA TTA AAA TGA ATC CAA CTG GAC CAG AAA TTC CGA TTG CAG RTA CTG GGC HAT AAG RAC GCA TTG TCT CCG AAG AAA TAA G CTT CTA ACC GAG GTC GAA ACG AGG GCA TTT TGG ACA AAK CGT CTA GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC TAA ATT CTC TAT CCT CCT TTC CAA 296 150 586 329 201 363 V Kỹ thuật Real-time RT-PCR Phát virus cúm gia cầm giám định Các subtype H5 H7 từ mẫu bệnh phẩm Dụng cụ - ống 25 àl Smart Cyclerđ (catalog #900-0022 900-0003, Cepheidđ Smart Cycler, Sunnyvale, CA) - Giá ống phản ứng PCR làm lạnh đợc máy li tâm ống nhỏ Cả thiết bị đợc cung cấp kèm theo hệ thống máy Smart Cyclerđ - Hệ thống bơm hút chân không 24 van QiaVacđ có khả hút 18-20 lít/phút Nguyên liệu - Nớc cất vô trùng (Rnase-free) - RNA đối chứng dơng tính M, H5 H7 (đợc NVSL cung cấp) - Cồn tuyệt đối - Isopropanol, 99+% tinh khiết - Chloroform, 99+% tinh khiết - Trizolđ LS reagent (Invitrogen, cat #10296-010 10296-028) - Kít chiết tách Qiagenđ Rneasy Extraction (cat # 74104 50 prep #74106 250 prep) - Kit RT-PCR bớc Qiagenđ (cat # 210210 210212) hoặcSuperscriptđ RTPCR One-Step RT-PCR với Platinium Taq DNA Polymerase (cat @10928-034 10928042, Invitrogenđ) - Mẫu dò primer Có thể đặt primer mẫu dò: Integrated DNA Technologies, (http://idtdna.com/) Operon (http://oligos.qiagen.com/) Bảng trình tự chuỗi mẫu dò Primer cho RRT-PCRphát cúm gia cầm Đặc hiệu Trình tự chuỗi M+25* M (cho Primer M+64* cúm A) Mẫu dò M-124* 3Primer H7+ 1244* H7 Primer (Bắc Mỹ) H7+1281* Mẫu dò a H7-1342* 3Primer H5+1456* H5 Primer H5+1637* Mẫu dò H5-1685* 3Primer 5-AgA TgA gTC TTC TAA CCg Agg TCg-3 5-FAM-TCA ggC CCC CTC AAA gCC gA-TAMRA-3 5-TgC AAA AAC ATC TTC AAg TCT CTg-3 5-ATT ggA CAC gAg ACg CAA Tg-3 5-FAM-TAA TgC TgA gCT gTT ggT ggC-TAMRA-3 5-TTC TgA gTC CgC AAg ATC TAT Tg-3 5-ACg TAT gAC TAT CCA CAA TAC TCA-3 5-FAM-TCA ACA gTg gCg AgT TCC CTA gCATAMRA-3 5-AgA CCA gCT ACC ATg ATT gC-3 - Rnase Inhibitor, 40 unit/àl (Promega, cat # N2511 N2515) 13 - MgCl2, 25 mM (Promega, cat # A3511 A3513) - Đệm TE pH 8.0, 1X, (Promega #V6231 V6232) - 14.3 M *-mercaptoethanol (-ME) (Sigma M6250) ý: độc, phải sử dụng buồng hốt, đeo găng - Hạt chất phản ứng M H5 cho AIV RRT-PCRđã đợc chuẩn bị Cepheidđ để sử dụng cho xét nghiệm M H5 Mỗi Hạt chất phản ứngđủ cho phản ứng loại 25àl Mỗi giọt chứa primer mẫu dò đặc hiệu, KCl, MgCl2, đệm HEPES Thêm vào giọt M gồm chất điều khiển (IC) Mục đích IC phát âm tính giả tạo từ chất ức chế không đặc hiệu trình nhân gen Chất điều khiển M RNA chuỗi đơn phiên mã dài 228 bazơ Nó chứa chuỗi bổ sung với primer tiến M đầu primer lùi đầu 3, chuỗi bên (internal) để gắn vơi mẫu dò IC Hạt M gồm có mẫu dò đánh dấu FAM để phát gen M, mẫu dò đánh dấu Cal-Flour Red 610 cho IC Hạt chất phản ứng H5 gồm có primer tiến, để phát AIV H5 dòng Bắc Mỹ để phát AIV H5 dòng Âu-á Chất phản ứng H5 mẫu dò H5 đánh dấu FAM phát đợc dòng Chất phản ứng đợc chia vào ống 0,5 ml sử dụng để hoàn nguyên Chất phản ứng đợc sử dụng với dNTP enzyme kít Qiagenđ RT-PCR onestep Chất phản ứng bảo quản túi thiếc 40C tháng Không cởi bỏ túi cha sử dụng * Chú ý sử dụng hóa chất Chuẩn bị thực kỹ thuật Real-time RT-PCR Chú ý: Cần phải có khu vực tách biệt thiết bị riêng cho việc chiết tách axit nucleic, quy trình sạch, thao tác với axit nucleic đợc nhân lên - Khu vực để chuẩn bị nguyên liêu phản ứng cho PCR Các cDNA đợc nhân lên mẫu RNA không đợc đa vào khu vực - Có buống cấy dành riêng cho thao tác - Cần có pipet đầu tip sạch, nớc Rnase-free, ống pha chất phản ứng, giá ống nghiệm hộp đá riêng cho khu vực - Một tủ âm 200-C dành riêng cho việc cất giữ nguyên liêu phản ứng - Một buồng cấy thứ 2, pipet dụng cụ, máy móc khác dành riêng cho việc chiết tách Tốt có buồng cấy thứ dành cho việc chuyển mẫu RNA vào ống phản ứng - Đặc biệt đeo găng cao su nitril thay đổi găng suốt trình thao tác RNA yếu dễ bị suy biến Rnase tồn nhiều nơi, đặc biệt da Găng giúp cho việc bảo vệ nguyên liệu mẫu khỏi bị tạp nhiễm Hiện tợng tạp nhiễm chéo làm đảo lộn kết Luôn thay găng sau làm việc với mẫu RNA DNA Luôn đeo găng làm việc với nguyên liệu Cần đeo kính, găng áo bảo hộ làm việc với số hoá chất độc - Quy trình chiết tách Qiagenđ Trizolđ nên thực buồng cấy cấp II có quạt 3.1 Trình độ kỹ thuật viên: Các kỹ thuật viên PCR cần thành thạo: - Chuẩn bị thao tác cách với mẫu chất phản ứng - Biết kiểm tra, bảo dỡng sử dụng thiết bị tài liệu 3.2 Chuẩn bị máy móc-dụng cụ Thiết bị lạnh, tủ ấm, máy ly tâm, pipet máy nhân gen đợc kiểm tra chứng nhận theo tiêu chuẩn 14 3.3 Chất sát trùng Có nhiều loại chất sát trùng, ví dụ I ốt, phenolic, nhóm hợp chất amoniac bậc 4, cồn 70%, xút 10%, hợp chất peroxigen vô hoạt AIV cách phá hủy vỏ bọc lipid virus Tuy nhiên hóa chất trên, có xút (thuốc tẩy trắng) hợp chất peroxigen (Vircon-S) làm suy biến axit nucleic nh phá hủy lây nhiễm AIV Điều quan trọng lựa chọn chất sát trùng để làm bề mặt tạp nhiễm axit nucleic 3.4 Chuẩn bị nguyên liệu phản ứng/đối chứng 3.4.1 Primer Chuẩn bị primer buồng cấy (xem phând 3.0.) Luôn đeo găng sử dụng primer Pha loãng primer đến nồng độ 200 pmol/àl (200 mM) đệm TE 1X để làm độ pha loãng gốc nồng độ 20 pmol/àl nớc Rnase free để sử dụng Chia nhỏ lợng primer vào ống để tránh việc làm tan đông nhiều lần Nếu lu giữ primer thời gian ngắn (dới tuần) để 40C Để bảo quản lâu dài, nên để nhiệt độ 200C lạnh Primer gốc để 200C 700C Các loại Primer M, H5 H7 đợc dùng với lợng 10 pmol 25 àl phản ứng Xem phần 2.2.9 3.4.2 Mẫu dò thủy phân Chuẩn bị mẫu dò buồng cấy (xem phần 3.0) Luôn đeo găng sử dụng mẫu dò Mẫu dò thủiy phân nhạy cảm với ánh sáng nên phải tránh tiếp xúc với ánh sáng trực tiếp Mẫu dò pha loãng giữ ống ly tâm nhỏ vô trùng màu hổ phách ống đợc bọc giấy thiếc Pha loãng mẫu dò đến nồng độ 120 pmol/àl (120 uM) đệm TE 1X làm độ pha loãng gốc pmol/àl nớc Rnase free để sử dụng Chia nhỏ lợng mẫu dò vào ống để tránh việc làm tan đông nhiều lần Primer pha loãng để 200C 700C Tránh đông tan nhiều lần Mẫu dò pha loãng không nên đông/tan lần Các loại mẫu dò M, H5 H7 đợc dùng với lợng pmol 25 àl phản ứng 3.4.3 Thao tác pha loãng primer mẫu dò Primer mẫu dò đông khô phải đợc ly tâm ngắn đẻ chắn hạt DNA đợc lắng xuống đáy ống trớc mở hoàn nguyên Lần đâù tiên nên dùng đêm TE để hoàn nguyên primer mẫu dò Các thông tin định lợng đợc nhà sản xuất cung cấp với primer Ví dụ tính cách hoàn nguyên primer: - Có 17786 pmol primer (thông tin giấy kèm) - Cần nồng độ 200 pmol/àl làm gốc 17786 pmol = 88 ulTE 1X 200 pmol / ul Cách tính hoàn nguyên mẫu dò tơng tự Lắc nhẹ để tan hoàn toàn nớc 10 phút trớc sử dụng Primer sử dụng nên nồng độ 20 pmol/àl mẫu dò sử dụng nên nông độ pmol/àl Pha loãng primer 1/10 mẫu dò 1/20 nớc nulease (không dùng đệm TE) 15 Huỳnh quang lô mẫu dò nên đợc xác đinh theo công thức Nếu huỳnh quang vợt 500 đơn vị huỳnh quang, mẫu dò cần phải bỏ sử dụng lô Mẫu dò có huỳnh quang cao (thuốc nhuộm tự thừa) làm giảm lợng đơn vị huỳnh quang để phát chẩn đoán Huỳnh quang lần xét nghiệm cần đợc kiểm soát để xác định có dấu hiệu suy biến mẫu dò Các thông tin thao tác bảo quản mẫu dò huỳnh quang tìm thấy tại: www.operon.com, www.idtdna.com www.idahotech.com 3.4.4 Chuẩn bị cồn 70% từ cồn 100% (tuyệt đối) nớc Rnase free 3.4.5 Chuẩn bị cồn 80% từ cồn 100% (tuyệt đối) nớc Rnase free 3.4.6 Cần -Mercaptoethanol (-ME) bổ sung vào đệm Rneasy RLT trớc dùng Thêm 10 àl -ME /ml dung dịch RLT Dung dịch RLT ổn định vòng tháng sau bổ sung -ME 3.4.7 Bổ sung cồn 100% vào dung dịch đệm Rneasy RPE theo hớng dẫn kít 3.4.8 Mẫu đối chứng dơng tính cho gen M, H5 H7 yêu cầu từ NVSL Cần pha loãng RNA dơng tính nồng độ sử dụng để tạo Ct đích xấp xỉ 25,0 Pha loãng RNA nớc Rnase free theo chi dẫn kem theo Chạy RNA pha loãng xét nghiệm RRT-PCRđể xác định đối chứng dơng có Ct nằm dải cho phép (phần 6.2) RNA đối chứng dơng đặt hàng sử dụng mã nguyên liệu phản ứng dới Form đặt hàng 4-9 lấy từ website http://www.aphis.usda.gov/vs/nvsl/Home/sitemap.htm Mã nguyên liệu phản ứng Tên sản phẩm 200 ADV APMV-1 RNA 201 ADV AIV H7 RNA 202 ADV AIV H5 RNA 203 ADV AIV M RNA 3.4.9 Pha loãng Rnase inhibitor đến 13,3 unit/àl với nớc Rnase free 3.5 Chuẩn bị mẫu Thực tất quy trình buồng cấy an toàn sinh học cấp II có lọc HEPA Luôn mặc áo bảo hộ, đeo kính bảo hộ găng xử lý tổ chức nhiễm virus sống Sử dụng mẫu dịch ngoáy khí quản gộp (5 swab/ống) chiết tách RNA kít Qiagenđ Các tổ chức thích hợp(lách, phổi, ruột) đợc xử lý thành huyễn dịch 10-20% chiết tách quy trình Trizol Cách khác lấy mảnh tổ chức khoảng mm3 cho vào ml môi trờng BHI, làm dông cứng, tan ly tâm Lấy dịch từ ống dung môi (250 àl) chiết tách Trizol Các liệu chuẩn cho biết mẫu dịch ngoáy ổ nhớp nhạy dịch ngoáy họng-khí quản RRT-PCR Quy trình Trizol chiết tách mẫu dịch ngoáy ổ nhớp tốt quy trình Qiagenđ Các mẫu dịch ngoáy ổ nhớp có kết RRT-PCRâm tính cần đợc kiểm tra phân lập virus để xác định thực âm tính AI Tuy nhiên lợng virus mẫu đủ phát đợc RRT-PCR Các mẫu môi trờng không thích hợp với xét nghiệm với RRT-PCRbằng phân lập virus Tổ chức gia cầm khác không nên gộp chung lại Tất mẫu phải đợc xử lý buồng cấy vô trùng Class II 16 3.6 Chuẩn bị hạt nguyên liệu cho phản ứng phát matrix H5 Mỗi hạt phải đủ dùng cho phản ứng lợng 25àl Hoàn nguyên hạt (phát matrix H5 cúm gia cầm) theo dẫn mục 4.5 Các hạt nguyên liệu không chứa dNTP's, RNase inhibitor RT/PCR enzyme Hỗn dịch Qiagenđ enzyme, dNTP's RNase inhibitor đợc bổ sung sau cán xét nghiệm Thực phản ứng Trớc làm RT-PCR, đặt pipet, khay, đầu pipet, vào buồng vô trùng Tơng tự, đặt dụng cụ làm mẫu vào buồng vô trùng khác Bật đèn tử ngoại nhiều qua đêm để giảm tạp nhiễm ARN từ pipet dụng cụ khác 4.1 Chiết tách ARN từ mẫu dịch ngoáy (Phơng pháp Qiagenđ RNeasy) 4.1.1 Lắc mạnh (bằng máy Votex) ống chứa dịch ngoáy chuyển lợng 500àl sang ống ly tâm nhỏ ghi ký hiệu mẫu 4.1.2 Cho 500àl Qiagenđ buffer RLT có -ME vào ống ly tâm Lắc máy Votex 4.1.3 Ly tâm (bằng máy Spindown) để dịch bệnh phẩm đọng nắp trôi xuống đáy ống Cho 500àl cồn ETOH 70% (ethanol), lắc mạnh Votex Ly tâm mẫu bị dung giải phút tốc độ 5000xg nhiệt độ phòng 4.1.4 Chuyển tất dịch chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasyđ Qiagen ghi sẵn ký hiệu mẫu Ly tâm 15 giây tốc độ 8000xg nhiệt độ phòng Kiểm tra dịch mẫu thấm qua cột lọc cha Lặp lại bớc toàn mẫu qua cột lọc * Ngoài dùng ống hút QuiVacđ để hút dịch mẫu rửa thông qua cột thu mẫu Phơng pháp làm tăng hiệu ly tâm cột lọc nh bớc 4.1.3, 4,1,4, 4.1.5, 4.1.6 4.1.7 4.1.5 Bổ sung 700àl dung dịch rửa1 (RW1 buffer) vào cột RNeasyđ Qiagen, ly tâm 15 giây tốc độ 8000xg, thay ống thu mẫu (collection tube) vào cột lọc 4.1.6 Cho 500àl RPE buffer vào cột RNeasyđ ly tâm 15 giây tốc độ 8000xg, thay ống thu mẫu vào cột lọc 4.1.7 Lặp lại bớc lần với dung dịch rửa RPE buffer Sau lần rửa cuối thay ống thu mẫu loại ml vào cột lọc 4.1.8 Ly tâm cột lọc trống không phút tốc độ tối đa (khoảng 12.000 vòng/phút), bỏ ống thu mẫu 4.1.9 Đặt cột lọc vào ống thu hoạch ống 1,5 ml đợc ghi sẵn ký hiệu mẫu Cho 50 àl RNase free H2O vào cột lọc Chú ý không đợc chạm đầu pipet vào mặt thạch Silica cột lọc ủ nhiệt độ phòng phút Tách ARN cách ly tâm cột phút 10.000vòng/phút Bỏ cột lọc RNeasyđ 4.1.10 Bảo quản mẫu ARN thu đợc 40C thời gian ngắn trớc làm RRT-PCR, sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản -200C nhiệt độ thấp 4.2 Chiết tách mẫu tổ chức TrizolđLS.: Xem phần phơng pháp RT-PCR 4.3 Sao mã ngợc PCR Có khu vực tiến hành xét nghiệm quy trình này: 17 Một khu vực gồm có buồng cấy vô trùng (BSC), tủ âm dụng cụ khu vực nhân gen (thermal cycling area) Không đợc để chất có ARN/ADN vào khu vực phải thay găng tay trớc vào khu vực 4.3.1 Trong buồng vô trùng sạch, chuẩn bị hỗn hợp nhân gen (master mix) với thành phần sau đủ dùng cho số lợng mẫu cần xét nghiệm Liều lợng cho mẫu xem chi tiết bảng sau Quy trình đợc áp dụng cho máy nhân gen Cepheidđ Smart Cycler (Cephiedđ, Sunnyvale, CA) Thông tin khởi động cài đặt chơng trình cho máy Smart Cycler có hớng dẫn hãng Chế độ chạy RT-PCR cho máy Smart Cycler đợc hớng dẫn bảng Bảng Chu kỳ nhiệt bớc phiên mã ngợc (RT) dùng cho Quiagenđ one step RT-PCR kit Bớc phiên mã ngợc chu kỳ 30 phút 500C 15 phút 950C Bảng Chu kỳ nhiệt cho tổng hợp gen cặp mồi Cặp mồi AIV matrix Bớc Biến tính Bám cặp mồi Thời gian giây 20 giây Nhiệt độ 940C 600C 45 chu kỳ H7 40 chu kỳ Biến tính Bám cặp mồi giây 20 giây 940C 580C H5 40 chu kỳ Biến tính giây Bám cặp mồi 20 giây Kéo dài chuỗi giây tổng hợp 940C 570C 720C Chú ý: Màu huỳnh quang đợc xác định bớc bám gắn cặp mồi 4.3.2 Phản ứng real time RT-PCR đợc tiến hành với thành phần sau với cặp mồi chu kỳ thích hợp Khởi động phản ứng với ống phản ứng đợc đặt giá đựng ống lạnh dùng đầu pipet có lọc Chuẩn bị hỗn dịch phản ứng (mọi thứ ngoại trừ mẫu ARN) pipet: nớc, 5x reaction buffer (có kit), dNTPs (có kit), MgCl2, cặp mồi tổng hợp xuôi tổng hợp ngợc) ống ly tâm nhỏ với lợng cho phản ứng đợc tính theo bảng Các nguyên liệu để ngăn đá, kể MgCl2 phải đợc lắc Votex ly tâm trớc lấy pipet Tiếp đến cho RNase inhibitor enzym Cho mẫu dò vào sau cùng, trộn ly tâm nhanh Khi cho mẫu dò vào hỗn dịch tránh để tiếp xúc với ánh sáng 18 4.3.3 Chuyển Master mix sang buồng cho mẫu ARN cho hỗn dịch phản ứng (17 àl) vào ống Smart Cycler 4.3.4 Cho àl mẫu ARN vào ống Smart Cycler pipet chuyên dùng cho lấy mẫu ARN Đóng nắp ống, số ống phản ứng tơng ứng với phiếu xét nghiệm Cho àl ARN đối chứng dơng vào ống đối chứng dơng tính àl nớc RNase vào ống đối chứng âm tính ARN đối chứng dơng tính đợc pha loãng cán xét nghiệm độ pha loãng thích hợp có ngỡng chu kỳ khoảng 25 4.3.5 ống phản ứng đợc đẩy bọt khí từ cửa sổ đọc ống PCR Bọt khí ống cho biết lợng hỗn dịch RT-PCR master mix không đủ thiếu mẫu ARN 4.3.6 Đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt chọn chơng trình chạy PCR, bắt đầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra với mẫu đối chứng dơng tính, âm tính vào phần Ký hiệu mẫu (sample identification) bảng kết Lu chơng trình chạy máy Bảng 4a Lợng chất phản ứng Real time RT-PCR dùng cho cặp mồi phát gen MA (Cúm A), H5 H7 Liều lợng cho Hàm lợng cuối phản ứng H2 O 6,95 àl 5X buffer 1X 1,25 3,75 mM* 25mM MgCl2 dNTP's (10mM loại) 0,8 320 àM loại dNTP 0,5 10 pmol/25 àl Mồi chạy xuôi (20 pmol/àl) 0,5 10 pmol/25 àl Mồi chạy ngợc (20 pmol/àl) 0,5 RNase Inhibitor (13,3 units/àl) 0,266 units/àl Enzyme Mix 1,0 0,5 0,12 àM Mẫu dò (6 pmol/àl) Tổng lợng cho phản ứng 17 àl Mẫu ARN àl Lợng toàn ống mẫu 25 àl * Quiagen buffer có sẵn MgCl2 2,5mM hàm lợng 1X Cài đặt chơng trình phân tích liệu cho máy chu kỳ nhiệt Cepheidđ Smart Cycler Phần mềm Smart Cycler cung cấp nhiều phơng pháp xác định ngỡng chu kỳ (Ct) Tất cách phân tích liệu đợc lấy từ Analysis Settings View Results Những thay đổi cài đặt mặc định tiêu chuẩn đợc thiết lập phân tích phát virus Cúm A với cặp mồi Matrix, H5 H7 Biên tập phần phân tích mặc định Smart Cycler đợc mô tả dới đây, liệu thô đợc phân tích tuỳ theo mức độ phân tích đợc mô tả Phân tích đờng cong (Curve analysis): Chấp nhận cài đặt đờng cong sơ cấp "Primary curve" Ct đợc phát thông báo chu kỳ có đờng cong sơ cấp cắt chéo ngỡng 19 Cách sử dụng (Usage): Chấp nhận cài đặt mặc định "Assay" kênh FAM Trừ giá trị (Background Subtraction): Chấp nhận giá trị mặc định "ON" Giá trị tối thiểu (Background Minimum): Chấp nhận giá trị mặc định "5" (phút) Chu kỳ tính giá trị phần trừ giá trị nề đợc Bật Chu kỳ cực đại giá trị (Background Maximum cycle): Nhập số "28" chu kỳ cực tính toán giá trị trừ giá trị đợc Bật Mặc định 40 Đặt ngỡng (Threshold Settings): chấp nhận mặc định "Manual" Đơn vị huỳnh quang ngỡng xác định (Manual Threshold Fluorescence units): Nhập số "25" đơn vị huỳnh quang Ct nằm phía huỳnh quang Nếu cài đặt huỳnh quang gần giấ trị cận ngỡng giới hạn phát nhạy Tuy nhiên giá trị ngỡng gần với giá trị huỳnh quang độ ồn cắt chéo ngỡng cho kết không xác mẫu dơng tính (phản ứng dơng tính giả) Nếu đơn vị huỳnh quang ngỡng thấp từ 30 đến 25 (giá trị mặc định), độ nhạy phân tích tăng lên Khả cho kết âm tính giả giảm khả cho kết dơng tính giả tăng Boxcar Average: chấp nhận mặc định "0" * Kiểm tra kết xét nghiệm Chỉ thay đổi phần mặc định máy chu kỳ nhiệt Cepheidđ Smart Cycler đợc cài đặt Giá trị cực đại giá trị ngỡng Với phần cài đặt phân tích, mẫu đợc xem dơng tính (cắt chéo Ct) đơn vị huỳnh quang vựot 25 đơn vị Những cài đặt đợc thiết kế nhằm tối u hóa khả phân biệt mẫu dơng tính âm tính quy trình hớng dẫn cụ thể này, nhiên kết của lần chạy phản ứng cần phải đợc xác nhận cán xét nghiệm Đờng cong phải nằm pha tuyến tính log cắt chéo ngỡng Khi giá trị cực đại thấp, ảnh hởng vệt hình chữ V giảm xuống Các mẫu vệt chình chữ V, đặt giá trị cực đại xuống 15 cho đén chu kỳ xuất vệt nằm ngang thẳng hàng với giá trị huỳnh quang "số không" (Sơ đồ 2a 2b) Phải nhớ đặt giá trị cực đại thấp muốn chạy nhiều chu kỳ tốt tính toán giá trị Đây điều chỉnh phần mềm cung cấp liệu giảm số lợng chu kỳ tính toán giá trị chỉnh đờng cong Nếu có câu hỏi vệt, xem vệt với giá trị trừ đợc tắt Nó cho thấy liệu huỳnh quang thô cần có phân tích hỗ trợ Huỳnh quang phải đợc theo dõi thờng xuyên Sự suy giảm Mẫu dò xảy tăng huỳnh quang Vệt huỳnh quanh mẫu cần đợc xem xét trớc chấp nhận kết dơng tính/âm tính máy chu kỳ nhiệt Smart Cycler Các mẫu bệnh phẩm có vệt huỳnh quang làm gia tăng đơn vị huỳnh quang giá trị tiếp cận, nhng không cắt ngang Ct, nên đợc gửi đến NVSL để xét nghiệm thêm Những mẫu đợc xem tăng chậm "late riser LR" thờng cho kết gần với ngỡng phát Hiện mẫu LR cha đợc tìm hiểu rõ nên cần xét nghiệm thêm phơng pháp phân lập virus 20 Các chất phản ứng H5 phát đợc chủng virus thuộc phân nhóm (subtype) Eurasian H5 North American H5 Phản ứng không phân biệt đợc phả hệ virus Phân tích kết xét nghiệm 6.1 Độ đặc hiệu phơng pháp xét nghiệm matrix, H5 H7 Phơng pháp xét nghiệm matrix virus Cúm gia cầm (AIV) đợc dùng phát tất phân nhóm AIV Ngợc lại phơng pháp đặc hiệu xác định phân nhóm H5, H7 dùng giám định AIV H5 H7 chủng North American (Bắc Mỹ) Phơng pháp xét nghiệm H5 cho thấykhả phát AIV H5N1 chủng Asian (Châu á) Vì phơng pháp xét nghiệm matrix nhạy (khoảng 10 lần) H5 hay H7 nên thờng dùng test để kiểm tra tất mẫu Mẫu dơng tính với matrix H5 H7 cho phép khẳng định mẫu chứa ARN AIV Tuy nhiên mẫu dơng tính với matrix kỹ thuật RRT-PCR mà âm tính với H5 H7 chứa ARN phân nhóm H5, H7 nhng số lợng ARN thấp khả phát kỹ thuật xét nghiệm có phân nhóm khác H5 H7 gây bệnh Những mẫu bệnh phẩm đợc xem mẫu nghi ngờ Phơng pháp xét nghiệm matrix, H5, H7 phát mẫu bệnh phẩm dơng tính giả Những mẫu có Ct 35 lớn đợc xem dơng tính nghi ngờ đợc xét nghiệm lại RRT-PCR Tất mẫu bệnh phẩm nghi ngờ mẫu cho dơng tính matrix với kỹ thuật RRT-PCR cần đợc xác chẩn phơng pháp phân lập virus trớc thông báo kết dơng tính Tất mẫu cha chắn phải xét nghiệm lại 6.2 Giá trị Ct đối chứng dơng tính ARN đợc mã Đối chứng dơng tính ARN mã đợc pha loãng hàm lợng sử dụng cho giá trị Ct khoảng 25 Khi đối chứng có Ct cao 29 phải làm lại để xét nghiệm đảm bảo Nếu Ct đối chứng dơng tính thấp 20, nên chuẩn độ lại độ pha loãng đối chứng Bất kỳ thời điểm Ct đối chứng dơng tính đờng cong tăng trởng khác thấp 14, giá trị trừ bị sai lệch 6.3 Hớng dẫn đánh giá đồ thị huỳnh quang Đánh giá đồ thị huỳnh quang kèm theo điều kiện dới hữu ích cho việc xác định kết thờng quy Điều quan trọng mẫu bệnh phẩm phải đợc phân tích độc lập 6.3.1 Giám định mẫu dơng tính yếu Loại bỏ tất phản ứng lớn 100 đơn vị tăng huỳnh quang từ đồ thị (điều làm thay đổi thớc đo để dễ xác định trờng hợp dơng tính yếu) (Sơ đồ 1a 1b) Quan sát riêng mẫu giúp xác định phản ứng dơng tính yếu 21 Sơ đồ 1a Ví dụ đồ thị huỳnh quang mẫu chạy máy Smart Cycler Giá trị trừ đợc bật Tất tiêu chí phân tích đợc cài đặt giá trị mặc định thích hợp Chú ý thớc đo từ đến 1000 đơn vị huỳnh quang (trục Y) khó xác định đợc mẫu dơng tính yếu Sơ đồ 1b Đồ thị huỳnh quang tơng tự nh 1a, nhiên mẫu tăng 100 đơn vị huỳnh quang đợc loại bỏ khỏi đồ thị Chú ý thớc đo từ đến 120 đơn vị huỳnh quang (trục Y) cho phép phát dơng tính yếu dễ 6.3.2 Nếu mẫu có vệt huỳnh quang hình chữ V, hạ thấp chu kỳ cực đại (theo bảng cài đặt phân tích) chu kỳ tới có đờng biểu diễn nằm ngang nằm gần 22 với mức huỳnh quang số (Sơ đồ 2a 2b) Giá trị xác cho chu kỳ cực đại chu kỳ có đáy chữ V, khoảng18 nh sơ đồ 2a Sơ đồ 2a Ví dụ vệt huỳnh quang hình chữ V Chu kỳ cực đại đợc cài đặt mặc định 40 (vòng) Tất tiêu chí phân tích khác đợc cài đặt giá trị mặc định Đối chứng âm tính dùng để tham chiếu (đờng nằm ngang số 0) Sơ đồ 2b Đồ thị huỳnh quang tơng tự 2a, nhiên chu kỳ cực đại đợc giảm xuống 20 (vòng) để gần sát với huỳnh quang đơn vị Tất tiêu chí phân tích khác đợc cài đặt giá trị mặc định Đối chứng âm tính dùng để tham chiếu (đờng nằm ngang số 0) 23 [...]... dò và primer Có thể đặt primer và mẫu dò: Integrated DNA Technologies, (http://idtdna.com/) hoặc Operon (http://oligos.qiagen.com/) Bảng trình tự chuỗi của mẫu dò và Primer cho RRT-PCRphát hiện cúm gia cầm Đặc hiệu Trình tự chuỗi M+25* M (cho bất kỳ 5 Primer M+64* cúm A) Mẫu dò M-124* 3Primer H7+ 1244* H7 5 Primer (Bắc Mỹ) H7+1281* Mẫu dò a H7-1342* 3Primer H5+1456* H5 5 Primer H5+1637* Mẫu dò H5-1685*... quản đối với RRT-PCR Quy trình Trizol chiết tách mẫu dịch ngoáy ổ nhớp tốt hơn quy trình Qiagenđ Các mẫu dịch ngoáy ổ nhớp có kết quả RRT-PCRâm tính cần đợc kiểm tra bằng phân lập virus để xác định thực sự âm tính AI Tuy nhiên nếu lợng virus trong mẫu đủ sẽ phát hiện đợc bằng RRT-PCR Các mẫu môi trờng không thích hợp với xét nghiệm với RRT-PCRbằng phân lập virus Tổ chức của các gia cầm khác nhau không... nhóm khác ngoài H5 và H7 đang gây bệnh Những mẫu bệnh phẩm này đợc xem là mẫu nghi ngờ Phơng pháp xét nghiệm matrix, H5, H7 cũng có thể phát hiện các mẫu bệnh phẩm dơng tính giả Những mẫu có Ct bằng 35 hoặc lớn hơn đợc xem là dơng tính nghi ngờ và đợc xét nghiệm lại bằng RRT-PCR Tất cả mẫu bệnh phẩm nghi ngờ và mẫu chỉ cho dơng tính matrix với kỹ thuật RRT-PCR cần đợc xác chẩn bằng phơng pháp phân lập... GAG GTC GAA ACG AGG GCA TTT TGG ACA AAK CGT CTA GCC ATT CCA CAA CAT ACA CCC TAA ATT CTC TAT CCT CCT TTC CAA 296 150 586 329 201 363 V Kỹ thuật Real-time RT-PCR Phát hiện virus cúm gia cầm và giám định Các subtype H5 và H7 từ mẫu bệnh phẩm 1 Dụng cụ - ống 25 àl Smart Cyclerđ (catalog #900-0022 hoặc 900-0003, Cepheidđ Smart Cycler, Sunnyvale, CA) - Giá ống phản ứng PCR làm lạnh đợc và máy li tâm ống nhỏ... (master mix) với các thành phần sau đủ dùng cho số lợng mẫu cần xét nghiệm Liều lợng cho từng mẫu xem chi tiết tại bảng sau Quy trình này đợc áp dụng cho máy nhân gen Cepheidđ Smart Cycler (Cephiedđ, Sunnyvale, CA) Thông tin về khởi động và cài đặt chơng trình cho máy Smart Cycler có trong quy n hớng dẫn của hãng Chế độ chạy RT-PCR cho máy Smart Cycler đợc hớng dẫn trong bảng 2 và 3 Bảng 2 Chu kỳ nhiệt của... chơng trình chạy PCR, bắt đầu chạy, nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu đối chứng dơng tính, âm tính vào phần Ký hiệu mẫu (sample identification) trong bảng kết quả Lu chơng trình chạy máy Bảng 4a Lợng chất phản ứng Real time RT-PCR dùng cho các cặp mồi phát hiện gen MA (Cúm A), H5 và H7 Liều lợng cho 1 Hàm lợng cuối cùng phản ứng H2 O 6,95 àl 5X buffer 5 1X 1,25 3,75 mM* 25mM MgCl2 dNTP's (10mM... free 3.5 Chuẩn bị mẫu Thực hiện tất cả quy trình trong buồng cấy an toàn sinh học cấp II có lọc HEPA Luôn mặc áo bảo hộ, đeo kính bảo hộ và găng khi xử lý tổ chức nhiễm hoặc virus sống Sử dụng mẫu dịch ngoáy khí quản gộp (5 swab/ống) và chiết tách RNA bằng kít Qiagenđ Các tổ chức thích hợp(lách, phổi, ruột) đợc xử lý thành huyễn dịch 10-20% và chiết tách bằng quy trình Trizol Cách khác là lấy mảnh tổ...Phụ lục I Lấy và Bảo quản bệnh phẩm 1 Lấy mẫu: - Dịch ngoáy họng, khí quản: Đa tăm bông vào sâu trong họng rồi ngoáy thu lấy dịch nhày, sau đó từ từ rút ra rồi đa vào ống chứa dung dịch bảo quản, bẻ que vừa với chiều dài của ống, đóng kín nắp - Dịch ngoáy ổ nhớp: Cho que ngoáy sâu vào hậu môn gia cầm, ngoáy quanh thành hậu môn, đa vào ống chứa dung dịch bảo quản... xử lý trong buồng cấy vô trùng Class II 16 3.6 Chuẩn bị hạt nguyên liệu cho phản ứng phát hiện matrix và H5 Mỗi hạt phải đủ dùng cho 4 phản ứng lợng 25àl Hoàn nguyên hạt (phát hiện matrix hoặc H5 cúm gia cầm) theo chỉ dẫn trong mục 4.5 Các hạt nguyên liệu này không chứa dNTP's, RNase inhibitor hoặc RT/PCR enzyme Hỗn dịch Qiagenđ enzyme, dNTP's và RNase inhibitor sẽ đợc bổ sung sau bởi cán bộ xét nghiệm... 10.000vòng/phút Bỏ cột lọc RNeasyđ 4.1.10 Bảo quản mẫu ARN thu đợc ở 40C trong thời gian ngắn trớc khi làm RRT-PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở -200C hoặc nhiệt độ thấp hơn 4.2 Chiết tách mẫu tổ chức bằng TrizolđLS.: Xem phần phơng pháp RT-PCR 4.3 Sao mã ngợc và PCR Có 2 khu vực tiến hành xét nghiệm trong quy trình này: 17 Một là khu vực sạch gồm có buồng cấy vô trùng (BSC), tủ âm cùng các dụng .. .Quy trình chẩn đoán bệnh cúm gia cầm I Phạm vi áp dụng Quy trình đợc áp dụng để chẩn đoán bệnh Cúm gia cầm phòng xét nghiệm chẩn đoán bệnh động vật II Khái niệm Bệnh cúm gia cầm virus cúm. .. - Thạch điện di - Marker (100 bp DNA ladder) - RNA đối chứng dơng tính - PBS 0,01M pH 7,2 - Nớc cất xử lý DEPC V Các phơng pháp chẩn đoán Sơ đồ chẩn đoán bệnh cúm gia cầm Kiểm tra lâm sàng Đặc... luận dơng tính virus cúm - Nếu kết RT-PCR (RRT-PCR) dơng tính, kết luận dơng tính virus cúm - Nếu gia cầm cha tiêm phòng, phát có kháng thể cúm, kết luận gia cầm nhiễm virus cúm - Nếu kết phân