Nấm mốc (độc tố)

BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM FOG Tiểu luận NĂM HỌC 2009 - 2010 Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc MỤC LỤC Tiêu đề Trang I MỞ ĐẦU II GIỚI THIỆU VỀ NẤM MỐC 2.1 Hình thái cấu tạo 2.2 Hình thức sinh sản III ĐỘC TỐ CỦA NẤM MỐC 3.1 Định nghĩa 3.2 Phân loại mycotoxin 3.3 Các nấm mốc điển hình sinh độc tố 3.4 Những mycotoxin thường gặp chuỗi thực phẩm 13 3.5 Hướng tác động gây độc cho thể loại độc tố mycotoxin 14 3.6 Một số mycotoxin điển hình 15 3.6.1 Aflatoxin 15 3.6.2 Ochratoxin 21 3.6.3 Patulin (Clavaxin) 23 3.6.4 Trichothecen 24 3.6.5 Fumonisin 27 3.6.6 Zearalenon (ZEN 31 3.6.7 Citreoviridin 34 3.6.8 Penitrem A 35 3.6.9 Citrinin 35 IV CƠ CHẾ SINH ĐỘC TỐ 36 4.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp mycotoxin nấm mốc 36 4.2 Cơ chế sinh tổng hợp độc tố nấm mốc 37 V CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘC TỐ NẤM MỐC 39 5.1 Phương pháp đại 39 5.1.1 Thử nghiệm miễn dịch (ELISA) 39 5.1.2 Phương pháp sắc ký 43 5.1.3 Phương pháp PCR 50 5.2 Phương pháp truyền thống 54 5.2.1 Kỹ thuật định danh nấm mốc (tiêu chuẩn ngành y tế nhóm TQTP 52 TCN-TQTP 0001:2003)…………………………………………………………………………………… 54 VI KẾT LUẬN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc NẤM MỐC (ĐỘC TỐ) I MỞ ĐẦU Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, thuận lợi cho sinh trưởng phát triển nấm mốc, chúng có mặt khắp nơi thường sinh trưởng, phát triển sản phẩm lương thực, thực phẩm,…và hoa Bên cạnh việc nấm mốc gây hư hỏng, thối rữa, làm hỏng, giảm chất lượng giá trị sử dụng có nhiều loài nấm mốc tiết độc tố gây bệnh cho người Có nhiều loại độc tố nấm tiết ảnh hưởng nghiêm trọng tới sức khoẻ người, chí gây tử vong Trong năm 1920-1930 Anh Liên Xô thấy xuất nhiều trường hợp ngộ độc alcaloit người gà mà chất lúa mạch, lúa mì Năm 1924 Shofield cộng tác phát loại độc tố sản sinh từ nấm mốc gây dịch bệnh cho gia súc, thời gian Liên Xô tìm bệnh bạch cầu không tăng bạch cầu (aleusemic) số người ăn phải ngũ cốc bị mốc Đến năm 1960 nhân vụ dịch làm chết hàng ngàn gà tây quần đảo nước Anh ăn phải lạc thối mốc, nhà khoa học Tây Âu tiến hành nghiên cứu phát độc tố anatoxin, độc tố tiết từ nấm Aspergillus flavus, Parasiticus Fumigatus Năm 1961 Anh, người ta tiến hành thực nghiệm chuột cống, cho ăn thức ăn nhiễm mốc 20% bột lạc thối, sau tháng thấy xuất ung thư gan Theo thống kê số tác giả nước có đời sống cao Châu Âu, với điều kiện khí hậu lạnh khô tỉ lệ ung thư gan aflatoxin thấp nhiều so với nước có đời sống thấp khí hậu nóng ẩm Châu Phi Robinsơn nghiên cứu trẻ em Ấn Độ bị xơ gan, phương pháp sắc kí lớp mỏng, Ông tìm thấy anatoxin nước tiểu trẻ bị xơ gan sữa bà mẹ có bị xơ gan Như vậy, theo Ông xơ gan anatoxin có mối quan hệ chặt chẽ với Ở Thái Lan, năm 1967 nhóm nghiên cứu Shank cho thấy mẫu lương thực thực phẩm bị mốc 50-60% số mẫu có aflatoxin, đồng thời nhóm tác giả tiến hành thức ăn gia đình (lấy mẫu lương thực thực phẩm gia đình) thấy có 30-50% số mẫu có độc tố aflatoxin Ở Việt Nam có công bố vấn đề theo kết viện Vệ Sinh Dịch Tể nghiên cứu 29381 mẫu lương thực thực phẩm thấy có 30 loại men mốc khác nhau, mốc Aspergillus chiếm tỉ lệ cao (5,2-80,39%) bao gồm 12 chủng loại Aspergillus khác nhau, số có 11 chủng có khả sinh độc tố Năm 1984 theo tài liệu Viện Dinh Dưỡng Quốc Gia nghiên cứu 200 mẫu gạo bán Hà Nội thấy mẫu có nhiều nấm Aspergillus flavus, loại nấm có khả tạo aflatoxin http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc Năm 1988, Viện dinh dưỡng thông báo kết thăm dò Aflatoxin B1 lạc sản phẩm từ lạc sau: có 7/55 số mẫu lạc nhân có Aflatoxin B1 (13%), 2/6 mẫu xì dầu có anatoxin (33%) Theo kết nghiên cứu bước đầu Bộ môn Dinh dưỡng An toàn thực phẩm (Trường Ðại Học Y Hà Nội) kết nghiên cứu 30 mẫu tương ăn 60 mẫu sữa mẹ Hà Nội, kết cho thấy xấp xỉ 30% số mẫu tương có độc tố anatoxin sữa mẹ chưa phát thấy Do đó, vấn đề nghiên cứu độc tố nấm mốc chế sinh độc tố chúng vấn đề cần thiết để từ có biện pháp phòng ngừa góp phần làm giảm tỉ lệ bị nhiễm độc từ độc tố nấm mốc II GIỚI THIỆU VỀ NẤM MỐC Nấm mốc tên chung để nhóm nấm nấm men nấm lớn có thể Đây nhóm vi sinh vật có cấu tạo dạng sợi có lông tơ, sợi tạo khuẩn ty dạng bột Màu sắc nấm mốc xuất bề mặt nước chấm, bánh mì để lâu ngày, rau nhiều loại thức ăn khác gây mùi, vị khó chịu Có số loài tiết chất độc gây ngộ độc thức ăn Mặt khác nấm mốc lại tham gia vào trình có lợi khác tác nhân quan trọng trình sản xuất nước chấm, nước tương, chao Nấm mốc hô hấp hiếu khí bắt buộc, phát triển số môi trường mà nấm men vi khuẩn phát triển đuợc môi trường mà có áp suất thẩm thấu, độ ẩm, độ acid lớn 2.1 Hình thái cấu tạo 2.1.1 Hình thái Nấm mốc màu xanh lục hay nói cách khác nấm mốc diệp lục tố, khả tự tổng hợp chất dinh dưỡng cho thân Chúng phát triển thức ăn có sẵn Nấm mốc loài vi sinh vật phát triển thành hình sợi phân nhánh Những sợi phân nhánh phát triển thành đám chằng chịt, người ta gọi khuẩn ty hay hệ sợi nấm phát triển môi trường đặc thường phân làm loại rỏ rệt: khuẩn ty ký sinh khuẩn ty dinh dưỡng Hình 1: Nấm mốc Aspergillus Hình 2: Penicillium chrysogenum http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc Hai loại ty khuẩn đóng vai trò nhiệm vụ khác Khuẩn ty dinh dưỡng làm nhiệm vụ rễ xanh Còn khuẩn ty ký sinh lại đóng vai trò sinh sản chủ yếu Mỗi sợi nấm lại phát triển thành phận khác Dưới cùng, nơi tiếp giáp với môi trường dinh dưỡng sợi nấm từ sợi phát triển thành giá đỡ Trên giá đỡ bọng nấm Xung quanh bọng nấm thể tế bào hình chai Thể hình chai lớp bao xung quanh Lớp chồng chất lên lớp Trên thể hình chai chuỗi bào tử trần Các bào tử trần dính vào thành chuỗi dài Hình 3: Nấm sợi Ở số loài khác giá có bọc Trong bọc có chứa đựng toàn bào tử, người ta gọi bào tử kín Nấm mốc không di chuyển quan vận chuyển, nấm mốc hoàn toàn hiếu khí, chúng phát triển điều kiện thoáng khí So với vi khuẩn nấm mốc chịu nhiệt độ độ acid thấp đặc điểm cần thiết trình phân lập nấm mốc Về màu sắc nấm mốc có nhiều màu sắc khác có nấm mốc màu đỏ Neospora crassa, có loài có màu đen Aspergillus niger, có loài có màu xám Aspergillus usamii, có màu trắng xám Mucor hay Rhyzopus có loại màu xanh Penicillium Về hình thái khối lượng bào tử có nhiều kiểu khác Có loại bào tử mọc xung quanh thể hình chai tạo thành khối cân đối hoa cúc, hoa hướng dương (là hình cầu dẹt hoa), mà có tên mốc cúc Thường “Bông cúc” có 500.000 bào tử bám theo Lại có loài hình dạng phân nhánh chổi (Penicillium chẳng hạn) Lại có loài trái bưởi bị đốt cháy đen vỏ (Mucor, Rhyzopus) 2.1.2 Cấu tạo nấm mốc Do cấu tạo đặc biệt, nấm mốc hoàn toàn khác với vi khuẩn nấm men Dựa vào cấu tạo chúng mà người ta chia nấm mốc làm loại http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc a Loại nấm mốc có vách ngăn Đây trường hợp mà khuẩn ty tạo thành chuỗi tế bào nối tiếp Ta xem nối tiếp đốt tre tre Ngăn cách tế bào màng ngăn Trong tế bào nấm có đủ quan tế bào, quan trọng có nhân, thường thấy Aspergillus Penicillium b Loại nấm mốc vách ngăn Đây loại nấm mốc đa hạch (nhiều hạch), hạch màng ngăn Hầu hết màng tế bào nấm lớp vỏ cellulose thực vật mà lại có chất kitin lớp vỏ cứng sâu bọ Chất dự trữ hydratcacbon nấm không đường bột mà chất glycogen Đặc biệt, tế bào nấm có giàu chất có hoạt tính sinh học (enzyme) giàu kháng sinh Lợi dụng đặc điểm người ta sử dụng nấm mốc sản xuất sản phẩm phục vụ cho đời sống Cấu tạo thành tế bào nấm mốc chưa hiểu hết Tuy nhiên nhiều tài liệu cho thấy có: 80-90% polisacarit; 1-3% hecxozamin; 3-8% lipit; 4% protein; chất màu (melamin) 2.2 Hình thức sinh sản Nấm mốc vi sinh vật có nhiều kiểu sinh sản khác 2.2.1 Sinh sản dinh dưỡng a Phát triển khuẩn ty Từ sợi nấm riêng lẻ phát triển thành khuẩn ty, lòng khuẩn ty thấy xuất hay nhiều tế bào hình cầu, có màng dày bao bọc, bên có nhiều chất dự trữ, bọc yếu tố giúp nấm mốc trải qua điều kiện bất lợi bên Khi gặp điều kiện thuận lợi, khối tròn lại tiếp tục phát triển thành sợi nấm b Sinh sản hạch nấm Một số loài nấm lại có khả tạo thành hạch nấm Đây khối có hình tròn đều, màu tối Bên tổ chức sợi xốp thường có màu trắng Hạch nấm giúp cho thể nấm vượt qua điều kiện khó khăn Khi gặp điều kiện thuận lợi chúng lại phát triển bình thường 2.2.2 Sinh sản vô tính Đây kiểu sinh sản chủ yếu bào tử, bào tử tạo thành từ phương pháp sau: - Bào tử tạo thành cắt đoạn sợi nấm - Bào tử tạo thành từ tế bào sinh bào tử cách nảy chồi đồng thời thân http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc bào tử sinh kiểu có khả nảy chồi để tạo thành bào tử - Bào tử tạo thành cách ngăn vách với tế bào bào tử hình thành hoàn toàn khả sinh bào tử Bào tử nấm mốc bào tử kín loài Mucor hay Rhyzopus, bào tử trần Phần lớn bào tử đuôi mà khối tròn Nhưng người ta lại tìm thấy có số loài nấm mốc sinh bào tử trần (các loài bề mặt cá) có hai đuôi Những nấm mốc bơi lội nước bám xác cá, tôm chết sau phát triển thành nấm mốc 2.2.3 Sinh sản hữu tính a Đối tượng nấm mốc trắng sinh bào tử kín thuộc Mucor hay Rhyzopus (sinh sản bào tử tiếp hợp) - Dưới kính hiển vi người ta quan sát sợi nấm nằm gần nhau, phình to đoạn ngắn Lúc đầu hai sợi nhánh châu đầu vào chưa chạm hẳn vào - Mỗi nhánh sợi nấm kéo dài tiếp tục châu đầu vào cách quãng ngắn - Hai nhánh nối với nơi nối phình to thành khối - Hai đầu nhánh tạo thành khối xù xì màu nâu nhạt sau biến thành màu đen phát triển thành sợi b Đối với nấm thuộc lớp nấm túi (Ascomycetes) Cơ quan sinh bào tử chúng túi bào tử (Ascus) bào tử bọc gọi bào tử túi (Ascospores), thường túi có tám bào tử Sự tạo thành trình nhày sau: Trên khuẩn ty đơn bội, người ta thấy có quan sinh sản đực Túi giao tử đực tương đối nhỏ thường có dạng hình ống gọi hùng khí (Antherdium), túi giao tử tế bào phình to đầu nhánh sợi nấm gọi thể sinh túi (Ascogonium) Thể sinh túi có hình cầu hình viên trụ, kéo dài thành ống gọi sợi thụ tinh (Trichogyne) Hùng khí thể sinh túi sinh chổ khuẩn ty Lúc đầu hùng khí tiếp giáp với thụ tinh khối nguyên sinh chất chứa nhiều nhân qua sợi thụ tinh để vào thể sinh túi Giai đoạn xảy trình phối nhân, nhân tự xếp theo đôi gồm nhân đực nhân Trong thể sinh túi hình thành nhiều sợi sinh túi sau xảy tượng phân chia nhiều lần theo lối phân chia hữu tỷ Và đồng thời tạo thành vách ngăn phân chia sợi tinh túi tế bào lưỡng bội chứa nhân kép Nhân lượng bội tiếp tục phân chia lần để tạo thành nhân đơn bội Mỗi nhân bao bọc khối nguyên sinh chất hình thành màng để tạo thành bào tử http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc c Đối với nấm mốc thuộc loại nấm noãn (Oomycetes) Khi chúng sinh sản hữu tính sinh bào tử noãn hay bào tử trứng (Oospore) Noãn sinh đỉnh sợi nấm phân nhánh Khi noãn chín nguyên sinh chất tụ lại với nhân tạo thành hay nhiều noãn cầu Hùng khí hình ống cong sinh gần noãn khí Cùng lúc có nhiều hùng khí quay noãn khí, tiếp xúc với noãn khí, hùng khí tạo thành hay nhiều ống xuyên (chứa nhân nguyên sinh chất) Các ống xuyên đâm qua màng noãn khí tìm đến màng noãn cầu để thụ tinh tạo thành noãn bào tử Noãn bào tử bao bọc màng dày sau thời gian phân chia giảm nhiễm tạo thành sợi nấm III ĐỘC TỐ CỦA NẤM MỐC 3.1 Định nghĩa Là hợp chất trao đổi bậc II có độc tính số vi nấm tổng hợp trình trao đổi chất xảy tế bào điều kiện xác định Các chất độc nấm mốc gọi chung độc tố vi nấm (Mycotoxin) Mycotoxin độc tố có khả gây độc cấp mãn tính (chẳng hạn gây ung thư, đột biến, ) động vật người Hội chứng độc ăn phải mycotoxin gọi mycotoxicoses Mặc dù mycotoxicoses gây nấm mốc Claviceps purpurea biết từ lâu mycotoxin bị xao lãng năm 1960 mà tìm thấy aflatoxin Sự sinh trưởng nấm mốc thực phẩm phổ biến khí hậu ấm ẩm Nó xảy cánh đồng bảo quản sau thu hoạch Nhiễm mốc vào thực phẩm hạt lương thực, đậu nằm vùng bao, đặc biệt bảo quản lượng lớn bảo quản kho Gần cho biết vài trăm loại mycotoxin sản sinh từ giống Aspergillus, Penicillium Fusarium 3.2 Phân loại mycotoxin Có thể phân loại mycotoxin theo chất cấu trúc hóa học, theo tác nhân tổng hợp mycotoxin theo bệnh lý mycotoxin gây nên Theo chất hóa học, nói phần trên, mycotoxin phân thành nhóm hợp chất sau: - Các chất kháng sinh - Các chất gốc peptid - Dẫn xuất dicetopiperazin - Các cyclopenin - Các chất họ penicilin - Các hợp chất loại quinon http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc - Dẫn xuất antraquinon - Các chất có nhân piron (gentisandehid, acid kojic, xanton) - Dẫn xuất acid sikimic (hydroxybenzylic, cumarin) - Các hợp chất loại terpen - Các hợp chất khác Mycotoxin phân loại dựa theo nấm mốc sản sinh chúng: - Độc tố Aspergillus flavus tổng hợp - Độc tố Aspergillus khác - Độc tố Penicillium - Độc tố Fusarium - Độc tố Stachybotrys - Độc tố loài nấm khác Theo bệnh lý gây cho động vật máu nóng, mycotoxin chia thành nhóm độc tố sau: - Mycotoxin gây hội chứng ung thư, nhiễm độc gan: aflatoxin, orchratoxin, islanditoxin - Mycotoxin gây nhiễm độc thận: citrinin, ochratoxin - Mycotoxin gây hội chứng nhiễm độc tim: acid penicillic - Mycotoxin gây nhiễm độc thần kinh: clavacin - Mycotoxin gây sẩy thai, động lực: zearaleneon - Mycotoxin gây xuất huyết Phân loại mycotoxin theo bệnh lý thường không xác số độc tố gây nên nhiều hội chứng khác nhau, ngược lại hội chứng nhiều độc tố gây nên 3.3 Các nấm mốc điển hình sinh độc tố Có đến 30 – 40% số nấm mốc phân loại sản sinh độc tố với liều lượng độc tính khác nhau, nhiều loài nấm mốc khác sản sinh loại độc tố Một loài nấm mốc sản sinh loại độc tố khác tùy thuộc vào điều kiện môi trường chất Bảng 1: Các mycotoxin chủ yếu nấm mốc sản sinh chúng STT Mycotoxin Acetoxyscirpenediol Các loài nấm sinh độc tố Fusarium moniliforme, F equiseti, F oxysporum, F culmorum, F avenaceum, F roseum, F nivale Acetyldeoxynivalenol Fusarium moniliforme, F equiseti, F oxysporum, http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc F culmorum, F avenaceum, F roseum, F nivale Acetylneosolaniol Fusarium moniliforme, F equiseti, F oxysporum, F culmorum, F avenaceum, F roseum, F nivale Acetyl T-2 toxin Fusarium moniliforme, F equiseti, F oxysporum, F culmorum, F avenaceum, F roseum, F nivale Aflatoxin Aspergillus flavus, A parasiticus, A nomius, penicillium puberulum Aflatrem Aspergillus flavus Altenuic acid Alternaria alternata Alternariol Alternaria alternata Austdiol Aspergillus ustus 10 Austamide Aspergillus ustus 11 Austocystin Aspergillus ustus 12 Avenacein Fusarium moniliforme, F equiseti, F oxysporum, F culmorum, F avenaceum, F roseum, F nivale 13 Beauvericin Fusarium moniliforme, F equiseti, F oxysporum, F culmorum, F avenaceum, F roseum, F nivale 14 Bentenolide Monographella nivalis 15 Brevianamide Aspergillus ustus 16 Butenolide Fusarium moniliforme, F equiseti, F oxysporum, F culmorum, F avenaceum, F roseum, F nivale 17 Calonectrin Fusarium moniliforme, F equiseti, F oxysporum, F culmorum, F avenaceum, F roseum, F nivale 18 Chaetoglobosin Chaetomium globosum http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc b Phương pháp rửa giải Trong phương pháp rửa giải, người ta cho Vml dung dịch chứa hỗn hợp cấu tử (ví dụ, hỗn hợp hai cấu tử A B, A có lực với cột nhỏ B) chạy qua cột Các cấu tử A, B chứa Vml trước hết bị giữ lại phần cột Sau cho dung dịch rửa (thường dung môi hoà tan cấu tử) chảy qua cột Lúc cấu tử bị giữ phần cột bị dung môi “rửa” đưa dẫn xuống phía Cấu tử A có lực với cột nhỏ B nên chuyển động xuống phía nhanh B Nếu cột đủ dài chế độ chảy dung dịch rửa thích hợp sau thời gian cho chảy dung dịch rửa, cấu tử tách thành vùng Các vùng thoát khỏi cột, vùng lại cách phần dung môi Hình bên biểu diễn đường cong thoát trình rửa giải Trong phương pháp rửa giải, người ta hay dùng dung dịch chứa cấu tử có lực với cột phải nhỏ lực cấu tử cần tách với cột Hình 33: Đường cong thoát chất trình rửa giải c Phương pháp rửa đẩy Trong phương pháp rửa đẩy, sau đưa mẫu vào cột, ta cho chảy qua cột dung dịch rửa chứa chất có lực với pha tĩnh lớn cấu tử cần tách Các cấu tử cần tách bị chuyển dần xuống phía ta tiến hành trình rửa cột thoát khỏi cột Cấu tử thoát khỏi cột cấu tử tương tác với pha tĩnh yếu nhất, sau đến cấu tử có lực với cột mạnh dần Khác với phương pháp rửa giải, nồng độ cấu tử không giảm qua trình sắc ký Một nhược điểm quan trọng phương pháp rửa đẩy khó phân biệt phần riêng cấu tử dung dịch thoát phần dung dịch thoát chứa cấu tử không tách thể tích dung dịch rửa 5.1.2.5 Phát độc tố Aflatoxins M1 M2 sữa lỏng phương pháp sắc ký lỏng a Nguyên tắc Aflatoxin M1 M2 chiết xuất từ sữa cartridge C18, tách rửa với ether cột 46 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc silica, tách rửa với CH2Cl2 – alcohol, tạo dẫn xuất với acid trifluoroacetic Peak sắc ký lỏng đo huỳnh quang so với dẫn xuất TFA chuẩn b Thuốc thử - Dung môi: cất thủy tinh, CH3CN, CH2Cl2, isopropyl alcohol, alcohol tiêu chuẩn thuốc thử, ether (chất bảo quản 0,01% ethyl alcohol), hexane, methanol, acid trifluoroacetic, nước (khử ion, lọc qua giấy lọc 0,45mm) - Dung dịch rửa: nước – acetonitrile: 95+5 - Dung dịch tách rửa: methylen chloride – alcohol: 95 + - Pha động: pha nước–isopropyl–CH3CN (80+12+8) Tách khí bể siêu âm tương đương Tỉ lệ dung môi thay sử dụng kết tối ưu (nghĩa 84+11+5) - Dung dịch chuẩn aflatoxin: aflatoxin M1 M2 (Sigma Chemical Co., nguồn khác) Pha dung dịch dự trữ (khoảng 200μg M1/ml 100μg M2/ml) CH3CN xác định nồng độ, dùng hệ số extinction 19.850 21.400 tương ứng cho M1 M2, CH3CN Tạo dung dịch hoạt động chuẩn chứa 0,50μg M1 0,10μg M2/ml CH3CN-bezene (1+9) để dùng pha dẫn xuất M1-TFA - Dichlorodimethylsilane (DDS): 5% toluene Thêm 5ml DDS (99%) vào toluene pha loãng đến 100ml Bảo quản bình có nút mài bảo quản lạnh (Thận trọng: DDS chất làm chảy nước mắt dễ cháy) c Thiết bị - Cột rửa silicagel: Cột Econo polypropylene 0,8x4,0cm với mút Luer, 35mm, đĩa đỡ cột polypropylene xốp, bình chứa 10ml (Bio-Rad Laboratories, Cat No 731-1550, tương đương) - Nhồi cột rửa silicagel chuẩn bị: sấy khô silica gel 60, kích thước hạt 0,040-0,063mm (E.Merck, No.9385) lò hấp 105oC 1h Làm nguội thêm 1% nước Lắc thùng chứa kín để cân qua đêm trước dùng Lắp đặt cột polypropylene bình chân không 25ml vừa với nắp có lỗ hình 26 Đổ đầy cột đến vạch 2ml với silicagel (khoảng 1g) Hút chân không nhẹ để nhồi cột thêm khoảng 1g Na2SO4 khan đỉnh cột silicagel - Cartridge chiết xuất: Cartridge chuẩn bị mẫu C18 Sep-Pak (Water Associates, Inc.) - Đầu pipet dùng lần: Eppendorf 50 200μl tương đương - Sắc ký lỏng: Hệ thống sắc ký lỏng pulse-free pulse-dampened bao gồm bơm, đầu tiêm đầu ghi tương thích - Đầu dò huỳnh quang: đầu dò huỳnh quang cung cấp kích thích 365nm phát xạ > 400nm độ nhạy 50-100% đáp ứng full-scale cho 1ng dẫn xuất M1-TFA (chẳng hạn Spectroflow 980, Applied Biosystems, Inc., 170 Williams Dr, Ramsey, NJ 07446) 47 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc - Cột phân tích LC: cột 0,4x25cm chứa silicagel liên kết với C18 kích thước 5mm hình cầu (chẳng hạn DuPont ODS [MAC-MOD Analytical, Inc., Chads Ford, PA 19317], Spherisorb ODS [Phase Separations Ltd, Deeside Industrial Estate, Queensferry, Clwyd, UK]) - Máy điều hòa chân không: dụng cụ thương mại tạo điều khiển chân không hoàn toàn hay phần - Lọ silylate hóa cho dung dịch chuẩn aflatoxin: cho vào lọ ½ dram (4 6ml) gần đầy với DDS 5% gia nhiệt khoảng 40 phút 45-55oC Loại bỏ dung dịch rửa lọ lần với toluene sau lần với methanol Gia nhiệt lọ lò hấp 75oC 20-30 phút để bốc methanol Lọ có nắp (với lớp lót Teflon) bảo quản cho dung dịch chuẩn aflatoxin Hình 34 : Sơ đồ thiết bị để trích ly rửa dịch trích sữa d Chiết xuất Gắn ống vào (dài hơn) cartridge C18 vào mút Luer syringe 30-50μl Lắp đặt syringe, cartridge, bình chân không hình 26 Điều chỉnh chân không để kéo dung môi qua cartridge trường hợp nhỏ giọt nhanh (khoảng 5mmHg) Mồi cartridge cách thêm 5ml methanol, sau 5ml nước (không kéo cartridge khô, để lại lượng nước dư ống) Ngưng chân không lấy lắp ráp cartridge syringe khỏi nắp để tránh prime Làm ấm mẫu đến nhiệt độ phòng Đảo ngược mẫu > 10 lần để phân bố cream mẫu không đồng Chuyển 20ml sữa đến vạch chứa 20ml nước nóng (khoảng 80oC) (nếu cần sử dụng nước nóng để làm loãng dung dịch sữa) Lắp đặt lại lắp ráp cartridge-syringe vào nắp Rót toàn bột 40ml mẫu pha loãng, ấm vào syringe kéo nhẹ mẫu qua cartridge tốc độ dòng khoảng 30ml/phút (nhỏ giọt nhanh) Thận trọng: tốc độ dòng nhanh không đủ thời gian cho aflatoxin hấp phụ, dẫn tới mức độ thu hồi thấp Thêm 10ml dung dịch rửa H2O – 48 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc CH3CN vào syringe kéo qua Gắn syringe barrel với nắp kéo chân không lên cartridge khoảng 30s để loại bỏ nước rửa nhiều khỏi khối nhồi Mồi lại cartridge cách thêm 150μl CH3CN vào đĩa đỡ cột vào để dung môi thấm vào khối nhồi 30s Gắn cartridge với syringe mút Luer 10ml plastic hay thủy tinh, giữ lại ống trước làm đầu vào Chèn cột rửa silicagel vào bình chân không 250ml gắn với nắp cao su có lỗ (hình 26) Rửa cột với 5ml ether Thêm 7ml ether vào syringe-cartridge đặt phía cột rửa silicagel Với pittông, đẩy nhẹ qua cartridge, thu dịch tách rửa vào bình chứa cột Kéo ether chậm qua cột rửa silica, dùng chân không để trì tốc độ dòng khoảng 10ml/phút (nhỏ giọt nhanh) Rửa cột silica với 2ml ether thêm vào, tiếp tục dùng chân không Loại bỏ ether Lấy cột nắp khỏi bình đặt ống thu hồi 16x125mm vào bình để thu chất tách rửa từ cột Thêm 7ml dung môi rửa (CH2Cl2-alcohol) vào bình chứa cột Kéo dung môi qua cột với chân không tốc độ dòng khoảng 10mL/phút, thu dịch tách rửa vào ống Ngưng chân không tháo ống thu hồi khỏi hệ thống Bốc dịch tách rửa đến khô dòng khí nitơ, dùng nhiệt để giữ ống thu hồi gần nhiệt độ phòng chân không < 35oC Chuyển cắn vào lọ gram với CH2Cl2 bốc đến khô khí nitơ bể block gia nhiệt < 50oC (Không gia nhiệt mức) Giữ để tạo dẫn xuất e Sắc ký lỏng Chuẩn bị dẫn xuất dịch trích mẫu cách thêm 200ml hexane 200ml acid trifluoroacetic để làm khô cắn lọ Lắc máy Vortex – 10s Để yên hỗn hợp 10 phút 40oC, block gia nhiệt bể, sau bốc đến khô khí nitơ bể block gia nhiệt (< 50oC) Thêm 2ml H2O – CH3CN (75+25) vào lọ để hòa tan rắn lắc máy Vortex để phân tích LC Đối với dẫn xuất M1 chuẩn, thêm 200ml hexane 50ml TFA vào lọ silylate hóa trộn Thêm 50ml dung dịch chuẩn hoạt động M1 – M2 trực tiếp vào hỗn hợp hexane – TFA lắc máy Vortex 5-10s Xử lý cho dẫn xuất mẫu Ổn định thiết bị đầu dò cho tốc độ dòng khoảng 1,0ml/phút với H2O-isopropanol-CH3CN (80+12+8) Điều chỉnh đầu dò để tiêm 50-100μl chuẩn (0,625-1,25ng M1, 0,125-0,25ng M2) cho đầu ghi 50 – 75% full-scale Tiêm chuẩn LC 2-3 lần chiều cao peak không đổi Chuẩn bị đường cong chuẩn từ chiều cao diện tích peak để đảo bảo quan hệ tuyến tính Tiêm dịch trích mẫu (khoảng 50-100μl) với chất tiêm chuẩn đặt rải rác để đảm bảo định lượng xác Thời gian lưu M1 (như dẫn xuất TFA) M2 tương ứng khoảng – phút khoảng phút Tính toán nồng độ aflatoxin: ppb M1 M2 = (H x C’ x VI’ x V)/( H’ x VI xW) Trong 49 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc H H’ = chiều cao peak tương ứng mẫu chuẩn C’ = nồng độ chuẩn (ng/ml) VI’ VI = thể tích tiêm tương ứng chuẩn mẫu V = thể tích mẫu tổng cuối (ml) W = thể tích sữa đại diện cho dịch trích cuối (khoảng 20ml) Tính toán riêng lẽ cho M1 M2 5.1.3 Phương pháp PCR Phương pháp PCR (polymerase Chain Reaction) phương pháp invitro để tổng hợp ADN dựa khuôn trình tự đích ADN ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn ADN Ứng dụng PCR thực tế để phát hiện, tạo đột biến gen, chuẩn đoán bệnh, phát mầm bệnh vi sinh vật thực phẩm Tất ADN polymerase cần mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch ADN từ mạch khuôn Mạch khuôn thường trình tự ADN gen đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu gen qui định việc tổng hợp loại độc tố chuyên biệt vi sinh vật Mồi đoạn ADN ngắn, có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn nhờ hoạt động enzyme ADN polymerase đoạn mồi nối dài để hình thành mạch Khi có diện hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự ADN phản ứng PCR, điều kiện đảm bảo hoạt động ADN polymerase, đoạn ADN nằm hai mồi khuếch đại thành số lượng lớn đến mức thấy sau nhuộm băng ethidium bromide có thu nhận đoạn ADN cho mục đích tái thao tác gen Như vậy, để khuếch đại trình tự ADN xác định, cần phải có thông tin tối thiểu trình tự ADN, đặc biệt trình tự base hai đầu đoạn ADN đủ để tạo mồi bổ sung chuyên biệt Các mồi gồm mồi xuôi (sens primer) mồi ngược (antisens primer) so với chiều phiên mã gen 5.1.3.1 Các bước phương pháp PCR Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm ba bước: * Bước (bước biến tính, denaturation): dung dịch phản ứng bao gồm thành phần cần thiết cho chép, phân tử ADN biến tính nhiệt độ cao Tm phân tử, thường 94 – 950C vòng 30 – 60s Mạch đôi ADN tách thành dạng mạch đơn * Bước (bước lai, anealation): bước nhiệt độ hạ thấp Tm mồi cho phép mồi bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ dao động khoảng 40 – 700C, tùy thuộc Tm mồi sử dụng kéo dài từ 30 – 60s * Bước (bước tổng hợp, elongation): nhiệt độ tăng lên đến 720C giúp cho ADN 50 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc polymerase (vốn polymerase chịu nhiệt) hoạt động tổng hợp tốt Thời gian bước tùy thuộc độ dài trình tự ADN cần khuếch đại, thường kết dài từ 30s đến vài phút Trong phản ứng PCR chu kỳ gồm ba bước lặp lặp lại nhiều lần, lần lại làm tăng gấp đôi lượng mẫu lần trước Đây khuếch đại theo cấp số nhân Theo tính toán sau 30 – 40 chu kỳ, khuếch đại cho rra khoảng 106 Sau phản ứng PCR, ADN nhuộm ethidium bromide quan sát thấy thong qua việc điện di sản phẩm PCR gel agarose quan sát tia UV (bước sóng 312nm) Nhiệt độ (0C) Chu kỳ 100 90 Chu kỳ Biến tính mẫu 80 70 Tổng hợp ADN 60 Mồi bắt cặp 50 10 Thời gian (phút) Hình 35: Các bước phản ứng PCR 5.1.3.2 Những ưu, nhược điểm phương pháp PCR phát vi sinh vật gây bệnh * Ưu điểm - Thời gian cho kết nhanh - Có thể phát vi sinh vật khó nuôi cấy Việc nuôi tăng sinh đơn giản không cần thiết - Hóa chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm dễ tồn trữ so với trường hợp huyết học Không cần dụng cụ môi trường chuẩn đoán phức tạp, thực trường - Ít tốn mặt nhân sự, tự động hóa để làm giảm chi phí phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm * Nhược điểm - Sự ức chế hoạt tính Taq ADN polymerase thành phần mẫu vật mẫu thực phẩm thường có thành phần phức tạp Tuy nhiên việc chiết tách tinh chế ADN từ thực phẩm hay môi trường trước thực phương pháp PCR thường cho phép loại bỏ hợp chất 51 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc ức chế - Mật độ vi sinh vật gây bệnh diện mẫu thực phẩm thường thấp, nên đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có mật độ đủ để phát PCR - Phương pháp không phát tế bào sống với tế bào chết, dẫn đến trường hợp dương tính giả ADN từ tế bào chết Ngược lại, phương pháp cho phép phát bào tử, dạng tiềm sinh hay tế bào chết vi sinh vật gây bệnh gây ngộ độc 5.1.3.3 Ứng dụng phương pháp PCR xác định độc tố aflatoxin Xác định gen aflatoxin aflD, aflO aflP phản ứng chuỗi polymerase chép ngược (RT-PCR) để nhận định dịch trích Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus có chứa aflatoxin a Giống nấm môi trường Giống A.parasiticus A.flavus dùng thí nghiệm liệt kê Bảng cung cấp Dr N Keller, Department of Plant Biology University of Wisconsin-Madison, USA; Dr G Criseo, Department of Microbiological, Genetic Molecular Sciences, University of Messina, Italy; Dr M Klich, Dr P Cotty, Dr J Yu, Southern Regional Research Center, Agricultural Research Service, U.S Department of Agriculture, New Orleans, USA Canh trường nấm sinh trưởng potatodextrose agar [PDA: 24 g/l dịch potato-dextrose, 15% (w/v) agar kỹ thuật (Becton, Dickinson and Co., Franklin Lakes, NJ, USA)] bổ sung với chloramphenicol để ngăn cản nhiễm vi khuẩn (250g/l; Sigma, St Louis, MO, USA) 25oC tối Canh trường bào tử đơn thu nhận cách chuyển lượng nhỏ sợi nấm vào 10ml nước cất tiệt trường ủ đĩa thạch agar (agar kỹ thuật 15% w/v) Đĩa agar rửa vài lần với dịch bào tử ủ qua đêm nhiệt độ phòng Khuẩn lạc đơn bào tử kiểm tra kính hiển vị lập thể, sau chuyển vào đĩa PDA ủ 25oC tối Tất giống bảo quản PDA lớp dầu khoáng (Sigma) 12oC Bảo quản thời gian dài bánh PDA ủ glycerol 50% 80oC Đối với thí nghiệm cảm ứng aflatoxin, giống Aspergillus sinh trưởng môi trường cảm ứng aflatoxin [YES: yeast extract-sucrose (Abdollahi and Buchanan, 1981): 2% (w/v) yeast extract (Becton, Dickinson and Co.), 15% sucrose (Sigma)] môi trường không cảm ứng [YEP, yeast-extract-peptone (Abdollahi and Buchanan, 1981): 2% yeast extract, 15% peptone (Becton, Dickinson and Co.)] Canh trường lỏng chuẩn bị cách ủ 100 μl huyền phù bào tử chứa 108 conidiospores/mL nước cất tiệt trùng hộp Petri chứa 15ml môi trường YES YEP ủ ngày 25oC tối, không lắc 52 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc Bảng 7: Giống A.flavus A.parasiticus kiểm tra b Trích ly ARN tổng RT-PCR ARN tổng trích ly từ giống Aspergillus sinh trưởng môi trường YES YEP Sợi nấm nghiền N2 lỏng với cối chày tiệt trùng Khoảng 0,2g sợi nấm nghiền che phủ với 1ml TRIZOLR (Sigma) ARN tổng trích ly theo hướng dẫn nhà sản xuất 11 cặp mồi thiết kế cho khuếch đại đặc hiệu gen aflD, aflG, aflH, aflI, aflK, aflM, aflO, aflP, aflQ, aflS, aflR (Bảng 8) Gen quản lý tub1 mã hóa cho μ-tubulin chọn làm hệ thống điều khiển cho trình chép ngược Bất kỳ lúc có thể, đoạn mồi thiết kế từ vùng mã hóa bỏ qua nhiều intron, để phân biệt ARN bổ sung ARN gen Ngoài ra, hai cặp đoạn mồi thiết kế trước cho khuếch đại RT-PCR gen aflR aflQ (syn ordI=ordA) [aflR620: 5’-CGCGCTCCCAGTCCCCTTGATT-3’; aflR1249: 5’-CTTGTTCCCCGAGATGACCA-3’; TTAAGGCAGCGGAATACAAG-3’; ord2226: ord1508: 5’- 5’-GACGCCCAAAGCCGAACACAAA- 3’(Sweeney et al., 2000)] kiểm tra so sánh với triển khai Sao chép ngược thực dùng kit Qiagen OmniscriptR kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) với 20 μL hỗn hợp phản ứng chứa: x đệm phản ứng, dNTP 0,5mM, đoạn mồi oligodT μM, enzym ức chế ARNase 10 U (Promega, Madison, WI, USA), enzym chép ngược Reverse Transcriptase Omniscript U, 100 ng ARN Hỗn hợp phản ứng khuấy trộn nhanh ủ 60 phút 37oC Các mẫu vô hoạt cách gia nhiệt đến 93oC phút, sau làm nguội nhanh nước đá RT-PCR thực 25 μl chứa: x đệm phản ứng, dNTP 20 μM, đoạn mồi 0,2 μM, enzym polymerase TaqR Red U (sigma), μl hỗn hợp ARN bổ sung Thông số chu kỳ: phút 94oC 35 chu kỳ, 5s 94oC, 60s 55oC, 90s 72oC cuối 72oC phút máy cycler nhiệt ARN (GeneAmpR PCR System 9700, Applied Biosystems, 53 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc Foster City, CA, USA) Để kiểm tra có mặt ARN gen nhiễm vào mẫu ARN tổng, PCR thực trên, dùng đoạn mồi tương tự thiết kế cho RT-PCR 100ng ARN tổng làm khuôn Bảng 8: Đoạn mồi sử dụng c Trích ly ADN tổng khuếch đại ADN gen tổng tinh từ sợi nấm Aspergillus làm khô lạnh sinh trưởng môi trường YES, cách thông qua phương pháp mini-prep chuẩn (Lee et al., 1988) hiệu chỉnh sau: 50mg sợi nấm nghiền trộn với 100 μl EDTA 50mM, SDS 0,2% (pH 8,5), 100 μg proteinase K trích ly lần với thể tích phenol-chloroformisoamylalcool (25:24:1) Acid nucleic tủa với thể tích isopropanol, rửa với ethanol 70%, tạo huyền phụ lại TE pH 8,0 PCR thực trên, dùng bột đoạn mồi tương tự thiết kế cho RT-PCR 1-10ng ADN gen làm khuôn 5.2 Phương pháp truyền thống 5.2.1 Kỹ thuật định danh nấm mốc (tiêu chuẩn ngành y tế nhóm TQTP 52 TCN-TQTP 0001:2003) 5.2.1.1 Nguyên lý phương pháp Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa, đếm khóm nấm môi trường thạch Sabouraud sau ủ hiếu khí nhiệt độ 28 ± 10C thời gian ngày Số lượng bào tử nấm mốc có 1g (1ml) mẫu kiểm tra tính từ số khóm nấm đếm từ đĩa nuôi cấy theo đậm độ pha loãng 54 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc Sau đó, để xác định tên (định danh) nấm mốc (đến nhóm) phải tiến hành qua nhận xét đại thể đặc điểm khuẩn lạc nấm mốc (colony characters) nhận xét vi thể hình thái học khuẩn lạc nấm mốc (morphology) 5.2.1.2 Phạm vi áp dụng Định danh nấm mốc A.flavus, A.niger, A.fumigatus sản phẩm lương thực thực phẩm 5.2.1.3 Dụng cụ, môi trường dung dịch cần thiết a Dụng cụ, thiết bị Dụng cụ thiết bị chuyên dụng phòng kiểm nghiệm vi sinh vật b Môi trường, dung dịch cần thiết - Thạch Sabouraud - Thạch Czapeck - Nước thạch / 00 - Dung dịch Lactofenol Amann 5.2.1.4 Chuẩn bị môi trường mẫu thử a Chuẩn bị môi trường Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng dung dịch cần thiết điều chế theo công thức Các môi trường đóng sẵn vào bình cầu, bình nón, ống nghiệm hấp tiệt trùng (1100C/30 phút 1210C/15 phút) b Chuẩn bị mẫu dung dịch mẫu thử * Chuẩn bị mẫu Mẫu thực phẩm cắt nhỏ xay nhuyễn máy điều kiện vô trùng thể đồng * Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10 -1 Cân xác 25g thực phẩm chuẩn bị (hoặc hút 25ml thực phẩm lỏng), cho vào bình nón chứa sẵn 225ml nước thạch 10 / 00 Lắc 2-3 phút, thu dung dịch mẫu thử 10 -1 * Chuẩn bị dung dịch mẫu thử 10 -2 , 10 -3, 10 -4 … - Hút xác ml dung dịch mẫu thử 10 -1 cho sang ống nghiệm chứa sẵn ml nước thạch 10/00 Lắc 2-3 phút, thu dung dịch 10 -2 - Tiếp tục làm tương tự vậy, ta thu dung dịch mẫu thử tương ứng 10 -3 , 10 -4 … * Phương pháp tiến hành - Bước : Nuôi cấy mẫu + Ghi ký hiệu mẫu nồng độ dung dịch mẫu thử lên hộp lồng + Dùng pipet ml vô trùng, hút xác ml từ dung dịch mẫu thử đậm độ cho vào hộp lồng 55 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc + Mỗi mẫu thực phẩm phải nuôi cấy đậm độ pha loãng Mỗi đậm độ pha loãng phải nuôi cấy hộp lồng vô trùng dùng pipet ml vô trùng riêng + Đun nóng chảy thạch sabouraud, để nguội đến 45 ± 10C Trong điều kiện vô trùng chỉnh pH thạch đến 4,5 - 5,5 dung dịch axit lactic 20 % , 40 % , hay dung dịch axit xitric 20 % + Rót vào hộp lồng 12 – 15 ml thạch sabouraud, trộn dung dịch mẫu thử với thạch cách xoay tròn sang phải sang trái lần + Để đĩa thạch đông tự nhiên mặt phẳng ngang Sau để đĩa thạch vào tủ ấm 28 ± 10C nhiệt độ phòng thí nghiệm tương ứng ngày Không lật ngược đĩa Lưu ý: Thời gian từ bắt đầu pha loãng mẫu thử đến rót thạch vào hộp lồng không 30 phút - Bước : Sơ nhận định kết + Chọn đĩa có không 50 khóm nấm để sơ đọc kết + Đếm ghi lại số khóm nấm nghi ngờ A.flavus (có màu xanh lục vàng lục) đậm độ Sau dùng que cấy nhọn đầu lấy bào tử cấy ba điểm cách đĩa thạch Czapek, ủ ấm 28 ± 10C ngày Không lật ngược đĩa + Đếm ghi lại số khóm nấm nghi ngờ A.niger (có màu đen, nâu thẫm lấm bã cafe) độ đậm Sau dùng que cấy nhọn đầu lấy bào tử cấy ba điểm cách đĩa thạch Czapek, ủ ấm 28 ± 10C ngày Không lật ngược đĩa + Đếm ghi lại số khóm nấm nghi ngờ A.fumigatus (có màu xanh đậm hay gọi màu ám khói) độ đậm Sau dùng que cấy nhọn đầu lấy bào tử cấy ba điểm cách đĩa thạch Czapek, ủ ấm 28 ± 10C ngày Không lật ngược đĩa - Bước : Định danh + Để xác định tên nấm mốc, từ khóm nấm thạch Czapek tiến hành nhận xét đại thể, vi thể o Đại thể: Bằng mắt thường, hay dùng kính lúp cầm tay ta nhận xét kích thước, màu sắc … khóm nấm o Vi thể: Để nhận xét nấm mốc vi thể phải làm tiêu nấm mốc, quan sát hình thái học kính hiển vi vật kính 10, 40 Có thể chọn cách sau để làm tiêu nấm mốc: + Cách : Lấy lam kính sạch, trong, sấy khô Nhỏ giọt Lactophenol Amann lên lam kính Dùng que cấy nhọn đầu lấy phần khóm nấm mọc đĩa thạch Sabouraud (cả phần mọc mặt thạch) để vào giọt dung dịch Lactophenol Amann Dùng kim có 56 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc cán hay que cấy nhọn dìm nấm vào giọt dung dịch Lactophenol Amann để thấm ướt Khi nấm bị thấm ướt hoàn toàn đậy kính lên ép nhẹ Lưu ý: - Khi đậy kính đừng để có bọt khí, có gặp khó khăn soi kính - Khi ép nhẹ kính, nên dùng giấy thấm bớt dung dịch Lactophenol Amann thừa để dung dịch không tràn lên mặt kính + Cách : Lấy lam kính sạch, trong, sấy khô Lấy đoạn giấy bóng kính có kích thước rộng khoảng 1cm, dài khoảng 2-3cm, chạm vào khóm nấm mọc đĩa thạch Sabouraud cho lấy toàn hình thái nấm (từ tế bào chân đế đến hạt đính) Sau trải dài giấy bóng kính lam kính 5.2.1.5 Xác định tên nấm mốc (A.flavus) + Khóm nấm mốc có đường kính d = – cm thạch Czapek sau ngày Khóm nấm lúc đầu vàng, cuối trở nên xanh lục vàng lục, hoá nâu già + Bông lớn hình cầu, hình tia, tạo thành cột không rõ rệt Bọng hình cầu đến gần cầu Thể bình tầng, đa số loài thể bình tầng Vách cuống conidi xù xì Hạt đính hình cầu đến gần cầu, trơn có gai 5.2.1.6 Tính kết Để xác định tổng số bào tử nấm mốc có 1g (1ml) mẫu kiểm nghiệm, chọn đĩa có không 50 khóm nấm độ pha loãng liên tiếp Sự phân bố khóm nấm phải hợp lý: độ pha loãng cao số khóm nấm Kết tính theo công thức sau: N = C / ( n1 + 0,1 x n2 ) x d C: Số khóm nấm mốc đếm đĩa chọn n1, n2: Số đĩa đậm độ pha loãng liên tiếp d: Hệ số pha loãng đậm độ pha loãng thấp + Nếu chênh lệch giá trị đậm độ lớn lần lấy giá trị đậm độ pha loãng thấp để tính kết cách tính trung bình cộng + Nếu đĩa đậm độ pha loãng ban đầu có khóm nấm tính kết theo trung bình cộng 57 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc VI KẾT LUẬN Ðể phát triển, nấm mốc cần phải có môi trường phù hợp với chúng, độ ẩm cao nhiệt độ nóng ẩm thích hợp Thông qua trình tìm hiểu kỹ đặc tính nấm mốc độc tố mà chúng sản sinh trình phát triển giúp cho biết rõ tác hại mà độc tố nấm móc gây ra, chế gây độc chúng, cách phòng chống để hạn chế nhiễm nấm mốc vào thực phẩm, trình bảo quản nông sản thực phẩm Đặc biệt Việt Nam nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên thuận lợi cho chúng phát triển hiểu rỏ nấm mốc đề biện pháp để ngăn ngừa chúng cách hiệu Do thời gian có hạn nên nghiên cứu hết tất chế gây độc độc tố nấm mốc đề đề tài tiểu luận nên làm rõ vấn đề 58 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc TÀI LIỆU THAM KHẢO Lê Anh Phụng cộng tác viên, Khảo sát tình hình nhiễm độc tố Aflatoxin thức ăn hỗn hợp gia cầm Tp Hồ Chí Minh, Tập san khoa học kỹ thuật Nông lâm nghiệp 6/1999, 1998 Lê Ngọc Tú, Độc Tố Học Và An Toàn Thực Phẩm, Nhà xuất Khoa Học Và Kỹ Thuật, 2006 Lê Văn Việt Mẫn, Lại Mai Hương, Thí nghiệm vi sinh vật học thực phẩm, nhà xuất Đại Học Quốc Gia Thành Phố Hồ Chí Minh, 2006 Moreau Claude, Đặng Vũ Hồng Miên, Nấm Mốc Độc thực phẩm, nhà xuất khoa học kỹ thuật, 1974 Nguyễn Đức Lượng, Cơ sở vi sinh vật công nghiệp, nhà xuất - Đại học quốc gia Tp HCM, 2004 Nguyễn Đức Lượng – Tạ Minh Tâm, Vệ sinh an toàn thực phẩm, nhà xuất - Đại học quốc gia Tp HCM, 2005 PGS TS Nguyễn Phùng Tiến, GS TS Bùi Minh Đức, GS TS Nguyễn Văn Dịp, Vi sinh vật thực phẩm, Kỹ thuật kiểm tra tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm, nhà xuất y học Hà Nội, 2003 Trần Linh Thước, Phương pháp phân tích vi sinh vật thực phẩm mỹ phẩm, nhà xuất giáo dục, 2005 Aydin, A Emin Erkan A., Baokaya R., Ciftcioglu G., Determination of AXatoxin B1 levels in powdered red pepper, Food Control 18 (2007) 1015–1018 10 Barbara Scherm, Michele Palomba, Domenico Serra, Angela Marcello, Quirico Migheli, Detection of transcripts of the aflatoxin genes af lD, af lO, and af lP by reverse transcription–polymerase chain reaction allows differentiation of aflatoxin-producing and non-producing isolates of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus, International Journal of Food Microbiology 98 (2005) 201– 210 11 Kim E Sapsford, Chris R Taitt, Stephanie Fertig, Martin H Moore, Michael E Lassman, Chris M Maragos, Lisa C Shriver-Lake, Indirect competitive immunoassay for detection of aflatoxin B1 in corn and nut products using the array biosensor, Biosensors and Bioelectronics 21 (2006) 2298–2305 12 Lequin R, Enzyme immunoassay (EIA)/enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Even some Clinical Chemistry 51 (2005) 2415 – 2418 59 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc 13 Marilena Muscarella, Sonia Lo Magro, Carmen Palermo, Diego Centonze, Validation according to European Commission Decision 2002/657/EC of a confirmatory method for aflatoxin M1 in milk based on immunoaffinity columns and high performance liquid chromatography with fluorescence detection, Analytica Chimica Acta 594 (2007) 257 – 264 14 http://thuvie and when nkhoahoc.com/tusach/ELISA 15 http://www.bme.vn/bmevn/bme/index 16 http://www.biotox.cz/toxikon/mikromycety/trichotheceny.php 60 http://www.ebook.edu.vn [...]... T-2 là một độc tố nấm mốc thuộc nhóm trichothecen do Fusaria spp sinh ra, T-2 thường nhiễm trên các loại lương thực 3.6.4.1 Nấm mốc tổng hợp trichothecen Có khoảng 60 nhóm nấm mốc có thể tổng hợp được trichothecen, bao gồm Fusaria, Tricoderma, Myrothecium, Stachybotry Các nấm mốc này có thể phát triển tốt trong điều kiện nhiệt độ thấp Các nấm mốc này vốn được xem là tác nhân chống mốc hoặc vi khuẩn... Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc 3.6.3 Patulin (Clavaxin) 3.6.3.1 Nấm mốc tổng hợp patulin Patulin là hợp chất trao đổi bậc hai do nấm mốc Penicillium, Aspergillus và Byssochlamys tạo nên Các chủng tổng hợp patulin chủ yếu là các loài thuộc Aspergillus như A clavatus và A giganteus Trong số các Penicillium thì loài tổng hợp patulin nhiều nhất là P expansum, P urticae, P griseofulvum Các loài nấm mốc này thường... nhiễm OTA phụ thuộc rất nhiều vào xuất xứ địa lý của nguyên liệu 3.6.2.1 Các loài nấm mốc sản ra ochratoxin Các chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp OTA còn chưa được xác định Nhưng các nghiên cứu về OTA cho tới nay cho thấy rằng các chủng nấm mốc có thể rất khác nhau trên các đối tượng khác nhau và thuộc vào giống nấm mốc phổ biến Aspergillus và Penicillium ví dụ các chủng rất phổ biến trên lương thực... thứ cấp bậc II trong qúa trình phát triển của vi nấm, nó không phải là chất dự trữ cũng không phải là chất cặn bã 3.6.1.1 Các loài nấm mốc sản ra các aflatoxin Các chủng nấm mốc tổng hợp aflatoxin chủ yếu thuộc Aspergillus flavus, A parasiticus, A nomius Loài Penicillium puberulum có thể sản ra các aflatoxin nhưng với số lượng ít Aspergillus flavus là nấm mốc mà hiệu lực gây độc gọi là bệnh độc tố aflatoxin... 100% ngô bảo quản bị nhiễm fumonisin 3.6.5.1 Nấm mốc tổng hợp fumonisin Fumonisin chủ yếu do các nâm mốc thuộc giống Fusarium tổng hợp nên Loại điển hình nhất trong nhóm này là Fusarium moniliforme Các chủng nấm mốc của loài này, do Sheldon xác định vào năm 1904 khá phổ biến trong môi trường và thường nhiễm trong lương thực đặc biệt là ngô Hình 18 : Nấm mốc Fusarium Vào năm 1988, các độc tính của fumonisin... (potato dextrose agar) lẫn trên lương thực (ngô), tuy nhiên lúc này nấm mốc chỉ tổng hợp một lượng không đáng kể fumonisin ngay cả trong một thời gian dài 10 tuần Trong điều kiện yếm khí, nấm mốc phát triển rất yếu và không có khả năng sinh độc tố, độ ẩm của nguyên liệu hầu như không có ảnh hưởng đáng kể khả năng phát triển của nấm mốc cũng như khả năng tổng hợp fumonisin của chúng 3.6.5.2 Cấu trúc... Phẩm – Nấm Mốc Ngoài ra, người ta còn phát hiện ra rằng fumonisin thường được tổng hợp cùng với aflatoxin, do vậy, độc tính của độc tố có thể còn tăng hơn nữa Cho tới nay, tương tác của các độc tố này còn chưa được biết rõ Hình 20: Ảnh hưởng của fumonisin lên não Hình 21: Ảnh hưởng của fumonisin lên phổi ở gia cầm 3.6.6 Zearalenon (ZEN) 3.6.6.1 Nấm mốc tổng hợp Zen Chất độc Zen do các loài nấm mốc sau... là chủng nấm mốc trong tự nhiên song khó phân lập Chúng có thể phát triển trên thóc gạo sau khi thu hoạch nếu độ ẩm đạt đến 14,6%, thích hợp với nhiệt độ thấp và ít ánh sáng Ở độ ẩm cao hơn, sự phát triển của các loại nấm khác có thể chiếm ưu thế hơn Citreoviridin gây bệnh tê phù, một loại bệnh trước kia được xem như loại bệnh về dinh dưỡng, 34 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc một... 24 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc Satratoxin T2 Deoxydivanenol Hình 16: Cấu trúc trichothecen 3.6.4.3 Độc tính Trichothecen được xếp vào nhóm các sesquiterpen Các dẫn xuất của họ độc tố này khác nhau tùy theo nhóm bên, bao gồm T-2, HT-2, nivalenol, deoxynivalenol, anguidin, diacetyloxyscirpenol (DAS), và crotoxin Từ canh trường nấm mốc, thu các độc chất này dưới dạng các chất màu... phenol được tách ra khó hay dễ 21 http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc Hình 12: cấu trúc của ochratoxin 3.6.2.3 Độc tính Trong số các ochratoxin, OTA có độc tính cao nhất Đây là hợp chất không mùi, kết tinh, hòa tan trong dung môi phân cực và trong dung dịch bicabonat, hòa tan hạn chế trong nước OTA là độc tố nấm mốc liên quan tới bệnh thận cấp tính của lợn, gây quái thai cho chuột và phôi ... tố nấm mốc chế sinh độc tố chúng vấn đề cần thiết để từ có biện pháp phòng ngừa góp phần làm giảm tỉ lệ bị nhiễm độc từ độc tố nấm mốc II GIỚI THIỆU VỀ NẤM MỐC Nấm mốc tên chung để nhóm nấm nấm... nấm mốc Do cấu tạo đặc biệt, nấm mốc hoàn toàn khác với vi khuẩn nấm men Dựa vào cấu tạo chúng mà người ta chia nấm mốc làm loại http://www.ebook.edu.vn Vi Sinh Thực Phẩm – Nấm Mốc a Loại nấm mốc. .. gồm: − Nấm mốc ưa nhiệt (đến 60oC, thermophile) − Nấm mốc chịu nhiệt (20 – 50oC, thermotolerant) − Nấm mốc chịu nhiệt (10 – 40oC, mesophile) − Nấm mốc ưa lạnh (5 – 10oC, psychrophile) − Nấm mốc