Phương pháp phân lập nấm sợi

Phương pháp phân lập nấm sợi Phương pháp phân lập nấm sợi Bởi: Nguyễn Lân Dũng PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP NẤM SỢI Kỹ thuật phân lập để tìm loài nấm hay nấm hữu ích quan trọng trình nghiên cứu Không có quy luật chung dùng cho phân lập vi sinh vật Phương pháp phân lập tốt phương pháp mà ta lựa chọn để phân lập vi sinh vật mà ta cần Suy nghĩ cách sáng tạo cho công việc thành thạo với kỹ thuật phân lập yêu cầu chung nhà vi sinh vật Các nhà nấm học Nhật Bản thường dùng phương pháp sau để phân lập nấm sợi: Sử dụng kim nhọn nhặt bào tử (Dr Chiharu Nakashima); Phân lập bào tử đơn độc (Dr Chiharu Nakashima); Sử dụng vi thao tác Skerman (Dr Katsuhiko Ando); Phương pháp pha loãng (Dr Misa Otoguro); Phân lập từ bào tử đảm (Dr Chiharu Nakashima); Phương pháp rửa bề mặt (Dr Katsuhiko Ando); Phương pháp sát khuẩn bề mặt (Dr Ju-Young Park); Phương pháp dùng buồng kích ẩm (Dr Katsuhiko Ando); Phương pháp kích thích nảy mầm nấm(Dr Ju-Young Park); Phương pháp sục khí (Dr Katsuhiko Ando) Dưới xin phép trình bày số phương pháp hay dùng nhất, áp dụng phân lập nấm đất, rụng nấm nội sinh endophyte Bảo tàng Giống chuẩn Vi sinh vật- Trung tâm công nghệ Sinh học- Đại học Quốc gia Hà nội chương trình hợp tác nghiên cứu đa dạng sinh học với Viện Công nghệ Đo lường Quốc gia Nhật Bản (NITE- Japan) Phương pháp dùng kim nhọn: Sử dụng phương pháp để phân lập tất loại nấm phát triển chất Cách làm: 1) Đặt chất cần phân lập (lá, cành mục, ) lên kính hiển vi vật kính X10 (độ phóng đại 10 lần) lên kính lúp 1/6 Phương pháp phân lập nấm sợi 2) Chỉnh tiêu cự để quan sát bào tử, cuống sinh bào tử từ chất 3) Khử trùng que nhọn lửa đèn cồn 4) Đưa que nhọn vào khoảng vật kính chất, nhặt bào tử chuyển sang môi trường phân lập 5) Nuôi cấy bào tử nhiệt độ 250C, quan sát nảy mầm bào tử hàng ngày đến hình thành khuẩn lạc chuyển sang môi trường thạch nghiêng Phương pháp phân lập bào tử đơn độc: Sử dụng phương pháp để phân lập nấm gây bệnh thực vật Cách làm: 1) Chuẩn bị dịch huyền phù bào tử: Dùng kim nhọn đánh bẹt đầu, gắn vào tay cầm chắn, dùng que cào vào chỗ bệnh có xuất đốm nấm, đặt sang lam kính có sẵn giọt nước vô trùng, khuấy đềù 2) Dùng đầu kim lấy giọt nước có hoà tan bào tử vẽ hình tam giác lên môi trường thạch nước (Water agar) Ủ 200C 24 3) Quan sát kính hiển vi, tìm bào tử nảy mầm môi trường thạch đĩa theo đường viền tam giác Đánh dấu điểm có bào tử nẩy mầm bút viết kính mặt đĩa thạch 4) Chuyển đĩa môi trường thạch có nuôi cấy bào tử sang kính lúp Quan sát vị trí đánh dấu bào tử nẩy mầm Thanh trùng que cấy, dùng que cấy lấy bào tử nảy mầm ra, chuyển sang ống nghiệm môi trường thạch nghiêng để nuôi cấy Phương pháp dùng vi thao tác Skerman: Chuẩn bị dụng cụ: Bộ vi thao tác Skerma gồm phần (hình bên) 2/6 Phương pháp phân lập nấm sợi 1) Lấy ống pipet pastơ hơ lửa đèn cồn, kéo thành ống nhỏ, dài khoảng 4cm, gắn vào ống sắt cục nam châm D ( cố định parafin nóng chảy) 2) Cố định phần dụng cụ B vào vật kính 10 3) Gắn nam châm có ống thuỷ tinh vào rãnh kim loại dụng cụ B 4) Di chuyển phần thiết bị có gắn cục nam châm lên xuống nhìn thấy đầu ống thuỷ tinh vi trường 5) Gắn đầu kim hàn E vào biến A đặt vào vị trí đặt tiêu kính hiển vi 6) Chỉnh kính, tìm vi trường, quan sát đầu kim hàn, điều chỉnh cho đầu que hàn ống thuỷ tinh sát quan sát kính hiển vi 7) Bật biến A nấc cao để đầu que hàn nóng đỏ tiến phía ống thuỷ tinh, ấn que hàn chạm vào ống thuỷ tinh để ống thuỷ tinh bắt đầu nóng chảy, kéo nhanh ống thuỷ tinh khỏi kim hàn tạo thành que thuỷ tinh thuôn nhọn 8) Hạ nhiệt độ que hàn cách giảm biến thế, dùng đầu que hàn chạm nhẹ vào đầu que thuỷ tinh kéo nhẹ tạo thành hình chữ L Giờ ta bắt đầu thực hành lấy bào tử đơn độc đĩa thạch Các bước tiến hành: 1) Chuẩn bị mẫu: khô, cho vào hộp nhựa túi ni lông có chứa nước vô trùng sẵn để làm ẩm, giữ 2-3 ngày nhiệt độ phòng, để kích thích bào tử nẩy mầm 3/6 Phương pháp phân lập nấm sợi 2) Lấy mẫu cho vào cốc thuỷ tinh, cho thêm nước cất, khuấy nhẹ nhàng cho bào tử lên mặt nước 3) Thu thập bào tử cách lấy lam kính để nghiêng 450 so với mặt nước để lấy nước bề mặt cốc Dùng lam kính trải đường thẳng mặt đĩa môi trường phân lập nấm LCA (Low cacbon agar), MEA (Malt extract agar) 4) Quan sát đĩa thạch kính hiển vi, tìm bào tử có hình dạng đặc biệt Khi thấy bào tử cần tìm giữ nguyên vị trí 5) Gắn phần dụng cụ hình chữ V (hình C) vi thao tác vào vật kính 10 kính hiển vi Tiếp đến gắn phần nam châm có que thuỷ tinh hình chữ L vừa làm xong vào phần dụng cụ chữ V Điều chỉnh lên xuống cho quan sát đầu chữ L que thuỷ tinh 6) Nâng kính lên cho bề mặt thạch sát với đầu que thuỷ tinh, lúc ta quan sát bào tử nấm cần tìm đầu L que thuỷ tinh 7) Dùng que L kéo bào tử cần lấy phần môi trường đĩa thạch Dùng kim phần chữ L đánh dấu điểm đặt bào tử 8) Hạ đĩa môi trường thấp xuống dùng que cấy vô trùng lấy bào tử điểm đánh dấu chuyển sang đĩa thạch môi trường MEA Nuôi cấy nhiệt độ phòng quan sát nảy mầm bào tử hàng ngày Nếu bào tử nảy mầm chuyển sang thạch nghiêng để giữ giống sau để thạch đĩa 2-4 tuần Phương pháp pha loãng: Phương pháp dùng cho mẫu đất Trước hết mẫu đất phải xử lý trước phân lập cách phơi khô nhiệt độ phòng 2-3 ngày, sau dùng rây qua sàng có kích thước 2-3mm Cân 1g đất xử lý cho vào 9ml nước cất khử trùng, dùng vortex hoà tan đất Pha loãng mẫu nồng độ pha loãng khác nhau: 10-4, 10-5 nồng độ thích hợp để phân lập nấm đất Việt Nam Hút 0,5 ml dịch pha loãng nồng độ nhỏ lên đĩa Peptri chứa môi trường phân lập ( môi trường Martin, môi trường sở) Dùng que gạt trang dịch bề mặt thạch 4/6 Phương pháp phân lập nấm sợi Đặt đĩa thạch tủ 250C, phân lập nấm sợi từ khuẩn lạc riêng rẽ đĩa thạch sau khoảng thời gian 4- 10 ngày Phương pháp pha loãng kết hợp với xử lý tia cực tím: Tương tự bước ban đầu phương pháp pha loãng Thêm bước tiếp đặt đĩa Peptri chứa môi trường phân lập gạt dịch pha loãng bề mặt thạch vào tủ cấy bật đèn tím 20 phút Các bước khác tương tự phương pháp pha loãng thông thường Phương pháp phân lập nấm đảm nấm túi (Basidiomycetes Ascomycetes) Quả thể nấm sau thu hái, rửa sạch, cắt miếng nhỏ khoảng 5cm phần bên Rửa nước cất vô trùng (2-3 phút), sau dùng băng dính mặt dính 3-4 miếng cắt thể gắn vào nắp đĩa thạch nước Đánh dấu vị trí gắn miếng nấm bút viết kính đáy đĩa thạch nước Ủ 200C vòng 24 Soi kính lúp vị trí đánh dấu xem độ nảy mầm bào tử nấm Dùng que cấy hình vòng tròn lấy đám bào tử vừa nảy mầm chuyển sang đĩa môi trường thạch cao malt Phương pháp rửa bề mặt: Phương pháp dùng để phân lập nấm từ tươi rụng Cách làm: 1) Cắt mẫu (tươi khô), rễ cây, cành cây, thành miếng nhỏ, sau cho vào ống nghiệm 2)Thêm 20ml dung dịch 0.005% Aerosol OT (di-iso-octyl sodium sulfosuccinate) dung dịch 0.005% Tween 80, lắc mạnh máy vortex khoảng 10 phút để loại trừ vi sinh vật bám bề mặt mẫu 3) Bước làm khô mẫu: loại bỏ nước ống nghiệm, dùng kẹp vô trùng lấy mẫu đặt lên bề mặt giấy lọc để qua đêm tủ cấy vô trùng, bước có tác dụng loại bỏ nhiễm khuẩn 5/6 Phương pháp phân lập nấm sợi 4) Dùng kẹp vô trùng đặt mẫu làm khô lên bề mặt môi trường thạch LCA lăn vòng mẫu (để loại tạp nhiễm (nếu có) lần nữa), đĩa thạch chia làm phần để kiểm tra 5) Sau chuyển mẫu sang đĩa thạch môi trường LCA vô trùng khác, đĩa nên đặt mẫu, mẫu miếng cắt Ủ nhiệt độ 250C vòng tháng 6) Trong khoảng thời gian hàng ngày phải kiểm tra nảy mầm vi sinh vật kính lúp, phân lập nấm sợi có 6/6 ... dịch bề mặt thạch 4/6 Phương pháp phân lập nấm sợi Đặt đĩa thạch tủ 250C, phân lập nấm sợi từ khuẩn lạc riêng rẽ đĩa thạch sau khoảng thời gian 4- 10 ngày Phương pháp pha loãng kết hợp với xử lý... trường thạch nghiêng để nuôi cấy Phương pháp dùng vi thao tác Skerman: Chuẩn bị dụng cụ: Bộ vi thao tác Skerma gồm phần (hình bên) 2/6 Phương pháp phân lập nấm sợi 1) Lấy ống pipet pastơ hơ lửa... để phân lập nấm đất Việt Nam Hút 0,5 ml dịch pha loãng nồng độ nhỏ lên đĩa Peptri chứa môi trường phân lập ( môi trường Martin, môi trường sở) Dùng que gạt trang dịch bề mặt thạch 4/6 Phương pháp