Bước đầu nghiên cứu dược động học của glycyl funtumin trên động vật thí nghiệm bằng LC MS MS

Ket-noi.com chia se Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐAI HOC • • Dươc HÀ NÔI • • DSễLÊ THI THU HUYÈN Bước ĐẦU NGHIÊN c ứ u Dược ĐỘNG HỌC CỦA GLYCYL FUNTUMIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM BẰNG LC-MS/MS LUÂN VĂN THAC sĩ • • Dươc HOC • HÀ NỘI, NĂM 2011 • Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐAI HOC • • Dươc HÀ NÔI • • DS LÊ THI THU HUYỀN B c ĐÀU NGHIÊN c ứ u Dược ĐỘNG HỌC • • • CỦA GLYCYL FUNTUMIN TRÊN ĐỘNG VẬT THI NGHIỆM BẰNG LC-MS/MS LUÂN VĂN THAC s ĩ • • Dươc HOC • • KIÊM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 607315 Người hướng dẫn khoa học: TS.Phùng Thị Vinh HÀ NỘI, NĂM 2011 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Thị Vinh, Thsẽ Tạ Mạnh Hùng- Trung tâm đánh giá Tương đương sinh họcViện Kiểm nghiệm thuốc TW TS Nguyễn Hoàng Anh- Bộ môn Dược lực- Trường Đại học Dược Hà Nội, tận tình hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học- Viện Kiểm nghiệm thuốc TW kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực- Trường Đại học Dược Hà Nội, cộng tác giúp đỡ suốt tành thực luận văn Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc- Viện Kiểm nghiệm thuốc TW tạo điều kiện cho tham gia chương trình đào tạo thạc sỹ Dược trường Đại học Dược Hà nội Tôi chân thành cảm ơn Ban giám hiệu thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho trau dồi kiến thức kinh nghiệm quí báu suốt trình học tập trường Tôi xin gửi lòi cảm ơn tới người thân gia đình, toàn thể bạn bè giúp đỡ động viên trình học tập nghiên cứuề Hà nội, ngày 10 tháng 10 năm 2011 Lê Thị Thu Huyền MUC LUC • • NỘIDUNG TRANG ĐẶT VẤN ĐỀ Phần TỔNG QUAN l ếl ế HOẠT CHẤT GLYCYL FUNTUMIN l ềl l ềCông thức cấu tạo 1.1.2 Tính chất hóa lý 1ề1.3ềTác dụng dược lý 1ề1.4ềChỉ định liều dùng 1.1.5 Tác dụng không mong muốn 1.1.6 Tình hình nghiên cứu hoạt chất GF l ế2 XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ DĐH TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM 1.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 1ề3.1ề Kỹ thuật xử lý mẫu 10 1ề3ề1.1 ề Kỹ thuật tủa protein 10 1.3.1.2 Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng 11 1.3.1.3 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE- solid phase extraction) 12 1.3.2 Kỹ thuật phân tích định lượng 13 l ề3.3ềThẩm định phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học 14 1.3.3.1 Độ chọn lọc 14 1.3.3.2 Giới hạn định lượng (LLOQ) 14 1.3.3.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 15 1ề3ề3.4ềĐộ đúng, độ xác ngày khác ngày 15 1.3.3.5 Tỷ lệ thu hồi 15 1.3.3.6 Nghiên cứu độ ổn định AN 16 l ế4ếHỆ THỐNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LOẠI TỨ c ự c 16 CHẬP BA 1.4.1 Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt (HESI) 1.4ề2 Bộ phận vận chuyển ion (ion transfer tube) 1.4ề3ềBộ phận thấu kính hội tụ (tube lense) 1.4.4 Bộ phận phân tích khối loại tứ cực chập ba 1.4.5 Bộ phận phát (detector) 1.4.6 Hệ thống bơm chân không PHẦN 2ế NGUYÊN VẬT LIỆU- ĐỐI TƯỢNG- NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN c ứ u 2ể2ếĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u 2.3ế NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 2ề3ề1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định GF chuẩn nội 2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 2.3.1.3 Khảo sát qui trình xử lý mẫu huyết tương 2.3.1.4 Nghiên cứu khảo sát biến thiên nồng độ GF huyết tương chó 2.3.2ềThẩm định phương pháp phân tích 2.3ề2.1 Thẩm định độ chọn lọc phương pháp 2.3.2.2 Xác định giới hạn định lượng (LLOQ) 2.3.2.3 Xây dựng đường chuẩn 2.3.2A Thẩm định độ đúng, độ xác ngày khác ngày 2.3.2.5 Xác định tỷ lệ thu hồi chuẩn chuẩn nội 2ề3ề2.6 Nghiên cứu độ ổn định GF 2.3.3 Xác định số thông số DĐH GF chó PHẦN 3ẽ KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u 3.1ẽ KÉT QUẢ XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.1.1 Xây dựng diều kiện khối phổ định lượng GF chuẩn nội 3.1.1.1.Tốiưuhóa điều kiện khối phổ định lượng GF 3.1 ề1.2 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 17 19 20 20 21 22 23 23 24 24 24 24 25 25 26 26 27 27 27 27 28 28 29 31 31 31 31 34 35 3.1.3 Xây dựng qui trình xử lý mẫu huyết tương 3.1ề4 Kết khảo sát biến thiên nồng độ GF huyết tương chó 3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.2.1 Độ chọn lọc phương pháp 3.2.2 Xác định giói hạn định lượng 3.2.3ềXây dựng đường chuẩn 3.2.4 Độ đúng- độ xác ngày khác ngày 3.2.5 Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất nội chuẩn 3.2.6 Nghiên cứu độ ổn định 3.2ề6ễ1 Độ ổn định nhiệt độ phòng thòi gian ngắn 3.2.6.2 Độ ổn định sau chu kỳ đông - rã đông 3ề2ề6.3 Độ ổn định mẫu sau xử lý (trong autosampler) 3.2.6.4 Độ ổn định dài ngày 3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ DĐH CỦA GF TRÊN CHÓ PHÀN BÀN LUẬN 4ểl ế Phương pháp phân tích định lượng GF huyết tương chó 4.1 ề1 Phương pháp xử lý mẫu 4.1.2 Phương pháp định lượng GF 65 4.2ằKết xác định thông sổ DĐH GF chó KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 KÉT LUẬN 68 xây dựng phương pháp phân tích thẩm định phương pháp phân tích Xác định thông số DĐH GF chó KIÉN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 37 41 43 45 47 48 50 52 53 54 54 55 56 57 64 64 64 66 68 68 69 69 DANH MỤC CHỮ VIÉT TẮT Chữ viêt tăt Giải thích AML Amlodipin besylat AN Chât phân tích ASEAN Hiệp hội nước Đông Nam A AUC Diện tích đường cong Autosampler Hệ thông tiêm mâu tự động cc Đường chuân C1 Hệ sô thải c'“'max Nông độ đỉnh cv Hệ sô biên thiên DĐH Dược động học DIL Diltiazem hydroclorid EMEA Cơ quan quản lý Dược Châu Au FDA-Mỹ Cơ quan quản lý thực dược phâm Mỹ GF Glycyl Funtumin HESI lon hóa kiêu phun điện tử có gia nhiệt HPLC Săc ký lỏng cao áp HQC Mâu kiêm tra nông độ cao IM Tiêm băp IS Chuân nội IV Tiêm tĩnh mạch LC-MS Săc ký lỏng khôi phô LC-MS/MS Săc ký lỏng khôi phô hai lân LLOQ Giới hạn định lượng LQC Mâu kiêm tra nông độ thâp MeCN Acetonitril MeOH Meứianol MQC Mâu kiêm tra nông độ m/z Khôi lượng/điện tích QC Mâu kiêm tra SAL Salbutamol sulphat SD Độ lệch chuân SPE Chiêt pha răn T Thời gian T Thời gian bán thải i /2 TB Trung bình Tm ax Thời gian đạt nông độ đỉnh Triple quadrupole Tứ cực chập ba vd Thê tích phân bô VKNTTW Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương v/v Thê tích/thê tích DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN TÊN BẢNG TRANG Bảng 3.1- Điều kiện khối phổ để định lượng GF IS 41 Bảng 3.2- Nồng độ GF (ng/mL) huyết tương chó sau 42 tiêm bắp tiêm tĩnh mạch với liều 0,6mg G F Bảng 3.3- Cách chuẩn bị dung dịch CC-W 44 Bảng 3.4- Cách chuẩn bị dung dịch QC-W 44 Bảng 3.5- Ảnh hưởng mẫu trắng thời điểm trùng thời 46 gian lưu GF Bảng 3.6- Ảnh hưởng mẫu trắng thời điểm trùng thời 46 gian lưu IS Bảng 3.7- Kết xác định giới hạn định lượng 47 Bảng 3.8- Kết khảo sát đường chuẩn 48 Bảng 3.9- Sự tương quan nồng độ GF huyết tương 49 tỷ lệ đáp ứng pic GF/IS Bảng 3.10- Kết khảo sát độ đúng, độ xác ngày 50 Bảng 3ểl l - Kết khảo sát độ đúng, độ xác khác ngày 51 Bảng 3.12- Kết xác định tỷ lệ thu hồi IS 52 Bảng 3.13- Kết xác định tỷ lệ thu hồi GF 53 Bảng 3Ể14- Độ ổn định nhiệt độ phòng 54 Bảng 3.15- Ket nghiên cứu độ ổn định GF mẫu 55 huyết tương sau chu kỳ đông - rã đông Bảng 3.16- Kết độ ổn định mẫu sau xử lý 56 autosampler Bảng 3.17- Kết độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương 57 Bảng 3.18- Nồng độ GF (ng/mL) huyết tương chó sau 60 tiêm băp liêu 0,6mg Bảng 3.19- Nồng độ GF (ng/mL) huyết tương chó sau tiêm tĩnh mạch liều 0,6mg Bảng 3.20- Một số thông số DĐH GF chó đường tiêm bắp tiêm tĩnh mạch với liều 0,6mg NL: 5.57 E IE ® TIC H 6 -P -K *6 -I* P - ậ !\ 50- i * ^ 100— NLĨ.57E4 ĩ 1c F: +c ESI s FSMrrư2 34 00 - 0.3 D.Ĩ5 1.28 1.18 2.25 2.81 J K [■MT.?Q*-14*.ĨQỘ] MS W-PKW-16P S.05 Ị[ so ­ ft H L ĩO K d TICF:i-cẼSI5ftMnug 3Ĩ5.0QÍ Í.ĨỄ â ' ■ â â ĩ ' 1 1 11 1 ẽ I I X TiiTẵ-L ifi.ir.j J V_63 i [120.500-121.500] MS W F K W -W ỉ 53 T Hình 3.13- Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó thời điểm 10 phút sau khỉ tiêm tĩnh mạch Kết từ hình cho thấy, pic GF IS mẫu huyết tương chố sau khỉ dùng thuốc cố hình dạng cân đổi, tách rõ ràng sắc ký đồ tổng ion Như vậy, phương pháp xây dựng phù hợp cho việc phân tích định lượng GF nghiên cứu Kết định lượng GF huyết tương chố sau khỉ dùng thuốc đường tiêm bắp tiêm tĩnh mạch trình bày bảng 3.18 3.19 đường cong trung bình nồng độ theo thời gian 06 chố đường tiêm tĩnh mạch tiêm bắp thể hình 3.14 71 Bảng 3.18- Nồng độ GF huyết tương chó sau khỉ tiêm bẳp liều 0,6mg Nông độ (ng/mL) Chó Chó Chó Chó Chó Chó 01 02 03 04 05 06 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,6 5,7 1,6 3,0 4,1 3,0 5,6 4,1 2,8 3,8 10 T(phút) TB SD 0,0 0ẳ0 0ề0 2,8 5,3 3.8 1.6 10,2 4,5 9,0 ếl 2.9 5,2 7,9 3,5 10,0 5ề6 2ề8 2,7 3,9 6,2 3,7 10,2 5ẻl 2Ẽ8 2,9 2,4 3,7 5,9 3,3 8,0 4ế4 2.2 15 3,2 2,2 3,2 4,5 2,3 6,2 3.6 1.5 20 2,3 2,3 3,0 4,7 2,1 5,8 3.4 1.5 30 2,0 1,8 2,0 3,2 2,3 3,8 ẻ5 0Ẽ8 45 1,5 1,8 1,9 3,1 1,6 2,9 ếl 0.7 60 1,2 1,1 1,7 2,7 1,2 2,5 l ề7 0.7 90 1,3 0,8 0,9 1,9 0,8 1,4 1.2 0.4 120 0,7 0,7 0,8 1,3 0,6 0,8 0ễ8 0.3 150 0,6 0,6 0,7 1,1 0,4* 0,5 0.7 0.2 180 0,6 0,6 0,6 0,9 0,3* 0,4* 0ế6 0.2 (*)Nồng độ ngoại suy nằm khoảng đường chuẩn có giá trị tham khảo 72 Bảng 3.19- Nồng độ GF huyầ tương chó sau tiêm tĩnh mạch liều 0,6mg T(phút) Nông độ (ng/mL) Chó Chó Chó Chó Chó Chó TB SD 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0.0 0.0 12,2 14,5 22,5 30,2 15,0 15,1 18.2 6.8 7,1 9,4 15,5 15,5 9,0 13,1 l l ề6 3.6 3,0 8,6 9,0 13,4 3,7 7,3 7.5 3.8 10 2,7 5,7 5,9 10,1 3,4 5,6 5.6 2ề6 12 2,5 5,6 4,0 6,2 2,8 4,1 4.2 1.5 15 2,6 4,1 2,6 4,7 2,8 4,1 3.5 0.9 20 1,7 3,4 1,9 3,2 2,4 3,5 2.7 0.8 30 1,9 2,1 1,4 2,5 2,5 2,7 2.2 0.5 45 1,3 2,3 1,2 1,9 2,3 2,3 1.9 0.5 60 0,8 1,9 1,0 1,5 2,1 1,5 1.5 0.5 90 0,8 1,3 0,8 0,9 1,4 1,0 l ề0 0.3 120 0,7 1,1 0,7 0,8 0,9 1,0 0.9 0.2 150 0,6 0,9 0,6 0,5 0,8 0,8 0.7 0.2 180 0,6 0,6 0,5 0,5 0,6 0,6 0.6 0.0 73 Đường cong trung bình nồng độ- thời gian (n=6) 20.0 tì 15.0 [...]... học Giới hạn phát hiện của hệ thống LC- MS- MS có thể đến 10'14 gam [8] Nhằm đáp ứng nhu cầu thực tiễn về nghiên cứu DĐH của GF và dựa trên điều kiện trang thiết bị hiện có tại Trung tâm Đánh giá Tương đương sinh học- VKNTTW, chúng tôi tiến hành đề tài Bước đầu nghiên cứu Dược động học của Glycyl Funtumin trên động vật thí nghiệm bằng LC- MS/ MS” với mục đích tạo cơ sở cho các nghiên cứu DĐH của GF trên. .. thuốc Nghiên cứu DĐH trên động vật thí nghiệm là bước ban đầu cho quá trình nghiên cứu DĐH của thuốc Các kết quả thực nghiệm trên động vật sẽ là định hướng tốt cho việc triển khai nghiên cứu DĐH trên người tình nguyện về thiết kế chế độ liều, bố trí lấy mẫuề và ý nghĩa hơn là có thể dự đoán các thông số DĐH trên người dựa trên mối tương quan về mặt giải phẫu, sinh lý, sinh hóa giữa người và động vật thí. .. người và động vật thí nghiệm Cũng như các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học của thuốc trên người, quá trình xác định các thông số DĐH của thuốc trên động vật thí nghiệm thường trải qua những bước sau[22]: s Bước 1: Chuẩn bị về mặt phương pháp: tiến hành xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích theo các hướng dẫn hiện hành, v' Bước 2: Thiết kế nghiên cứu, lựa chọn đối tượng... tài “ửng dụng LC- MS để khảo sát Dược động học của Glycyỉ Funtumin ở động vật th nghiệm [l 1] Đề tài đã đưa ra một số thông số: Cmax: 0,16|ig/mL, A U C 0_24già: l,245|ig.mL'1.giờ, Tmax: 12,25giờ sau khi tiêm bắp trên chó với liều 0,6mg Tuy nhiên, nghiên cứu mới dừng lại trên số lượng chó là 02 con và phương pháp định lượng cũng còn nhiều điểm hạn chế như: - Phương pháp được xây dựng dựa trên kỹ thuật... những nghiên cứu chuẩn mực hơn nhằm xây dựng phương pháp phân tích định lượng GF trong huyết tương chó có độ chọn lọc, độ tin cậy cao hơn và có thể ứng dụng cho các nghiên cứu DĐH của GF trên chó 1.2 XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ DĐH TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM Dược động học là khái niệm phản ánh số phận thuốc trong cơ thể Đó là quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hoá và thải trừ thuốc Các thông số DĐH cơ bản của một... khối của hệ thống khối phổ (Mass spectrometer- MS) [1] Kỹ thuật này được ứng dụng trong rất nhiều lĩnh vực khác nhau như: thực phẩm- đồ uống, môi trường, độc chất học, nghiên cứu phát triển các họp chất mới, nghiên cứu chuyển hóa, dược động học, sinh khả dụng, tương đương sinh học của các chế phẩm thuốc Để phù hợp vói những ứng dụng đó, người ta đã chế tạo ra một số hệ thống LC- MS có cấu tạo và hoạt động. .. tiêm miễn dịch Aslem (Glycyl Funtumin hydroclorid 0,3mg) đã ra đời Chế phẩm này được công ty cổ phần Dược phẩm Vĩnh Phúc sản xuất theo công nghệ chuyển giao của trường Đại học Dược Hà Nội Khi đó, để đáp ứng nhu càu điều trị, Cục quản lý Dược Việt nam đã cấp phép lưu hành cho Aslem (số đăng ký VD-0105-06), mặc dù chưa có đủ nghiên cứu về Dược động học (DĐH) của thuốcề Thông tin về DĐH của thuốc không chỉ... GF dưới dạng muối với hydrobromid (LH1) và thử tác dụng dược lý của hoạt chất này Sau đó, do thiếu nguồn nguyên liệu nên quá trình bán tổng hợp GF bị hạn chế và dừng lại[3]ề Như vậy, trên thế giới chưa có nhiều tác giả nghiên cứu về hoạt chất này đặc biệt là các nghiên cứu về Dược động học, các nghiên cứu về phương pháp định lượng trong dịch sinh học - Ở Viêt Nam: Năm 1973, Giáo sư Tôn Thất Tùng đã... khá khả quanề Chính vì vậy, chó được xem là loài động vật thích hợp nhất cho các nghiên cứu DĐH của thuốc v ề loại mẫu lấy, mẫu máu là phổ biến nhất trong các loại mẫu dịch sinh học như nước tiểu, nước bọt, dịch não tủy đặc biệt đối với các nghiên cứu trên động vật thí nghiệm Vì quá trình thao tác lấy mẫu dễ dàng, chủ động hơn và có thể lấy được lượng mẫu đủ cho phân tích định lượng Thông thường, mẫu... Muc tiêu cu• thể của đề tài là: • 1 Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng GF trong huyết tương chó bằng kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ hai lần LC- MS/ MS 2 Áp dụng phương pháp đã xây dựng để xác định một số thông số Dược động học của GF trên chó sau khi dùng liều đơn ở đường tiêm bắp, tiêm tĩnh mạch và sinh khả dụng tuyệt đối đường tiêm bắp 14 Phần l ế TÔNG QUAN 1.1 HOẠT CHẤT GLYCYL FUNTUMIN l ếl ... đương sinh học- VKNTTW, tiến hành đề tài Bước đầu nghiên cứu Dược động học Glycyl Funtumin động vật thí nghiệm LC- MS/ MS” với mục đích tạo sở cho nghiên cứu DĐH GF người tình nguyện Muc tiêu cu•... NGHIÊN c ứ u Dược ĐỘNG HỌC • • • CỦA GLYCYL FUNTUMIN TRÊN ĐỘNG VẬT THI NGHIỆM BẰNG LC- MS/ MS LUÂN VĂN THAC s ĩ • • Dươc HOC • • KIÊM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 607315 Người hướng dẫn khoa học: ... người động vật thí nghiệm Cũng nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng tương đương sinh học thuốc người, trình xác định thông số DĐH thuốc động vật thí nghiệm thường trải qua bước sau[22]: s Bước 1: