Bước đầu nghiên cứu dược động học của glycyl funtumin trên động vật thí nghiệm bằng LC MSMS

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DS LÊ THỊ THU HUYỀN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA GLYCYL FUNTUMIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM BẰNG LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI, NĂM 2011 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DS LÊ THỊ THU HUYỀN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA GLYCYL FUNTUMIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM BẰNG LC-MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC CHẤT MÃ SỐ: 607315 Người hướng dẫn khoa học: TS.Phùng Thị Vinh HÀ NỘI, NĂM 2011 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới TS Phùng Thị Vinh, Ths Tạ Mạnh Hùng- Trung tâm đánh giá Tương đương sinh họcViện Kiểm nghiệm thuốc TW TS Nguyễn Hồng Anh- Bộ mơn Dược lực- Trường Đại học Dược Hà Nội, tận tình hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn toàn thể cán Trung tâm đánh giá Tương đương sinh học- Viện Kiểm nghiệm thuốc TW kỹ thuật viên Bộ môn Dược lực- Trường Đại học Dược Hà Nội, cộng tác giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin cảm ơn Ban giám đốc- Viện Kiểm nghiệm thuốc TW tạo điều kiện cho tham gia chương trình đào tạo thạc sỹ Dược trường Đại học Dược Hà nội Tôi chân thành cảm ơn Ban giám hiệu thầy cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện cho trau dồi kiến thức kinh nghiệm q báu suốt q trình học tập trường Tôi xin gửi lời cảm ơn tới người thân gia đình, tồn thể bạn bè ln giúp đỡ động viên tơi q trình học tập nghiên cứu Hà nội, ngày 10 tháng 10 năm 2011 Lê Thị Thu Huyền MỤC LỤC NỘI DUNG ĐẶT VẤN ĐỀ Phần TỔNG QUAN 1.1 HOẠT CHẤT GLYCYL FUNTUMIN 1.1.1 Cơng thức cấu tạo 1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.3 Tác dụng dược lý TRANG 3 3 1.1.4 Chỉ định liều dùng 1.1.5 Tác dụng khơng mong muốn 1.1.6 Tình hình nghiên cứu hoạt chất GF 1.2 XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ DĐH TRÊN ĐỘNG VẬT 4 THÍ NGHIỆM 1.3 PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THUỐC TRONG DỊCH SINH HỌC 1.3.1 Kỹ thuật xử lý mẫu 1.3.1.1 Kỹ thuật tủa protein 10 10 1.3.1.2 Kỹ thuật chiết lỏng- lỏng 1.3.1.3 Kỹ thuật chiết pha rắn (SPE- solid phase extraction) 1.3.2 Kỹ thuật phân tích định lượng 1.3.3 Thẩm định phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học 1.3.3.1 Độ chọn lọc 1.3.3.2 Giới hạn định lượng (LLOQ) 1.3.3.3 Đường chuẩn khoảng tuyến tính 1.3.3.4 Độ đúng, độ xác ngày khác ngày 1.3.3.5 Tỷ lệ thu hồi 1.3.3.6 Nghiên cứu độ ổn định AN 1.4 HỆ THỐNG SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LOẠI TỨ CỰC 11 12 13 14 14 14 15 15 15 16 16 CHẬP BA 1.4.1 Nguồn ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt (HESI) 1.4.2 Bộ phận vận chuyển ion (ion transfer tube) 1.4.3 Bộ phận thấu kính hội tụ (tube lense) 1.4.4 Bộ phận phân tích khối loại tứ cực chập ba 1.4.5 Bộ phận phát (detector) 1.4.6 Hệ thống bơm chân không PHẦN NGUYÊN VẬT LIỆU- ĐỐI TƯỢNG- NỘI DUNG 17 19 20 20 21 22 23 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN CỨU 23 2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Xây dựng phương pháp phân tích 24 24 24 2.3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ xác định GF chuẩn nội 2.3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 24 25 2.3.1.3 Khảo sát qui trình xử lý mẫu huyết tương 2.3.1.4 Nghiên cứu khảo sát biến thiên nồng độ GF huyết tương chó 2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích 2.3.2.1 Thẩm định độ chọn lọc phương pháp 2.3.2.2 Xác định giới hạn định lượng (LLOQ) 2.3.2.3 Xây dựng đường chuẩn 2.3.2.4 Thẩm định độ đúng, độ xác ngày khác ngày 25 26 2.3.2.5 Xác định tỷ lệ thu hồi chuẩn chuẩn nội 2.3.2.6 Nghiên cứu độ ổn định GF 2.3.3 Xác định số thơng số DĐH GF chó PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 KẾT QUẢ XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 26 27 27 27 27 28 28 29 31 31 3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ định lượng GF chuẩn nội 3.1.1.1 Tối ưu hóa điều kiện khối phổ định lượng GF 31 31 3.1.1.2 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội 3.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký 34 35 3.1.3 Xây dựng qui trình xử lý mẫu huyết tương 3.1.4 Kết khảo sát biến thiên nồng độ GF huyết tương chó 3.2 KẾT QUẢ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH 3.2.1 Độ chọn lọc phương pháp 3.2.2 Xác định giới hạn định lượng 3.2.3 Xây dựng đường chuẩn 37 41 43 45 47 48 3.2.4 Độ đúng- độ xác ngày khác ngày 3.2.5 Xác định tỷ lệ thu hồi hoạt chất nội chuẩn 50 52 3.2.6 Nghiên cứu độ ổn định 3.2.6.1 Độ ổn định nhiệt độ phòng thời gian ngắn 3.2.6.2 Độ ổn định sau chu kỳ đông – rã đông 53 54 54 3.2.6.3 Độ ổn định mẫu sau xử lý (trong autosampler) 3.2.6.4 Độ ổn định dài ngày 3.3 KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH THÔNG SỐ DĐH CỦA GF TRÊN CHÓ PHẦN BÀN LUẬN 4.1 Phương pháp phân tích định lượng GF huyết tương chó 4.1.1 Phương pháp xử lý mẫu 65 4.1.2 Phương pháp định lượng GF 4.2 Kết xác định thông số DĐH GF chó KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 68 55 56 57 64 64 64 66 68 KẾT LUẬN Về xây dựng phương pháp phân tích 68 Về thẩm định phương pháp phân tích Xác định thơng số DĐH GF chó KIẾN NGHỊ 68 69 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Giải thích AML Amlodipin besylat AN Chất phân tích ASEAN Hiệp hội nước Đơng Nam Á AUC Diện tích đường cong Autosampler Hệ thống tiêm mẫu tự động CC Đường chuẩn Cl Hệ số thải Cmax Nồng độ đỉnh CV Hệ số biến thiên DĐH Dược động học DIL Diltiazem hydroclorid EMEA Cơ quan quản lý Dược Châu Âu FDA-Mỹ Cơ quan quản lý thực dược phẩm Mỹ GF Glycyl Funtumin HESI Ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt HPLC Sắc ký lỏng cao áp HQC Mẫu kiểm tra nồng độ cao IM Tiêm bắp IS Chuẩn nội IV Tiêm tĩnh mạch LC-MS Sắc ký lỏng khối phổ LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần LLOQ Giới hạn định lượng LQC Mẫu kiểm tra nồng độ thấp MeCN Acetonitril MeOH Methanol MQC Mẫu kiểm tra nồng độ m/z Khối lượng/điện tích QC Mẫu kiểm tra SAL Salbutamol sulphat SD Độ lệch chuẩn SPE Chiết pha rắn T Thời gian T1/2 Thời gian bán thải TB Trung bình Tmax Thời gian đạt nồng độ đỉnh Triple quadrupole Tứ cực chập ba Vd Thể tích phân bồ VKNTTW Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương v/v Thể tích/thể tích DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG LUẬN VĂN TÊN BẢNG TRANG Bảng 3.1- Điều kiện khối phổ để định lượng GF IS 41 Bảng 3.2- Nồng độ GF (ng/mL) huyết tương chó sau 42 tiêm bắp tiêm tĩnh mạch với liều 0,6mg GF Bảng 3.3- Cách chuẩn bị dung dịch CC-W 44 Bảng 3.4- Cách chuẩn bị dung dịch QC-W 44 Bảng 3.5- Ảnh hưởng mẫu trắng thời điểm trùng thời 46 gian lưu GF Bảng 3.6- Ảnh hưởng mẫu trắng thời điểm trùng thời 46 gian lưu IS Bảng 3.7- Kết xác định giới hạn định lượng 47 Bảng 3.8- Kết khảo sát đường chuẩn 48 Bảng 3.9- Sự tương quan nồng độ GF huyết tương 49 tỷ lệ đáp ứng pic GF/IS Bảng 3.10- Kết khảo sát độ đúng, độ xác ngày 50 Bảng 3.11- Kết khảo sát độ đúng, độ xác khác ngày 51 Bảng 3.12- Kết xác định tỷ lệ thu hồi IS 52 Bảng 3.13- Kết xác định tỷ lệ thu hồi GF 53 Bảng 3.14- Độ ổn định nhiệt độ phòng 54 Bảng 3.15- Kết nghiên cứu độ ổn định GF mẫu 55 huyết tương sau chu kỳ đông – rã đông Bảng 3.16- Kết độ ổn định mẫu sau xử lý 56 autosampler Bảng 3.17- Kết độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương 57 Bảng 3.18- Nồng độ GF (ng/mL) huyết tương chó sau 60 tiêm bắp liều 0,6mg Bảng 3.19- Nồng độ GF (ng/mL) huyết tương chó sau 61 tiêm tĩnh mạch liều 0,6mg Bảng 3.20- Một số thơng số DĐH GF chó đường tiêm bắp tiêm tĩnh mạch với liều 0,6mg 10 63 Hình 3.13- Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó thời điểm 10 phút sau tiêm tĩnh mạch Kết từ hình cho thấy, pic GF IS mẫu huyết tương chó sau dùng thuốc có hình dạng cân đối, tách rõ ràng sắc ký đồ tổng ion Như vậy, phương pháp xây dựng phù hợp cho việc phân tích định lượng GF nghiên cứu Kết định lượng GF huyết tương chó sau dùng thuốc đường tiêm bắp tiêm tĩnh mạch trình bày bảng 3.18 3.19 đường cong trung bình nồng độ theo thời gian 06 chó đường tiêm tĩnh mạch tiêm bắp thể hình 3.14 71 Bảng 3.18- Nồng độ GF huyết tương chó sau tiêm bắp liều 0,6mg Nồng độ (ng/mL) T(phút) Chó Chó Chó Chó Chó Chó 01 02 03 04 05 06 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 4,6 5,7 1,6 3,0 4,1 3,0 5,6 4,1 2,8 3,8 10 TB SD 0,0 0.0 0.0 2,8 5,3 3.8 1.6 10,2 4,5 9,0 6.1 2.9 5,2 7,9 3,5 10,0 5.6 2.8 2,7 3,9 6,2 3,7 10,2 5.1 2.8 2,9 2,4 3,7 5,9 3,3 8,0 4.4 2.2 15 3,2 2,2 3,2 4,5 2,3 6,2 3.6 1.5 20 2,3 2,3 3,0 4,7 2,1 5,8 3.4 1.5 30 2,0 1,8 2,0 3,2 2,3 3,8 2.5 0.8 45 1,5 1,8 1,9 3,1 1,6 2,9 2.1 0.7 60 1,2 1,1 1,7 2,7 1,2 2,5 1.7 0.7 90 1,3 0,8 0,9 1,9 0,8 1,4 1.2 0.4 120 0,7 0,7 0,8 1,3 0,6 0,8 0.8 0.3 150 0,6 0,6 0,7 1,1 0,4* 0,5 0.7 0.2 180 0,6 0,6 0,6 0,9 0,3* 0,4* 0.6 0.2 (*)Nồng độ ngoại suy nằm ngồi khoảng đường chuẩn có giá trị tham khảo 72 Bảng 3.19- Nồng độ GF huyết tương chó sau tiêm tĩnh mạch liều 0,6mg T(phút) Nồng độ (ng/mL) Chó Chó Chó Chó Chó Chó TB SD 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0.0 0.0 12,2 14,5 22,5 30,2 15,0 15,1 18.2 6.8 7,1 9,4 15,5 15,5 9,0 13,1 11.6 3.6 3,0 8,6 9,0 13,4 3,7 7,3 7.5 3.8 10 2,7 5,7 5,9 10,1 3,4 5,6 5.6 2.6 12 2,5 5,6 4,0 6,2 2,8 4,1 4.2 1.5 15 2,6 4,1 2,6 4,7 2,8 4,1 3.5 0.9 20 1,7 3,4 1,9 3,2 2,4 3,5 2.7 0.8 30 1,9 2,1 1,4 2,5 2,5 2,7 2.2 0.5 45 1,3 2,3 1,2 1,9 2,3 2,3 1.9 0.5 60 0,8 1,9 1,0 1,5 2,1 1,5 1.5 0.5 90 0,8 1,3 0,8 0,9 1,4 1,0 1.0 0.3 120 0,7 1,1 0,7 0,8 0,9 1,0 0.9 0.2 150 0,6 0,9 0,6 0,5 0,8 0,8 0.7 0.2 180 0,6 0,6 0,5 0,5 0,6 0,6 0.6 0.0 73 Nồng độ (ng/mL) Đường cong trung bình nồng độ- thời gian (n=6) 20.0 Tiêm bắp Tiêm tĩnh mạch 15.0 10.0 5.0 0.0 30 60 90 120 150 180 Thời gian (phút) Hình 3.14- Đường cong trung bình nồng độ- thời gian 06 chó đường tiêm tĩnh mạch tiêm bắp Kết định lượng bảng 3.18 3.19 cho thấy, hầu hết mẫu có nồng độ GF giới hạn định lượng Nồng độ trung bình mẫu lấy thời điểm 180 phút sau tiêm bắp tiêm tĩnh mạch liều 0,6mg GF 0,6ng/mL (lớn hớn giá trị LLOQ 0,5ng/mL) Giá trị Cmax nhỏ nồng độ cao đường chuẩn nên tiến hành pha lỗng mẫu q trình định lượng Như vậy, khoảng tuyến tính xây dựng phù hợp nghiên cứu Từ kết thực nghiệm thu được, tiến hành xác định thông số DĐH GF phần mềm Excel 2007 Kết trình bày bảng 3.20 74 Bảng 3.20- Một số thơng số DĐH GF chó đường tiêm bắp tiêm tĩnh mạch với liều 0,6mg Tiêm bắp Tiêm tĩnh mạch Chó Cmax Tmax AUC0-180 phút Cmax Tmax AUC0-180 phút (ng/mL) (phút) (ng/mL*phút) (ng/mL) (phút) (ng/mL*phút) 4,6 236,9 12,2 216,8 5,7 213,6 14,5 355,1 5,6 257,0 22,5 275,5 10,2 423,3 30,2 374,5 4,5 179,4 15,0 317,1 10,0 394,0 15,1 338,8 TB 6,8 284,0 18,2 313,0 CV(%) 38,6 41,1 35,3 37,3 18,6 Kết bảng 3.20 hình 3.14 cho thấy: + Sau tiêm bắp, GF hấp thu nhanh chóng vào hệ tuần hoàn chung (thời gian đạt nồng độ đỉnh trung bình phút) sau thời điểm Tmax nồng độ GF giảm từ từ đến thời điểm 180 phút + Sau tiêm tĩnh mạch, thuốc vào thẳng hệ tuần hoàn chung đạt nồng độ đỉnh Trong khoảng 15 phút đầu, nồng độ thuốc huyết tương giảm nhanh sau giảm từ từ đến thời điểm 180 phút So sánh giá trị AUC0-180 phút trung bình đường tiêm bắp tiêm tĩnh mạch cho thấy, sinh khả dụng tuyệt đối đường tiêm bắp GF chó 90,8% Như vậy, GF hấp thu gần hồn tồn sau tiêm bắp chó Những kết nghiên cứu ban đầu có tính chất định hướng cho nghiên cứu DĐH GF người tình nguyện 75 PHẦN BÀN LUẬN Hoạt chất GF nghiên cứu tổng hợp từ lâu chưa có nghiên cứu thực đầy đủ xây dựng phương pháp định lượng nồng độ GF dịch sinh học nói chung huyết tương nói riêng Vì q trình thực nghiên cứu này, chúng tơi gặp nhiều khó khăn có tài liệu tham khảo Vận dụng hiểu biết cấu trúc hóa học, tính chất hóa lý hoạt chất GF, lý thuyết đặc biệt kinh nghiệm thực tiễn xử lý mẫu dịch sinh học phân tích mẫu hệ thống LC-MS/MS, chúng tơi xây dựng phương pháp phân tích định lượng GF huyết tương chó dựa kỹ thuật LC-MS/MS Phương pháp thẩm định đầy đủ đạt yêu cầu phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học theo hướng dẫn hành FDA- Mỹ Kết áp dụng phương pháp nghiên cứu DĐH GF cho thấy phương pháp xây dựng phù hợp có tính khả thi Từ q trình thực nghiệm chúng tơi có số bàn luận sau: 4.1 Phương pháp phân tích định lượng GF huyết tương chó 4.1.1 Phương pháp xử lý mẫu: Như trình bày phần tổng quan, mẫu huyết tương phức tạp nên đưa thẳng vào hệ thống phân tích Việc xây dựng qui trình xử lý mẫu cho tỷ lệ thu hồi cao ổn định đóng vai trò quan trọng GF hoạt chất tổng hợp dạng muối với acid hydrocloric nên có tính acid dễ tan nước Khi chuyển sang dạng base GF dễ tan dung môi hữu cloroform, diethy ether Vì vậy, chúng tơi áp dụng kỹ thuật kiềm hóa mẫu huyết tương dung dịch 76 amoniac 0,1M trước tiến hành chiết lỏng- lỏng Sau trình khảo sát xác định hỗn hợp dung mơi chiết thích hợp diethyl ether : cloroform (7/3, v/v) Với qui trình xử lý mẫu xây dựng, tỷ lệ thu hồi GF cao ổn định (xấp xỉ 90% ba khoảng nồng độ thấp, trung bình cao) Ngồi ra, thời gian bay dung môi tương đối ngắn (khoảng 3-5 phút) phù hợp cho việc xử lý hàng loạt mẫu ngày phân tích 4.1.2 Phương pháp định lượng GF: Trước có số phương pháp định lượng GF xây dựng như: phương pháp cực phổ sóng vuông [5], đo quang, sắc ký lỏng cao áp với detector PDA (đính kèm phụ lục) Các phương pháp phù hợp để định lượng GF dạng nguyên liệu chế phẩm thuốc Để định lượng GF mẫu huyết tương (có nồng độ GF thấp) cần phải sử dụng phương pháp có độ nhạy cao Năm 2005, tác giả Phạm Như Quỳnh xây dựng phương pháp định lượng GF huyết tương chó dựa kỹ thuật sắc ký lỏng khối phổ lần [11] nên phương pháp hạn chế độ nhạy độ chọn lọc Để khắc phục điều này, tiến hành xây dựng phương pháp định lượng GF dựa kỹ thuật LC-MS/MS sử dụng nguồn ion hóa kiểu phun điện tử có gia nhiệt phận phân tích khối loại tứ cực chập ba hãng Thermo Scientific Phương pháp thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn FDA- Mỹ thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học Kết thẩm định cho thấy, phương pháp xây dựng có độ chọn lọc cao với GF; có giới hạn định lượng thấp (0,5ng/mL); khoảng nồng độ tuyến tính rộng (0,5 – 53,3ng/mL); độ cao (giá trị trung bình từ 95,0% đến 106,6%); độ lặp lại tốt với giá trị CV nhỏ (dưới 10%); tỷ lệ thu hồi hoạt chất cao ổn định (xấp xỉ 90% ba khoảng nồng độ), đạt yêu cầu phương pháp phân tích dịch sinh học theo FDA- Mỹ Với thời gian phân 77 tích mẫu khoảng 7,5 phút, phương pháp tương đối phù hợp việc định lượng nhiều mẫu ngày Ngoài ra, kết áp dụng phương pháp nghiên cứu DĐH GF chó cho thấy khoảng tuyến tính xây dựng phù hợp (các mẫu thử có nồng độ GF nằm khoảng tuyến tính xây dựng) 4.2 Kết xác định thông số DĐH GF chó Q trình xác định thơng số DĐH GF chó trải qua hai giai đoạn, nghiên cứu khảo sát (phần 3.1.4) nghiên cứu thức (phần 3.3) Từ kết nghiên cứu khảo sát 02 chó, chúng tơi chứng minh phù hợp phương pháp phân tích xây dựng, đồng thời xác định khoảng đường chuẩn phương pháp phân tích (0,5 – 50ng/mL) chương trình lấy mẫu phù hợp cho nghiên cứu thức Nghiên cứu thức thực 06 chó với liều 0,6mg GF đường tiêm bắp tiêm tĩnh mạch Giá trị Cmax, AUC0-180 phút trung bình đường tiêm bắp tương ứng là: 6,8 ng/mL; 284,0 ng.mL-1.phút; đường tiêm tĩnh mạch tương ứng là: 18,2 ng/mL; 313,0 ng.mL-1.phút Kết cho thấy: sau tiêm bắp, thuốc hấp thu nhanh vào tuần hoàn chung (thời gian đạt nồng độ đỉnh trung bình khoảng phút) có sinh khả dụng tương đối cao (trung bình 90,8%) Trong khóa luận tốt nghiệp [11], tác giả Phạm Như Quỳnh công bố số thông số DĐH GF đường tiêm bắp liều 0,6mg, giá trị Tmax 12,25giờ, Cmax 0,16µg/mL, AUC0-24giờ 1,245µg.mL-1.giờ Như phân tích (phần 1.1.6), tác giả thực nghiên cứu qui mô nhỏ (02 chó) phương pháp phân tích xây dựng để áp dụng nghiên cứu DĐH GF chưa thẩm định đầy đủ để khẳng định độ tin cậy nên thông số mà tác giả đưa có tính chất tham khảo Trong đề tài thực nghiên cứu DĐH GF 06 chó, kết thu có 78 độ tin cậy nhờ phương pháp phân tích thẩm định đầy đủ đạt yêu cầu theo hướng dẫn hành thẩm định phương pháp phân tích dịch sinh học Những kết nghiên cứu ban đầu mở hướng cho việc tiếp tục thực nghiên cứu sâu hơn- nghiên cứu DĐH GF người Thực tế áp dụng kết đề tài (phương pháp phân tích, chương trình lấy mẫu) nghiên cứu DĐH GF người tình nguyện thu số kết khả quan (đã xác định số thông số DĐH GF người, xác định mơ hình DĐH GF người mơ hình động học hai ngăn ) 79 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau trình thực nghiệm, rút số kết luận sau: Về xây dựng phương pháp phân tích - Đã xây dựng điều kiện phân tích định lượng GF huyết tương chó LC-MS/MS sau: + Chất chuẩn nội: Salbutamol sulphat; + Điều kiện sắc ký: Cột Luna CN 150 x 4,6 mm, 5,0 µm; nhiệt độ cột 50oC; pha động: MeOH- acid formic 0,5% 60:40 (v/v); gradient tốc độ dòng; thể tích tiêm mẫu: 25µL; + Điều kiện khối phổ: Kiểu phổ khối: MS/MS, nguồn ion hóa HESI (+), phân mảnh 32V với GF 18V với SAL - Đã xây dựng quy trình chiết tách GF từ huyết tương chó phương pháp chiết lỏng – lỏng sử dụng hỗn hợp dung môi diethyl ether – cloroform (7/3, v/v), sau kiềm hóa dung dịch amoniac 0,1M Về thẩm định phương pháp phân tích Đã tiến hành thẩm định đầy đủ theo hướng dẫn FDA- Mỹ thẩm định phương pháp phân tích thuốc dịch sinh học Kết thẩm định cho thấy phương pháp xây dựng chọn lọc với GF, có giới hạn định lượng nhỏ (0,5 ng/mL), khoảng nồng độ tuyến tính rộng (0,5 – 53,3ng/mL), độ cao (giá trị trung bình từ 95,0% đến 106,6%), độ lặp lại tốt với giá trị CV% nhỏ (dưới 10%), tỷ lệ thu hồi hoạt chất cao ổn định (xấp xỉ 90% ba khoảng nồng độ) GF ổn định điều kiện bảo quản khác (4 nhiệt độ phòng, autosampler, sau vòng đơng- rã đơng 30 ngày nhiệt độ -400C) 80 Xác định thông số DĐH GF chó Đã xác định số thơng số DĐH GF 06 chó với liều 0,6mg thuốc tiêm Aslem đường tiêm bắp tiêm tĩnh mạch Kết sau: + Đối với đường tiêm bắp, giá trị Cmax, Tmax, AUC0-180 phút trung bình 06 chó tương ứng 6,8ng/mL; phút; 284,0ng/mL*phút; + Đối với đường tiêm tĩnh mạch, giá trị Cmax, Tmax, AUC0-180 phút trung bình 06 chó tương ứng 18,2 ng/mL; phút; 313,0ng/mL*phút; + Sinh khả dụng tuyệt đối đường tiêm bắp: F = 90,8% Như vậy, kết nghiên cứu đáp ứng mục tiêu đề tài, xây dựng thẩm định phương pháp định lượng GF huyết tương chó dựa thiết bị LC-MS/MS xác định số thông số DĐH GF chó với liều 0,6mg đường tiêm bắp tiêm tĩnh mạch KIẾN NGHỊ Từ kết nghiên cứu thu được, chúng tơi có số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu phát triển phương pháp định lượng GF huyết tương người để áp dụng cho nghiên cứu DĐH GF người tình nguyện; - Thực nghiên cứu DĐH GF người tình nguyện để sớm hồn thiện hồ sơ đăng ký thuốc cho chế phẩm Aslem cung cấp thêm thơng tin hữu ích cho bác sĩ lâm sàng việc hướng dẫn sử dụng thuốc 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO I TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Trần Tử An cộng (2007), Hố phân tích, Nhà xuất Y học, tập 2, 107-121, 295-318 Đào Kim Chi (1984), Tổng hợp số peptidyl funtumin thăm dò tác dụng kích thích miễn dịch khơng đặc hiệu chúng, Luận án phó tiến sĩ Dược học, trường Đại học Dược Hà Nội Đào Kim Chi cộng (2005), Hoàn thiện qui trình sản xuất thuốc tiêm Aslem điều hồ miễn dịch, Báo cáo tổng kết khoa học kỹ thuật dự án KC10-DA13 Đào Văn Đôn (2010), Nghiên cứu định lượng Trimetazidin huyết tương người sắc ký lỏng- khối phổ, Luận văn thạc sỹ dược học, Học viện Quân Y Nguyễn Trọng Giao, Đào Kim Chi (1995), Nghiên cứu áp dụng phương pháp cực phổ sóng vng để định lượng khảo sát tuổi thọ chế phẩm Aslem, Thông báo khoa học, trường Đại học Dược Hà Nội Bùi Thu Huê (2010), Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Diltiazem huyết tương người LC-MS, Luận văn thạc sỹ Dược học, trường Đại học Dược Hà Nội Tạ Mạnh Hùng, Lê Thị Thu Huyền cộng (2010), Nghiên cứu xây dựng thẩm định phương pháp định lượng Glycyl Funtumin huyết tương chó LC-MS, Tạp chí Dược học số 4/2010 Tạ Mạnh Hùng, Lê Thị Thu Huyền cộng (2011), Bước đầu nghiên cứu Dược động học Glycyl Funtumin chó, Tạp chí Kiểm nghiệm thuốc số 02/2011 82 Nguyễn Xuân Hùng, Đỗ Đức Vân cộng (2008), Nghiên cứu đánh giá tác dụng phác đồ Fufol+Aslem điều trị bổ trợ ung thư đại trực tràng, Báo cáo kết nghiên cứu đề tài Khoa học công nghệ cấp Bộ Y tế 10 Trịnh Văn Lẩu, Phùng Thị Vinh cộng (2008), Nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng tương đương sinh học chế phẩm sản xuất nước, góp phần hồn thiện hướng dẫn thử BA/BE, Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ Y tế 11 Phạm Như Quỳnh (2005), Ứng dụng LC-MS để khảo sát Dược động học Glycyl Funtumin động vật thí nghiệm, Khố luận tốt nghiệp Dược sĩ đại học, trường Đại học Dược Hà Nội 12 Phùng Thị Vinh cộng (2005), Nghiên cứu phương pháp chiết xuất định lượng Norfloxacin dịch sinh học, Báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ Y tế II TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 13 Chinese Pharmacopoeia Commission, The pharmacopoeia of the People’s Republic of China (2005), Guidances invivo bioavailability and bioequivalence studies for drug preparations, Volume II, Appendix XXB, A.207-A.210 14 Food and Drug administration- United states (2001), Guidance for industry- Bioanalytical method validation 15 Francis L.S.Tse, James M.Jaffe (1991), Preclinical drug disposition: A laboratory handbook, Marcel Dekker, JNC 16 Joseph T.Dipiro (2010), Concepts in clinical pharmacokinetics, fifth edition 17 K.Zech and R.W.Frei, Selective sample handling and detection in highperformance liquid chromatography, Elservier science publishing company INC 83 18 Riley C.M, Rosanske T.W (1996), Development and Validation of Analytical Methods, Elsevier Science Ltd., 3-99, 249-282 19 Singapore Health Sciences Authority (2003), Asean guidances for the conduct of Bioavailability and Bioequivalent studies, final Draft http://www.hsa.gov.sg/docs/Guidelinesfortheconductorofbioavailabilityandbi oequivalencestudies-adaptedfromASEANGuidelines-July07.pdf 20 Sonu Sundd Singh (2006), Preclinical Pharmacokinetics: An approach towards safer and efficacious drugs, Current drug metabolism, 7, 165-182 21 The European medicines agency (2011), Guideline on bioanalytical method validation 22 The European medicines agency, Committee for Veterinary medicinal products (2000), Guidelines for conduct of pharmacokinetic studies in target animals species 23 The United states pharmacopoeia 30 (2007), Invitro and invivo evaluation of dosage forms; Invivo bioequivalence guidelines, Volume I, , 680-683 24 W.A.Ritschel (1987), Invivo animal models for bioavailability assessment, STP Pharma, p.125-141 84 PHỤ LỤC - Dẫn chứng báo Tạp chí Dược học số 416/2010 - Dẫn chứng báo Tạp chí Kiểm nghiệm số 2/2011 - Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng - Sắc ký đồ mẫu huyết tương chứa chuẩn GF IS - Sắc ký đồ mẫu huyết tương chó trước sau dùng thuốc -Tiêu chuẩn sở nguyên liệu Glycyl Funtumin thuốc tiêm Aslem 85 ... Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI DS LÊ THỊ THU HUYỀN BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA GLYCYL FUNTUMIN TRÊN ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM BẰNG LC- MS/MS LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC KIỂM NGHIỆM THUỐC- ĐỘC... đương sinh học- VKNTTW, tiến hành đề tài Bước đầu nghiên cứu Dược động học Glycyl Funtumin động vật thí nghiệm LC- MS/MS” với mục đích tạo sở cho nghiên cứu DĐH GF người tình nguyện Mục tiêu cụ... người động vật thí nghiệm Cũng nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng tương đương sinh học thuốc người, q trình xác định thơng số DĐH thuốc động vật thí nghiệm thường trải qua bước sau[22]: Bước 1: