Nghiên cứu một số chất bảo vệ ở hạt đậu côve (phaseolus vulgaris l ) (KL06712)

Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu phản ứng cũng như ảnh hưởng của muối NaCl tới quá trình sinh trưởng và phát triển của đậu côve trong các điều kiện môi trường có dung dịch muối NaCl với

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

KHOA SINH – KTNN

***********

KHỔNG THỊ MAI

NGHIÊN CỨU MỘT SỐ CHẤT BẢO VỆ

Ở HẠT ĐẬU CÔVE (Phaseolus vulgaris L.)

NẢY MẦM TRONG ĐIỀU KIỆN STRESS MUỐI

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS NGUYỄN VĂN MÃ

HÀ NỘI - 2014

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành bản khóa luận này, em xin bày tỏ lòng biết ơn, sự kính

trọng sâu sắc tới thầy giáo PGS TS Nguyễn Văn Mã đã tận tình hướng dẫn

và giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô và tập thể cán bộ trong Khoa Sinh - KTNN và Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ - Trường ĐHSP Hà Nội 2 đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em thực hiện đề tài này

Lần đầu làm quen với việc nghiên cứu khoa học, đề tài của em không tránh khỏi những thiếu sót Rất mong nhận được sự chỉ bảo, đóng góp ý kiến của các thầy cô và các bạn sinh viên để đề tài của em được hoàn thiện hơn

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Khổng Thị Mai

LỜI CAM ĐOAN

Tôi đã thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sự hình thành một số chất bảo

vệ ở hạt đậu cô ve (Phaseolus vulgaris L.) nảy mầm trong điều kiện stress

muối”

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Kết quả nghiên cứu của đề tài này đảm bảo tính chính xác, khách quan, trung thực, không trùng lặp với các tác giả khác

Hà Nội, tháng 5 năm 2014

Sinh viên

Khổng Thị Mai

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

cDNA : Complementary DNA (DNA bổ sung)

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1 Các bước chính của quá trình định lượng prolin tự do bằng phương pháp so màu

Hình 2 Biểu đồ biểu diễn đường chuẩn proline

Hình 3 Đường đồ thị chuẩn glucozơ

Hình 4 Khả năng nảy mầm của hạt đậu côve trong dung dịch NaCl nồng độ khác nhau

Hình 5 Hàm lượng prolin ở hạt đậu côve nảy mầm trong điều kiện stress muối NaCl

Hình 6 Hàm lượng đường khử ở hạt đậu côve nảy mầm trong điều kiện stress muối NaCl

Hình 7 Hàm lượng glycin betain ở hạt đậu côve nảy mầm trong điều kiện stress muối NaCl

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 1

1 Lí do chọn đề tài 1

2 Mục đích nghiên cứu 3

3 Ý nghĩa lí luận - thực tiễn 3

NỘI DUNG 4

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Quá trình nảy mầm ở thực vật và sự nảy mầm ở đậu côve 4

1.1.1 Quá trình nảy mầm ở thực vật 4

1.1.2 Sự nảy mầm ở hạt đậu côve 5

1.2 Tình hình nghiên cứu về một số chất bảo vệ đối với thực vật 6

1.2.1 Trên thế giới 6

1.2.2 Ở Việt Nam 8

1.3 Prolin và vai trò của prolin 10

1.4 Glyxin betain và vai trò của glyxin betain 13

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 Đối tượng nghiên cứu 15

2.2 Bố trí thí nghiệm 15

2.3 Phương pháp xác định các chỉ tiêu nghiên cứu 16

2.3.1 Xác định hàm lượng prolin trong mô thực vật (theo Bates và CS) [12]16 2.3.2 Xác định hàm lượng đường khử bằng phương pháp vi phân tích (theo Phạm Thị Trân Châu) [12] 19

2.3.3 Định lượng glyxin betain (theo Gvieve và Grattan, 1983) [12] 22

2.4 Phương pháp xử lí số liệu thống kê 23

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 24

3.1 Xác định nồng độ NaCl thích hợp cho nghiên cứu 24

3.2 Hàm lượng prolin ở hạt đậu côve nảy mầm trong điều kiện gây stress muối NaCl 26 3.3 Hàm lượng đường khử ở hạt đậu côve nảy mầm trong điều kiện stress muối NaCl 28 3.4 Hàm lượng glyxin betain ở hạt đậu côve nảy mầm trong điều kiện stress muối NaCl 30

KẾT LUẬN 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34

1

MỞ ĐẦU

1 Lí do chọn đề tài

Đậu côve có tên khoa học là Phaseolus vulgaris (L.) thuộc họ Đậu

Leguminosae, Fabaceae Đậu côve được trồng rộng rãi trên khắp thế giới, có nguồn gốc từ Trung Mỹ và được trồng cách đây hơn 600 năm Ở Châu Á, đậu côve được sử dụng nhiều bởi nó có giá trị dinh dưỡng cao, là một trong những loại rau giàu protein (khoảng 2,5% trong quả non), chất béo (khoảng 0,2% quả non), chất đường bột (khoảng 7% quả non) Quả tươi giàu vitamin A và

C, có thể dùng ăn tươi, đóng hộp và đông lạnh Ở một vài quốc gia Châu Á như Ấn Độ, Miến Điện sử dụng hạt khô của đậu côve trong các bữa ăn kiêng Đậu côve là một trong những loại rau màu thích nghi trong hệ thống luân canh với lúa Trong các loại đậu rau thì đậu côve quan trọng vào loại bậc nhất vì được phân bố rộng khắp, sản lượng tương đối lớn và có tiềm năng như

là nguồn thu nhập với các nông hộ nhỏ Bên cạnh việc đậu côve là nguồn cung cấp vitamin và chất khoáng phong phú trong các loại thực phẩm hàng ngày, chúng còn có tính chất cải tạo đất, góp phần tăng năng suất và chất

lượng các cây trồng khác

Trong vài năm gần đây, thời tiết diễn ra bất thường đã gây ra tác động không nhỏ đến trồng trọt, đặc biệt là hạn hán và xâm nhập của nước biển làm diện tích đất nông nghiệp bị thu hẹp Theo nghiên cứu nới nhất của Ngân hàng thế giới, Việt Nam sẽ là quốc gia bị ảnh hưởng nhiều nhất ở khu vực Đông Nam Á Nếu mực nước biển dâng lên khoảng 1m sẽ có khoảng 2983km2 bị ngập, diện tích đất bị nhiễm mặn ngày càng tăng Nhiễm mặn là nguyên nhân làm cho quá trình tao đổi chất diễn ra không bình thường, gây hạn sinh lí, kìm hãm sự sinh trưởng và ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt, sự sinh trưởng và phát triển cây Hiện tượng nhiễm mặn từ nguồn nước biển, nguồn nước ngầm và do cách canh tác của con người đã gây khó khăn cho

2

việc gieo trồng các loại đậu đỗ nói chung và đậu côve nói riêng Nhiễm mặn

là nguyên nhân làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra không bình thường, ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt, sự sinh trưởng và phát triển của thực vật

Để tăng năng suất đậu côve một trong những biện pháp là làm tăng khả năng chống chịu của chúng với ngoại cảnh bằng cải tiến kĩ thuật trồng trọt, chọn tạo giống mới hoặc lựa chọn nhiều nơi trồng có điều kiện ngoại cảnh thích hợp Vì vậy, cần tiến hành nghiên cứu phản ứng cũng như ảnh hưởng của muối NaCl tới quá trình sinh trưởng và phát triển của đậu côve trong các điều kiện môi trường có dung dịch muối NaCl với các nồng độ khác nhau để tìm được giới hạn chịu mặn của đậu côve và điều kiện mà cây sinh trưởng tốt nhất

từ đó tăng năng suất đậu côve

Ngày nay, các nghiên cứu về khả năng chịu hạn, chịu mặn,… của cây trồng nói chung, đậu côve nói riêng ngày càng được mở rộng vì tính ứng dụng cao của cây trồng họ Đậu Với sự tiến bộ của khoa học kỹ thuật các nhà khoa học có điều kiện tìm hiểu về cơ chế sinh lý, sinh hóa chịu hạn, chịu mặn của thực vật như sự ảnh hưởng của điều kiện thiếu nước đến sự nảy mầm của hạt

và phát triển của cây non, đến quá trình quang hợp và hô hấp Các cơ chế sinh hóa và sinh học phân tử cũng đã được nghiên cứu như xác định vị trí của gen liên quan đến điều chỉnh áp suất thẩm thấu, gen tổng hợp 1 số chất hình thành

và tích lũy khi hạn hán như prolin, nhóm amin bậc 4, một số đường… Tuy vậy, để tìm hiểu rõ ảnh hưởng của muối NaCl và bản chất khả năng chịu mặn của đậu côve cần có những nghiên cứu sâu hơn, đặc biệt là các nghiên cứu về

sự hình thành một số chất bảo vệ trong thực vật của cây ở giai đoạn nảy mầm trong điều kiện stress muối… để tìm ra loại cây trồng phù hợp cho những vùng đất nhiễm mặn là một yêu cầu cấp thiết Một số cây trồng có khả năng thích nghi với điều kiện đất bị nhiễm mặn hoặc thiếu nước là nhờ trong cây có các chất bảo vệ được hình thành và tích lũy ở trong cây trồng giúp cho quá trình trao đổi chất diễn ra bình thường

3

Trên thế giới người ta đã chú ý tới việc nghiên cứu về sự chống chịu ở nhiều loại cây trồng, tuy nhiên, các nghiên cứu về đậu côve còn rất ít, đặc biệt việc nghiên cứu về các chất hữu cơ có vai trò bảo vệ, đảm bảo áp lực thẩm thấu của cây có hiệu lực trong đấu tranh chống nhiễm mặn cho cây trồng như prolin, đường khử, glyxin betain lại càng trở nên quan trọng không chỉ ở giá trị lý luận mà còn ở giá trị ứng dụng trong thực tiễn trồng trọt

Giai đoạn nảy mầm là thời điểm quan trọng trong chu trình sống của thực vật nói chung và ở đậu côve nói riêng Đây là thời điểm rất nhạy cảm đối với sự thay đổi của điều kiện môi trường Những biến đổi của giai đoạn nảy mầm này sẽ ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển bình thường của cây

về sau Xuất phát từ các lí do trên, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu sự

hình thành một số chất bảo vệ ở hạt đậu côve (Phaseolus vulgaris L.) nảy

mầm trong điều kiện stress muối”

2 Mục đích nghiên cứu

Nghiên cứu sự hình thành một số chất bảo vệ của hạt đậu côve nảy mầm trong điều kiện gây stress muối đó là: hàm lượng prolin, glyxin betain, đường khử,

3 Ý nghĩa lí luận - thực tiễn

Kết quả nghiên cứu góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu về sự hình thành một số chất bảo vệ ở hạt đậu côve trong điều kiện môi trường stress muối, giúp cho việc xác định nhanh khả năng chống chịu của giống đậu côve trên đất có nồng độ muối cao

4

NỘI DUNG Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Quá trình nảy mầm ở thực vật và sự nảy mầm ở đậu côve

1.1.1 Quá trình nảy mầm ở thực vật

Nảy mầm là giai đoạn đầu tiên của quá trình phát triển cá thể Quá trình nảy mầm diễn ra nhiều biến đổi sinh lí, sinh hóa trong hạt với tốc độ cao để chuẩn bị cho sự hình thành một cây non mới

Quá trình nảy mầm của hạt bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau, mỗi giai đoạn đều có những đặc điểm sinh lí, sinh hóa đặc trưng Gồm:

- Pha trương hạt: khi bắt đầu nảy mầm hạt hút nước rất mạnh làm cho hạt trương lên

- Pha hình thành và hoạt hóa enzyme: trong hạt có một lượng enzyme nhất định nhưng chủ yếu ở dạng liên kết Do vậy không có hoạt tính, khi hoạt hóa bởi nước, enzyme được giải phóng ở dạng tự do bắt đầu hoạt động mạnh

- Tích lũy dinh dưỡng: ngay những phút ngâm nước đầu tiên cường độ hấp thụ oxi của hạt tăng lên, đặc biệt là chu trình hexozmonophotphat tăng lên nhiều lần, do vậy lượng ATP tích lũy nhiều

- Động viên các chất dinh dưỡng và xây dựng các chất hữu cơ đặc trưng cho cơ thể trong giai đoạn nảy mầm: các chất dự trữ trong hạt chủ yếu phụ thuộc 3 nhóm chất hữu cơ: gluxit, protein, lipit Trong quá trình nảy mầm enzyme  -amylaza tác động vào liên kết 1, 4 - gluxit của phân tử tinh bột làm phân giải tinh bột thành các dextrin tham gia vào quá trình hô hấp và ở dạng xaccarozo tích lũy ở các tế bào phụ phôi Protein được phân giải bởi enzyme proteza thành các axit amin và amit Phần lớn các axit amin tạo thành được chuyển vào phụ phôi để tổng hợp các phân tử protein đặc trưng cho cơ thể

5

- Sinh trưởng của phôi: khi hạt nảy mầm phôi bắt đấu sinh trưởng Đầu tiên rễ mầm nhô ra để cố định cây và hút nước, thức ăn hòa tan Trụ dưới lá mầm duỗi ra trước khi mầm cành bắt đầu sinh trưởng và tạo cành

Sự sinh trưởng tiếp theo của mầm: gồm 2 kiểu sinh trưởng

- Sinh trưởng trên bề mặt đất (thường gặp ở cây 2 lá mầm): các lá mầm được đẩy lên mặt đất nhờ trụ dưới lá mầm

Sinh trưởng dưới mặt đất (thường gặp ở cây 1 lá mầm): sự nảy mầm của hạt bắt đầu từ sự sinh trưởng của bao rễ và sự nhú rễ cái Sau đó, bao lá mầm sinh trưởng đẩy chồi lên mặt đất Tiếp theo là lá thứ nhất bên trong bao

lá mầm nhô ra ngoài Cuối cùng đỉnh cành bắt đầu sinh trưởng

1.1.2 Sự nảy mầm ở hạt đậu côve

Đậu côve thuộc cây 2 lá mầm nên sự nảy mầm cũng gồm các đặc trưng của cây hai lá mầm Ở giai đoạn đầu của thời kì nảy mầm, trong hạt quá trình sinh lí, sinh hóa diễn ra mạnh giống như quá trình nảy mầm của hạt nói chung

Sự nảy mầm của hạt đậu côve cũng bắt đầu bằng sự hấp thụ nước nhờ cơ chế hút trương của hạt làm hạt trương lên, rễ mọc ra, thân vươn lên đội 2 lá mầm lên khỏi mặt đất, lá mầm xòe ra, thân mầm tiếp tục phát triển thành thân chính Trong giai đoạn này, cây con sống chủ yếu vào nguồn chất dinh dưỡng

dự trữ ở trong 2 lá mầm, đến khi hết chất dinh dưỡng các lá mầm chuyển sang màu vàng rồi rụng và đồng thời cũng là lúc mà bộ rễ phát triển đủ khả năng hút nước và chất dinh dưỡng từ đất lên để nuôi cây

Giai đoạn này dài hay ngắn tùy thuộc vào điều kiện ngoại cảnh Nếu gieo vào vụ hè thì giai đoạn này ngắn hơn vụ đông Thông thường thời gian này khoảng 5 - 10 ngày sau khi gieo Thời kì này chính là thời kì quyết định mật

độ cây con cũng như sức sinh trưởng của cây đậu côve sau này

độ biểu hiện khác nhau: một số bị chết, một số bị thương, nhưng cũng có một

số không bị ảnh hưởng Khả năng của thực vật ngăn ngừa tổn thương khi bị tác động bất lợi của ngoại cảnh gọi là tính chống chịu Trên thế giới với sự phát triển mạnh mẽ và nhanh chóng của khoa học - kĩ thuật đã có nhiều công trình nghiên cứu về tính chống chịu của cây trồng như: Bates (1996) [21], Bamet N M, Naylor A.W (1996) [22], Thomashow MI (1998) [35], Xiao B., Yhuang, NTang (2007) [37], Volcova A.M (1984) [19],… nghiên cứu về tính chịu mặn, chịu hạn và chịu lạnh ở lúa, lúa mì và thực vật khác

Khả năng thích nghi của cơ thể thực vật đối với tác nhân biến đổi của môi trường là rất đa dạng Bằng cách biến đổi hình thái giải phẫu hoặc trao đổi chất,… thực vật có thể tránh được tác động của các tác nhân bất lợi Trong đó kiểu thích nghi có ý nghĩa quan trọng là dựa trên khả năng của tế bào biến đổi tốc độ và chiều hướng trao đổi chất phù hợp với điều kiện bất lợi đảm bảo cung cấp đủ các sản phẩm cần thiết cho hoạt động sống Đặc biệt, các chất trung gian trong quá trình trao đổi chất có vai trò rất lớn đối với tính chống chịu của thực vật Đã có nhiều công trình nghiên cứu ở nước ngoài trên các đối tượng cây trồng và thực vật khác nhau, nhằm tìm hiểu về cơ chế tổng hợp, chuyên hóa các hợp chất trung gian như prolin, đường khử, glyxin betain,…đối với tính chịu hạn, chịu mặn,…của thực vật như: Kishor P.B Hong Z., Miao G., Hu C., Verna D.P.S (1995) [28], Ashraf M., M.R.Foolad (2007) [20], Claussen W (2005) [23],

tích lũy prolin nội bào ở các tế bào Distichlis spicata trong điều kiện stress muối

(xử lí ở nồng độ 200 mM NaCl) ước tính trên 230 mM (Ketchum et al, 1991) [27] Cũng trên đối tượng cây thuốc lá, tác giả Kishor P.B.K và cộng sự (1995) [28] nghiên cứu cây thuốc lá được chuyển gen (gen liên quan đến sinh tổng hợp prolin - P5CS) trong điều kiện hạn nước, hạn muối Kết quả cho thấy hàm lượng prolin gấp khoảng từ 10 - 18 lần so với đối chứng Thực vật được chuyển gen (gen P5CS) cũng được nghiên cứu trên đối tượng là cây đậu tương (De Ronde J.A.; R.N Laurie ; T.Caetano; M.M Greyling; I.Kerepesi 2004) [24] Các tác giả tiến hành so sánh giữa dòng đậu tương chuyển gen P5CS và dòng đậu tương không được chuyển gen cho thấy: dòng đậu tương chuyển gen có khả năng chịu hạn tốt hơn

Về đậu tương có một số tác giả nghiên cứu như: Whitsitt và cộng sự (1997) [36] đã cho thấy lượng nước mất trên 60% thì đậu tương không thể phục hồi được Những nghiên cứu của Matra N., Cushman J., C (1994) [29]… đã nhận thấy rằng cDNA (complementary DNA) của dehidrin từ lá đậu tương mất nước bị phân lập, dehidrin là một trong những LEA với chức năng bảo vệ tế bào khi mất nước Sheila A.Blackman và cộng sự (1992) [34] đã nghiên cứu protein sốc nhiệt (HSP - heat shock protein) trong phôi mầm hạt đậu tương đang chín ở điều kiện bình thường và dưới áp suất thẩm thấu cao Kết quả nghiên cứu đã khẳng định HSP tăng lên trong quá trình hình thành hạt và giảm khi hạt nảy mầm HSP hỗ trợ bảo vệ tế bào vào thời điểm oligosacarit chưa được tổng hợp để hỗ trợ tế bào thực hiện chức năng

8

1.2.2 Ở Việt Nam

Nghiên cứu tính chống chịu của cây trồng có ở Việt Nam được tiến hành sâu rộng ở các đối tượng lúa, đậu tương, thuốc lá,… [1], [4], [11], [15],… Nghiên cứu mối tương quan giữa hàm lượng prolin và tính chống chịu ở cây lúa (Nguyễn Hữu Cường, Nguyễn Thị Kim Anh, Đinh Thị Phòng, Lê Thị Muội, Lê Trần Bình) [3], nghiên cứu di truyền gen kháng mặn lên quần thể cây trồng của cây lúa (Nguyễn Thị Lang, Bùi Chí Bửu) [8], nghiên cứu hàm lượng protein, lipit và thành phần axit amin của một số hạt đậu tương chịu hạn, chịu nóng (Trần Thị Phương Liên, Ngô Thu Huyền, Nguyễn Huy Hoàng, Nông Văn Hải) [9], nghiên cứu khả năng chịu hạn của cây đậu xanh trong điều kiện gây hạn (Nguyễn Văn Mã) [11], sự biến đổi của hoạt độ enzyme protein, amilaza và hàm lượng prolin của đậu tương khi gặp hạn ở thời kì ra hoa (Nguyễn Thị Thanh Thủy, Nguyễn Văn Mã) [18],… Ngoài ra còn tiến hành các nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện môi trường bên ngoài đến sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng như nghiên cứu về ảnh hưởng của điều kiện thiếu nước lên một số chỉ tiêu sinh lí, sinh hóa của đậu tương trong thời kì ra hoa (Đinh Thị Vĩnh Hà, Nguyễn Văn Mã, Lê Thị Phương Hoa) [5], ảnh hưởng

áp suất thẩm thấu môi trường đến một số chỉ tiêu sinh lí, sinh hóa giai đoạn nảy mầm của hạt đậu tương (Glycine max) (Nguyễn Văn Mã, Nguyễn Thị Lan Phượng) [14], sự biến đổi hàm lượng amino axit prolin ở rễ và lá đậu xanh dưới tác dụng của stress muối NaCl ( Điêu Thị Mai Hoa, Trần Thị Thanh Huyền) [6] Các kết quả nghiên cứu đã được ứng dụng trong sản xuất và chọn tạo được nhiều giống cây trồng mới có năng suất cao, phẩm chất tốt phù hợp với điều kiện khí hậu và canh tác ở Việt Nam

Tại trung tâm nghiên cứu và thực nghiệm đậu đỗ, viện Khoa học Kĩ thuật Nông nghiệp Việt Nam, nhiều giống đậu tương nhập nội và giống địa phương đã được đánh giá khả năng chịu hạn, chịu nóng bằng một số biện

9

pháp: cho hạt nảy mầm trong dung dịch đường sacarozo, hoặc nhiệt độ cao của trên 1000 giống nhập nội đã phân lập được 185 mẫu giống có khả năng chịu hạn trồng vụ đông xuân, 68 mẫu chịu hạn tổng hợp, 65 mẫu giống chịu nóng khá, 14 mẫu giống vừa chịu nóng vừa chịu hạn tốt và vừa có nhiều đặc tính kinh tế quan trọng khác [7]

Có khá nhiều nghiên cứu đề cập đến vai trò của ABA và prolin đối với tính chịu hạn (Austin và CS, 1982; Verma, 1990), tính chịu mặn (Eptein, 1980; Võ Minh Thứ, 1999) Nhìn chung khi tế bào mất nước dần dần thì các chất hữu cơ sẽ được tích lũy nhiều trong tế bào nhằm chống lại việc giảm tiềm năng nước và khả năng giữ nước của nguyên sinh chất Các chất hòa tan bao gồm: các loại đường, các axit hữu cơ, các loại aminoaxit, các loại rượu đa chức hay các ion (chủ yếu là K+) Hầu hết những chất này được sinh ra ngay trong quá trình đồng hóa và trao đổi chất

Một số loài thực vật có khả năng tích lũy một lượng muối cao trong tế bào, chủ yếu là muối NaCl và có thể cả K+…

Một số thực vật có khả năng tổng hợp và tích lũy một số chất hữu cơ đơn giản, có phân tử lượng thấp để tăng năng suất thẩm thấu Các chất tích lũy chủ yếu là axit hữu cơ aminoacid, đường Khi gặp môi trường mặn, trong cây lập tức tổng hợp các chất hữu cơ này để tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu của chính mình Ngoài ra, các hợp chất prolin, betaine, putressin cũng được hình thành khi mặn

Cây trồng sống trong môi trường mặn có thể hạn chế sự thiếu nước nhờ hút các ion vô cơ, tổng hợp các chất hữu cơ để điều chỉnh áp suất (Eptein, 1980) Glyxin betain và prolin là hai chất tan hữu cơ có chức năng như là những chất có hoạt tính thẩm thấu (Steward, 1979; Rhodex, Hanson, 1993) [40]

Theo nghiên cứu của của Võ Minh Thứ, 1999 về khả năng chịu mặn của cây lúa cho thấy những giống lúa chịu mặn khi bị xử lí NaCl hoặc KClO3 thì

10

có hiện tượng gia tăng nhiều chỉ tiêu sinh lí, hóa sinh: khả năng hút nước, hàm lượng nước hàm lượng nito, axit hữu cơ, diệp lục, hoạt tính catalase, peroxidase, amylase

1.3 Prolin và vai trò của prolin

Sống trong điều kiện hạn do stress muối gây ra, thực vật có khả năng chịu hạn nhờ hai cơ chế: tránh mất nước và chịu mất nước Cơ chế tránh mất nước biểu hiện qua sự thích nghi đặc biệt về cấu trúc và hình thái của rễ, chồi nhằm giảm sự mất nước hoặc việc tích lũy các chất hòa tan như protein, axit amin…để tự điều chỉnh áp suất thẩm thấu nội bào Cơ chế chịu mất nước thể hiện qua việc nhanh chóng sinh tổng hợp các chất để bảo vệ, điều chỉnh áp suất thẩm thấu trong tế bào như ABA (axit absisic), axit amin prolin …

Prolinhay α-pirolidin cacboxylic là một α-iminoaxit ưa nước có công thức phân tử C5H9NO2, có mạch bên là hidrocacbua khác với các axit amin khác ở chỗ nhóm amin bậc 1 ở Cα liên kết với cacbon của mạch bên tạo thành vòng pirolidin

Công thức cấu tạo Cấu trúc không gian

Prolin là axit amin ưa nước trong cơ thể thực vật, được tổng hợp từ glutamin bởi enzim cảm ứng stress P5CS Prolin là thành phần chủ yếu trong cấu trúc của nhóm các chất amoni bậc 4 và có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh áp suất thẩm thấu của tế bào thực vật.Vì thế, việc nghiên cứu hàm lượng prolin trong quá trình sinh trưởng của hạt đậu tương khi nảy mầm có

11

thể giúp chúng ta tìm hiểu sâu hơn sự điều tiết quá trình trao đổi nước trong tế bào thực vật và khả năng của chúng chống lại sự thiếu hụt nước

Axit amin prolin được tổng hợp từ glutamin bởi enzim chìa khóa pyrolin

- 5 - cacboxylate - synthetase (P5CS) Prolin hay α - pirolidin cacboxylic có công thức trong phân tử một mạch bên chính là một hydro - cacbua, một vòng pirolidin được tạo thành do sự kết hợp giữa nhóm amin bậc một và Cα Do

đó, prolin có chứa nhóm amin bậc hai và được gọi là imino axit [17]

Prolin thuộc nhóm các chất điều hòa thẩm thấu, chúng có khối lượng phân

tử nhỏ Ngoài ra còn có nhóm hợp chất các amon bậc 4 (glyxinebetain, prolinbetain, beta - alaninbetain và choline - oxy - sulfat) và nhóm hợp chất 3 - dimethylsunfulfonio propionate (DMSP) cũng là nhóm có khả năng tạo áp suất thẩm thấu cao Nhóm hợp chất amin bậc 4 và DMSP đều là dẫn xuất của các tiền chất là axit amin Các hợp chất trên cùng có chung tính chất không tích điện ở

pH trung tính (như các ion vô cơ) và có khả năng tan tốt trong nước, không độc khi tập trung với nồng độ cao và làm ổn định cấu trúc các đại phân tử protein, giúp thành tế bào chống lại ảnh hưởng làm biến tính của sự tập trung muối cao

và các chất hòa tan khác có hại cho tế bào [27]… Sự tích lũy các chất đó có ý nghĩa rất quan trọng, bởi vì chúng đóng vai trò nòng cốt trong việc duy trì sức trương của tế bào và hấp thụ nước ngược gradient nồng độ dưới tác động của stress

Khi nghiên cứu chức năng của prolin, Nanjo và cộng sự đã phát hiện: những cây bị đột biến về hình dạng (có sự bất thường về biểu bì, tế bào mô mềm và hệ mạch) có hàm lượng P5CS thấp, rất mẫn cảm với áp lực thẩm thấu Nhưng những sự biến đổi kiểu hình đó có thể ức chế được bằng cách tăng cường hàm lượng prolin ngoại bào [30]

Theo Wyn Jones (1977) những chất được coi là tác nhân cạnh tranh thẩm thấu, trong đó đáng kể nhất là prolin, được xem như đóng vai trò chủ đạo trong việc thích ứng thẩm thấu tế bào chất thực vật, nhằm phản ứng lại áp lực

Theo những cách thức khác nhau, những nghiên cứu ứng dụng công nghệ gen với tính chống chịu các điều kiện bất lợi về nước, đang tập trung vào nhóm gen thuộc chu trình tổng hợp prolin Các gen này mã hóa cho enzyme P5CS và P5CR (gen tham gia vào quá trình tổng hợp prolin) đã được Kishor chuyển thành công vào thuốc lá và nhận kết quả tốt, lượng prolin tăng từ 8 -

10 lần so với cây đối chứng [27]

Trong hạt phấn có nhiều prolin (theo Britikov: lượng prolin gấp 100 lần

cơ quan khác và gấp 200 - 400 lần đầu nhụy) Sự tích lũy prolin bắt đầu sau giảm phân ở hạt phấn Theo quan điểm của một số nhà khoa học: prolinlàm tăng khả năng giữ nước của cơ quan sinh sản và tăng cường hô hấp ở giai đoạn chu trình creps (đi vào chu trình sau khi loại nhóm amin) hoặc được sử dụng để tái tạo aminoacid khác

Như vậy, vai trò của prolin chống chịu stress nước ở thực vật thể hiện: prolin tham gia điều chỉnh áp suất thẩm thấu của nội bào và tham gia bảo vệ màng tế bào chống lại các tác động có hại của nồng độ muối cao Sự tập trung prolin để phản ứng lại stress muối diễn ra chủ yếu trong dịch bào Prolin cũng có thể có chức năng như protein thẩm thấu ưa nước và như một gốc hydroxyl Do đó, sự tích lũy prolin được coi là một phản ứng thích nghi thông thường của thực vật bậc cao trong điều kiện khô hạn Prolin được xem như một chất chỉ thị về khả năng chịu hạn của thực vật và còn là chỉ số tốt của thực vật có khả năng chịu mặn [6]

13

1.4 Glyxin betain và vai trò của glyxin betain

Glyxin betain là một amin bậc 4, có vai trò giúp cây chống chịu stress

phi sinh học

Công thức cấu tạo của glyxin betain

Glyxin betain được chuyển hóa từ tiền thân là Choline Choline là một chất chuyển hóa quan trọng trong thực vật và vi sinh vật nhân thực, vì nó cần thiết để tổng hợp các phospholipid màng thành phosphotidycoline Ngoài ra, một số thực vật có enzyme lục lạp xúc tác oxy hóa choline thành glyxin betain Glycin betin rất quan trọng vì nó có tính thẩm thấu mạnh mẽ và có khả năng chịu mặn cao, hạn hán và áp lực khác

Tăng trưởng của thực vật bị giảm đi rất nhiều bởi sự căng thẳng môi trường như độ mặn, hạn hán và nhiệt độ thấp (Boyer, 1982) Một số chất tan được tích lũy trong tế bào chất ở thực vật được sử dụng để điều chỉnh áp lực thẩm thấu (Yancey et al, 1982) Tăng cường sự chống chịu stress môi trường

ở thực vật, người ta sử dụng kỹ thuật chuyển gen để tạo ra các giống cây có khả năng chống chịu stress bằng cách tổng hợp glyxin betain và các chất tan khác Tăng cường cây chống chịu stress đã đạt được bởi kỹ thuật di truyền các chất tan như Pro và mannitol vào các loài thực vật không tích lũy (Tarczynski

và CS, 1993; Kishor và CS, 1995; Jain và Selvaraj, 1997; Nuccio et al, 1999)

Kỹ thuật chuyển hóa để sinh tổng hợp glyxin betain và khả năng chịu mặn và chịu lạnh ở lúa (Murata N., 1998)[29]

Glyxin betain có ở động vật, vi khuẩn, vi khuẩn lam, tảo, nấm và nhiều loài thực vật hạt kín chịu khô hạn, chịu mặn (Rhodes và Hanson, 1993) Vai trò sinh lí của glyxin betain trong việc giảm stress thẩm thấu (Wyn Jones,

14

1984) Glyxin betain đã được chứng minh bảo vệ enzyme và màng sinh chất ( Krall và CS, 1989), chịu nhiệt ( Jolivet et al, 1982), chịu mặn (Jolivet et al, 1983), và chịu lạnh (Zhao và CS, 1992) và cũng có thể ổn định PSII trong sự

có mặt của NaCl cao (Murata và CS, 1992; Papageorgiou vad Murata, 1995) [40]

Như vậy, glyxin betain có vai trò làm tăng áp suất thẩm thấu của tế bào, tham gia bảo vệ màng tế bào, do đó làm tăng khả năng giữ nước và gia tăng thẩm thấu nội bào Nhờ vậy tế bào được ổn định và cấu trúc của tế bào không

bị hư hại trong điều kiện hạn, mặn, nhiệt độ thay đổi

Bố trí thí nghiệm gieo hạt: tiến hành gieo hạt trong dung dịch muối NaCl theo phương pháp xác định khả năng chịu hạn của Volcova [19] Thí nghiệm gieo hạt trong đĩa Petri trong đó có để giấy thấm Đĩa Petri và giấy thấm trước

đó được sấy khử trùng ở 1300C trong 1 giờ

Chọn hạt giống đều, mẩy, có khả năng nảy mầm trên 80%, đưa vào làm thí nghiệm thăm dò nồng độ từ 0,05M - 0,10M - 0,15M - 0,20M - 0,25M - 0,30M và đối chứng để xác định khoảng nồng độ NaCl nghiên cứu Sau khi khử trùng hạt bằng KMn04 1% trong 5 phút Gieo hạt vào đĩa Petri bên trên giấy thấm 25 hạt/1 đĩa Petri, mỗi lô gieo 100 hạt/4 đĩa Petri và có 5 lần nhắc lại cho mỗi công thức

Gieo trên đĩa Petri có giấy thấm, chia thành 7 mẫu: