Ảnh hưởng của dòng nấm mốc aspergillus niger đến khả năng sinh pectin methylesterase hoạt tính cao

LỜI CAM ĐOAN Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Ảnh hưởng của dòng nấm mốc Aspergillus niger đến khả năng sinh pectin methylesterase hoạt tính cao” do sinh viên Nguyễn Thị Thanh T

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN THỊ THANH THÚY

MSSV: 2071841

ẢNH HƯỞNG CỦA DÒNG ASPERGILLUS NIGER

ĐẾN KHẢ NĂNG SINH PECTIN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã ngành: 08

Giáo viên hướng dẫn

Ths Trần Thanh Trúc

Cần Thơ, 2010

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn đính kèm theo đây, với đề tài “Ảnh hưởng của dòng nấm mốc

Aspergillus niger đến khả năng sinh pectin methylesterase hoạt tính cao” do

sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thúy thực hiện và báo cáo đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Giáo viên hướng dẫn

Cần Thơ, ngày … tháng … năm 2010

Chủ tịch hội đồng

LỜI CẢM TẠ

Tôi chân thành cảm ơn quý Thầy cô, gia đình và bạn bè đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện

đề tài luận văn này

Xin chân thành cảm ơn:

PGs.Ts Nguyễn Văn Mười và Thạc sĩ Trần Thanh Trúc, Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ, hỗ trợ dụng cụ thí nghiệm cho tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp này

Quý thầy cô Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm, khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ đã nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu

Chân thành cảm ơn gia đình đã động viên tôi học tập thật tốt, cảm ơn bạn bè và đặc biệt xin gởi lời cảm ơn chân thành đến anh Lân, chị Hảo, chị Trân, chị Trinh, chị Linh và chị Hồng đã giúp đỡ và chia sẻ những khó khăn trong suốt quá trình tôi học tập và thực hiện đề tài luận văn tốt nghiệp này

Cần Thơ, ngày 4 tháng 12 năm 2010

Sinh viên thực hiện

NGUYỄN THỊ THANH THÚY

TÓM TẮT

Aspergillus niger là nấm mốc có khả năng sinh enzyme pectin methylesterase (PME) được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực của đời sống Khảo sát khả năng sinh pectinase của các dòng nấm mốc được tiến hành dựa trên vòng phân giải pectin thông qua thuốc thử Lugol, đã chọn ra được 10/52 dòng có đường kính trung bình vòng phân giải pectin ≥20

mm (H4 = 20 mm, T2 = 20,5 mm, Sa2 = 21,17 mm, G2 = 21,46 mm, X3 = 21,83 mm, Sa3= 22,33 mm, T1= 22,38 mm, N1 = 23,67 mm, R4 = 23,83 mm, SO2 = 24,33 mm) Các dòng Aspergillus niger này được lên men rắn trên môi trường giàu pectin từ bã táo và vỏ cam,

sử dụng phương pháp chuẩn độ điện thế nhằm xác định chủng Aspergillus niger có khả năng sinh tổng hợp PME hoạt tính cao nhất Kết quả là chọn được 4 chủng có khả năng sinh PME hoạt tính cao là R4 = 20,6 U/mL; T2 = 20,67 U/mL; T1 = 20,91 U/mL; So2 = 21,64 U/mL Khi kết hợp lần lượt 2 chủng nấm mốc từ 4 chủng Aspergillus niger có hoạt tính cao đã được tuyển chọn, kết quả cho thấy sự cạnh tranh của hai chủng nấm mốc chưa đạt được hiệu quả trong việc thúc đẩy sự sinh tổng hợp PME

Từ khóa: Aspergillus niger, pectin methylesterase, hoạt tính

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM TẠ ii

TÓM TẮT iii

MỤC LỤC iv

DANH SÁCH HÌNH vi

DANH SÁCH BẢNG vii

TỪ VIẾT TẮT………viii

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 TỔNG QUAN 1

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 2

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 3

2.1 NẤM MỐC 3

2.1.1 Tổng quan về nấm mốc 3

2.1.2 Sinh sản của nấm mốc 4

2.1.3 Một số nấm mốc thường gặp 6

2.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ASPERGILLUS NIGER 6

2.2.1 Giới thiệu 6

2.2.2 Vị trí phân loại của Aspergillus niger 8

2.2.3 Đặc điểm sinh hóa 8

2.3 ENZYME PECTIN METHYLESTERASE (PME) 8

2.3.1 Tổng quan về PME 8

2.3.2 Ứng dụng của PME 10

2.3.3 PME từ Aspergillus niger 10

2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN 11

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM 12

3.1.1 Địa điểm, thời gian 12

3.1.2 Thiết bị, hóa chất 12

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 13

3.2.1 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu 13

3.2.2 Phương pháp bố trí thí nghiệm 14

3.2.3 Phương pháp thu thập và sử lý số liệu 16

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17

4.1 KHẢO SÁT KHẢ NĂNG SINH PECTINASE CỦA CÁC CHỦNG THUỘC LOÀI A.NIGER 17

4.2 TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG A.NIGER CÓ KHẢ NĂNG SINH PME CAO 21

4.3 KHẢO SÁT VIỆC KẾT HỢP CÁC CHỦNG NẤM MỐC A.NIGER ĐẾN KHẢ NĂNG SINH PME HOẠT TÍNH CAO 22

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 24

4.3 KẾT LUẬN 24

4.4 ĐỀ NGHỊ 24

TÀI LIỆU THAM KHẢO 25

PHỤ CHƯƠNG viii

DANH SÁCH HÌNH

Hình 1: Aspergillus niger 7

Hình 2: Bào tử Aspergillus niger 7

Hình 3: Sự phân cắt bắt đầu từ nhóm carboxyl tự do 9

Hình 4: Sơ đồ thủy phân pectin của PME 9

Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 14

Hình 6: Mặt trên vòng phân giải pectin của chủng nấm SO2 20

Hình 7: Mặt dưới vòng phân giải pectin của chủng nấm SO2 20

Hình 8: Mặt trên và mặt dưới vòng phân giải pectin của nấm mốc A.niger 20

Hình 9 : Mẫu đối chứng nước 21

Hình 10 : Mẫu đối chứng A.niger 21

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 1: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu trong nghiên cứu 13

Bảng 2: Đường kính vòng phân giải pectin của các chủng A.niger 17 Bảng 3: Sự thay đổi hoạt tính PME (U/mL) sinh tổng hợp từ các chủng A.niger đặc hiệu

với pectinase 21 Bảng 4: Sự thay đổi hoạt tính PME (U/mL) sinh tổng hợp từ việc kết hợp các chủng

A.niger 22

TỪ VIẾT TẮT

CHƯƠNG 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 TỔNG QUAN

Hầu hết các nguyên liệu sử dụng trong công nghệ thực phẩm thực tế chúng là các vật

thể sống, do đó trong quá trình bảo quản hoặc chế biến chúng thành các sản phẩm thực

phẩm sẽ xảy ra hàng loạt các quá trình biến đổi sinh hóa, mà các quá trình này được

xúc tác tự nhiên bởi enzyme bản thể hoặc do nhà công nghệ đưa vào để đạt mục đích

đặt ra Vì vậy, có thể nói enzyme đóng vai trò chủ chốt trong các quá trình chế biến và

bảo quản thực phẩm

Việc nghiên cứu enzyme bắt đầu từ năm 1833, khi Payen và Persoz tách được diatase

từ malt Song từ những năm đầu thế kỷ XX đến nay, việc nghiên cứu, sản xuất và ứng

dụng enzyme mới thực sự phát triển mạnh mẽ Công nghệ sản xuất enzyme đã mang

lại nhiều lợi ích cho các ngành công nghiệp Trong số đó, công nghiệp thực phẩm là

một trong những lĩnh vực có lượng tiêu thụ enzyme nhiều nhất

Enyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzyme có nguồn gốc từ động

vật và thực vật còn rất hạn chế Do đó, người ta nghiên cứu việc sử dụng các enzyme

có nguồn gốc từ vi sinh vật để ứng dụng trong các ngành công nghiệp khác nhau đặc

biệt là ngành công nghệ thực phẩm

Việc tổng hợp enzyme từ vi sinh vật có những ưu thế sau:

- Nguyên liệu rẻ tiền: đa số vi sinh vật sản xuất enzyme có khả năng phát triển trên các

môi trường đơn giản, rẻ tiền như phế liệu, phụ phẩm của các ngành sản xuất

- Sản xuất nhanh: vi sinh vật sản xuất enzyme với tốc độ cực kỳ nhanh, trong một thời

gian ngắn có thể sản xuất ra một lượng lớn chế phẩm enzyme

- Dễ công nghiệp hóa: việc sản xuất enzyme có thể sản xuất với một lượng lớn, đồng

thời việc thu hồi chế phẩm cũng tương đối dễ dàng

- Có hoạt tính cao: enzyme được tổng hợp từ vi sinh vật có hoạt tính khá cao so với

enzyme từ động vật và một số thực vật

Hiện nay, việc sản xuất các loại chế phẩm enzyme đã và đang phát triển mạnh mẽ trên

quy mô công nghiệp Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme được bán trên thị

trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ tinh khiết

theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng Đặc biệt, việc ly trích và ứng dụng PME

trong quá trình chế biến thực phẩm đã được phát triển khá rộng rãi ở nhiều quốc gia

(Duvetter, 2007), tuy nhiên khả năng sử dụng của enzyme này vẫn chưa được quan

tâm ở Việt Nam

Hiện không có PME thương mại được sản xuất ở nước ta, việc nhập khẩu PME được

ly trích và tinh chế ở nước ngoài thường có giá cao Chính vì thế, nghiên cứu ly trích

PME trong điều kiện hiện tại ở nước ta là một trong những việc mang tính cấp thiết và

cần có được sự quan tâm đúng mức

Pectinase có thể được sản xuất từ rất nhiều loại nấm mốc, nhưng Aspergillus là nguồn

chủ yếu (Polizeli et al., 1991) Nghiên cứu ly trích enzyme từ Aspergillus đã được thực

hiện trên rất nhiều cơ chất khác nhau theo phương pháp lên men trạng thái rắn hay lên

men lỏng (Schmitz, 2002) Tuy nhiên, việc tìm ra chủng nấm mốc thích hợp để sản

xuất ra PME có hiệu suất và hoạt tính cao là điều đặc biệt quan trọng

Trên cơ sở đó, tiến hành nghiên cứu “Ảnh hưởng của dòng nấm mốc Aspergillus

niger đến khả năng sinh PME hoạt tính cao” Việc nghiên cứu sản xuất PME từ vi

sinh vật giúp cải tiến được quy trình chế biến, nâng cao chất lượng sản phẩm, đồng

thời hạ giá thành chế phẩm enzyme, tạo điều kiện để mở rộng sử dụng enzyme trong

thực tế sản xuất ở Việt Nam

1.2 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

Mục tiêu chủ yếu của đề tài là tìm ra chủng nấm mốc A.niger có khả năng sinh PME

hoạt tính cao

Từ mục tiêu nghiên cứu trên, đề tài tiến hành khảo sát các nội dung sau:

- Khảo sát khả năng sinh pectinase của các chủng thuộc loài Aspergillus niger

- Tuyển chọn các chủng Aspergillus niger có khả năng sinh PME cao

- Khảo sát ảnh hưởng của việc kết hợp các chủng Aspergillus niger đến khả năng

sinh PME hoạt tính cao

CHƯƠNG 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 NẤM MỐC

2.1.1 Tổng quan về nấm mốc

Nấm mốc là nhóm chung của các cơ thể có nhân thật (Eukaryote), thuộc vi nấm Phần

lớn nấm có cấu tạo khuẩn ty (sợi nấm) Nấm thường phát triển trên bề mặt cơ chất

thành các dạng lông tơ, mạng nhện hoặc sợi bông, một số tạo thành màng hoặc lớp

mỏng Nhiều loài có ý nghĩa công nghiệp, được dùng trong sản xuất acid hữu cơ,

enzyme, chất kháng sinh, vitamin, một số dạng tương, chao, nước chấm, phomát …

(Magnuson và Lasure, 2004)

Nấm mốc không có diệp lục nên chúng chỉ sống được nhờ có hệ sợi bám vào các chất

hữu cơ Hệ sợi của nấm mốc có một số ăn sâu vào cơ chất gọi là khuẩn ty cơ chất hay

khuẩn ty dinh dưỡng, một số mọc ra ngoài bề mặt cơ chất gọi là khuẩn ty khí sinh

Những khuẩn ty khí sinh là những lông tơ màu trắng, mọc thành một lớp sợi mềm và

dần dần sẽ có một số sợi phát triển thành cơ quan sinh sản đặc biệt mang bào tử Màu

sắc của bào tử sẽ đặc trưng cho màu sắc của nấm mốc khi già Nấm mốc có cấu tạo

hình sợi phân nhánh, tạo thành một hệ sợi chằng chịt phát triển rất nhanh gọi là khuẩn

ty thể hay hệ sợi nấm Nấm mốc cũng có 2 loại khuẩn ty với chiều ngang của khuẩn ty

thay đổi từ 3  10 m, bao gồm khuẩn ty ký sinh mọc trên bề mặt môi trường, từ đây

sinh ra những cơ quan sinh sản Khuẩn ty cơ chất mọc sâu vào môi trường Khuẩn lạc

của nấm mốc cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc xạ khuẩn Khuẩn lạc nấm mốc

khác với xạ khuẩn ở chỗ nó phát triển nhanh hơn, thường to hơn xạ khuẩn nhiều lần

Dạng xốp hơn do kích thích khuẩn ty to hơn Thông thường khuẩn lạc sau 3 ngày phát

triển có kích thước 5  10 mm, trong khi đó khuẩn lạc xạ khuẩn chỉ khoảng 0,5  2

mm

Đa số nấm mốc có cấu tạo đa bào, tạo thành những tổ chức khác nhau như sợi khí sinh,

sợi cơ chất Sợi cơ chất của nấm mốc không đơn giản như ở xạ khuẩn mà phức tạp

hơn Có những loài có sợi cơ chất giống như rễ chùm ở thực vật gọi là rễ giả, ví dụ

như ở Aspergillus niger

Nấm mốc phổ biến trong tự nhiên, chúng mọc trên cơ chất dinh dưỡng và tạo thành

lớp lông mượt có màu sắc khác nhau và làm thay đổi rất nhiều thành phần hoá học của

cơ chất và thải ra sản phẩm trao đổi chất Ngoài ra, cơ chất còn mang mùi mốc rất khó

chịu và đôi khi sản phẩm trao đổi chất của nấm mốc là những độc chất Mycotoxin đối

với người cũng như động vật Điểm đặc biệt là nấm mốc có thể mọc ở cơ chất có độ

ẩm thấp (khoảng 15%), điều này được thấy rõ ở quả khô, bánh mì, giấy, đồ da và vải

sợi Mốc còn phát triển được ở các hàng thực phẩm có môi trường acid như hoa quả,

dưa muối chua, phomát

(Nguyễn Lân Dũng, 1983)

2.1.2 Sinh sản của nấm mốc

Nấm mốc có khả năng sinh sản vô tính và sinh sản hữu tính bằng nhiều cách khác

nhau Trong sinh sản vô tính cách đơn giản nhất là bằng mẫu sợi Một đoạn sợi nấm

rơi vào cơ chất mới gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành hệ sợi nấm mới Trong

nuôi cấy chìm sợi nấm bị chia thành từng mẫu ngắn và khi cấy truyền vào dịch nuôi

cấy mới thì những mẫu sợi này sẽ phát triển Người ta gọi các mẫu sợi trong nuôi cấy

bề sâu (lên men chìm) là các bào tử chìm

Ngoài sinh sản mẫu sợi, nấm mốc còn sinh sản bằng bào tử đốt (Oidi), bào tử (Spora),

bào tử đính (Conidia) Sinh sản bằng bào tử là một hình thức sinh sản vô tính phổ biến

ở nấm mốc Bào tử nấm mốc là cơ quan sinh sản chứ không phải là dạng tồn tại bảo vệ

như ở vi khuẩn Bào tử nấm mốc hình thành theo nhiều cách Một trong những cách đó

là bào tử hình thành trong các túi (gọi là bào tử nang), khi chín thì bào tử được giải

phóng ra ngoài và theo gió bay đi rất xa, gặp điều kiện thuận lợi sẽ mọc thành khuẩn ty

mới Một cách tạo thành bào tử tương đối phổ biến ở nấm mốc là một số khuẩn ty khí

sinh hình thành một dạng tế bào đặc biệt hình chai, đầu các tế bào này sinh ra bào tử

(các bào tử kiểu này gọi là bào tử đính) Màu sắc của bào tử đính thường đặc trưng cho

nấm mốc ở tuổi trưởng thành Nấm mốc sinh sản vô tính thể hiện qua hai dạng:

- Đoạn khuẩn ty: từng đoạn khuẩn ty ở dạng dinh dưỡng có thể phát triển thành một

cá thể mới hoàn chỉnh, đây là dạng sinh sản vô tính điển hình của nhóm nấm sợi

- Tạo bào tử: nhiều loại bào tử khác nhau của dạng sinh sản vô tính trong nhiều loại

nấm Bào tử có dạng khác nhau (bầu dục, thoi …), kích thước và màu sắc (cam, vàng,

nâu …), và sự sắp xếp bào tử khác nhau trong một cấu trúc gọi là cuống bào tử

(Sporophores)

Theo Bùi Xuân Đồng (2004), trong số các dạng bào tử thì bào tử trần (conidium) là

phổ biến nhất, chúng được nhìn thấy rõ nhất ở hai giống nấm mốc là Aspergillus và

Penicillium

- Dựa vào đặc điểm màu sắc, bào tử trần được phân biệt thành hai dạng: dạng không

màu (không màu và có màu hơi trắng, vàng tươi, lục xanh…) và dạng có màu (các

màu sẫm)

- Kích thước các bào tử trần thay đổi từ 1, 2 đến vài chục µm, nhưng cũng thể dài tới

khoảng 80  100 µm Người ta phân biệt bào tử trần lớn, bào tử trần nhỏ, có bào tử lớn

hình lưỡi liềm nhiều vách ngang và bào tử nhỏ hình cầu, hình trứng, hình hạt chanh,

không ngăn vách hoặc có vách ngang

- Giá bào tử trần là các nhánh sợi nấm phân hóa hình thái ít hay nhiều, có khả năng

trực tiếp sinh bào tử trần, hoặc phát sinh các nhánh có khả năng này Các giá bào tử

trần mọc riêng rẽ hoặc mọc thành cụm từ hai đến nhiều chiếc trên sợi nấm Các giá

bào tử trần ở từng cụm có thể hoàn toàn tách rời nhau, hoặc dính liền

(Bùi Xuân Đồng, 2004)

(ii) Khuẩn lạc của nấm mốc

Khi một bào tử nấm mốc gặp điều kiện môi trường thuận lợi sẽ phát triển thành hệ sợi

nấm Tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm, hệ sợi nấm phát triển thành các dạng khác

nhau Trên các vật thể rắn như gỗ, thủy tinh… hệ sợi nấm lan rộng, mỏng, thưa và

xốp, điển hình như sự phát triển nấm trên các mặt kính dụng cụ quang học Những loại

nấm ưa khí như nhiều loài của các chi Aspergillus, Penicilium… phát triển hệ sợi nấm

trên mặt chất lỏng, chỉ một phần hệ sợi nấm chìm trong chất lỏng Trên khối môi

trường mềm như thạch, hệ sợi nấm thường có dạng ổn định nhất Tùy thành phần môi

trường, dạng hệ sợi nấm này thường có những đặc điểm sinh trưởng, hình thái, cấu tạo

đặc trưng của mỗi loài, thậm chí mỗi chủng nấm

Thông thường một khuẩn lạc nấm mốc có dạng hình tròn, tuy nhiên trên môi trường

thạch của đĩa petri, một số loài nấm mốc tăng trưởng mạnh theo cả ba chiều, nên dạng

khuẩn lạc không rõ rệt (trường hợp nhiều loài thuộc chi Mucor, Rhizopus…) Tốc độ

tăng trưởng của các loài nấm mốc thường được tính bằng đường kính và đôi khi cả

chiều dày của khuẩn lạc Khuẩn lạc của một số loài còn đặc trưng bởi màu sắc của sợi

nấm, của bào tử và các bộ phận mang các bào tử đó Bề mặt khuẩn lạc có thể mượt

nhẵn bóng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp… Mặt khuẩn lạc thường phẳng

nhưng một số loài như Penicilium, mặt khuẩn lạc có những vết khía xuyên tâm, hoặc

thấp dần từ trung tâm ra mép, hoặc lồi lõm không đều Mép khuẩn lạc thường cấu tạo

bởi các sợi nấm cơ chất (địa sinh), thường mỏng hơn phần bên trong, trong nhiều

trường hợp, đặc biệt khi khối sợi nấm khá dày (gồm cả sợi nấm địa sinh và sợi nấm

khí sinh), có thể thấy rõ ranh giới giữa các mép và phần bên trong khuẩn lạc

Ngoài ra, các đặc điểm hình thái khác như sự có mặt của các bó sợi, bó giá, các thể

quả, hạch nấm, các giọt tiết, các sắc tố hòa tan … làm cho khuẩn lạc của một số nấm

mốc có tính đặc trưng loài Khuẩn lạc có tính chất hình thái đặc trưng loài đối với

nhiều nấm mốc Tất cả các đặc điểm hình thái nói trên của khuẩn lạc, ở hầu hết các

loài nấm mốc thay đổi nhiều hay ít theo điều kiện môi trường, trước hết vào thành

phần môi trường nuôi cấy, pH, nhiệt độ nuôi cấy, độ ẩm

(Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 2002; Bùi Xuân Đồng, 2004)

2.1.3 Một số nấm mốc thường gặp

(i) Mucor

Nấm mốc Mucor có khuẩn ty đơn bào phân nhánh mạnh, sinh bào tử nang Mucor mọc

ở các hạt, thức ăn gia súc, thực phẩm bị ẩm, thành một lớp lông tơ màu xanh Một số

loài Mucor có khả năng lên men rượu và oxy hóa Chúng được dùng trong sản xuất

acid hữu cơ, rượu và chế phẩm enzyme

(ii) Rhizopus

Trên khuẩn ty Rhizopus hình thành những nút, từ đây sẽ mọc những rễ cắm sâu vào cơ

chất và mọc những cuống sinh bào tử nang Trong bào tử nang có chứa nhiều bào tử

hình trứng, vỏ bào tử có nhiều nếp nhăn

Cuống sinh bào tử nang phình rỗng dần ở cuối Đặc điểm này đặc trưng cho giống

Rhizopus Bào tử nang lúc đầu trắng toát, khi chín thì hoàn toàn đen Trường hợp mốc

phát triển mạnh ta thấy dày đặc những đốm đen

(iii) Aspergillus

Thuộc giống Aspergillus có tới hơn 200 loài Khuẩn ty có vách ngăn Trên đầu tế bào

hình chai mọc các cuống sinh bào tử đính Các loài bào tử đính xòe ra như những bông

hoa cúc và mang màu sắc đặc trưng cho từng loài (màu hoa cau, màu xanh lục, màu

đen ) Một số loài trong giống này có nhiều ứng dụng thực tế: mốc vàng – A.oryzea,

A.flavus; mốc đen – A.niger, A.awamori, A.usami Chúng sinh ra nhiều enzyme:

amylase, protease, pectinase, và được ứng dụng trong sản xuất tương, nước chấm,

rượu, đường mật, A.niger còn dùng chủ yếu trong sản xuất acid citric

(iv) Penicillium

Khuẩn ty có vách ngăn và phân nhánh Một số đầu sợi lại chia thành các nhánh và từ

các nhánh này mới mọc ra các cuống đính bào tử Toàn bộ nhánh sinh bào tử đính có

hình dáng giống cái chổi Bào tử đính có hình cầu và khi chín có màu xanh hoặc

trắng Nhưng các mốc Penicillium thường gặp có màu xanh và người ta cũng thường

gọi mốc này là mốc xanh

Giống Penicillium có nhiều loài được dùng trong sản xuất chất kháng sinh như:

penicillin (Penicillium notatum) và nhiều loài được dùng để làm chín phomat

(Nguồn: Bùi Xuân Đồng, 2004)

2.2 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ ASPERGILLUS NIGER

2.2.1 Giới thiệu

Aspergillus niger thường gọi là mốc đen Sợi mốc trắng nhưng đính bào tử màu đen

Từ cuống đầu tiên mọc tiếp 2  4 nhánh cuống nhỏ rồi tiếp đến các đính bào tử

Loại nấm mốc này thường thấy trong quá trình thu hoạch và bảo quản các loại thực

phẩm như đậu phộng, bắp, táo, cà chua, lê, và dưa (Samson và van Reenen-Hoekstra,

1988)

A.niger thường được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp để sản xuất enzyme (như

galactosidases, lipases, protease, hemicellulase, cellulases và pectinases) và acid

hữu cơ Ngay từ năm 1917, A.niger đã được sử dụng để sản xuất acid citric (Raper và

Fennel, 1965) Ngày nay, acid citric được sản xuất từ A.niger với sản lượng khoảng

700.000 ÷ 1.000.000 tấn/năm Khoảng 70% acid citric sản xuất được sử dụng trong

các loại thực phẩm và sản phẩm bia, phần còn lại thường được ứng dụng trong ngành

2.2.2 Vị trí phân loại của Aspergillus niger

Loài Aspergillus niger có vị trí phân loại như sau:

(Klich, 2002; Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010)

2.2.3 Đặc điểm sinh hóa

A.niger là nấm mốc sinh sản vô tính bằng cách tạo thân quả hoặc cuốn bào tử đính Hệ

sợi nấm gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, màu trắng Bộ máy mang bào tử trần phát

triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dầy hơn các đoạn lân cận của sợi nấm

gọi là tế bào chân (foot cell) Giá bào tử trần phát triển từ tế bào chân, như là một

nhánh của sợi nấm, gần thẳng góc với tế bào chân và thường ở trên mặt cơ chất Giá

bào tử trần không có nhánh, không có hoặc có ít vách ngăn ngang, có phần đỉnh to ra

thành bọng hình chùy gọi là bọng đỉnh giá Bọng đỉnh giá mang các thể bình, các thể

bình này xếp thành hình tia sát nhau trên toàn bộ bề mặt bọng

Thể bình của A.niger có 2 tầng (thể bình cấp một và thể bình cấp hai) Thể bình cấp

một (cũng gọi là cuống thể bình, metula) mang một cụm gồm 2  3 thể bình cấp hai

(gọi là thể bình, phialide) ở gần phần đỉnh

Các bào tử trần được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình thành chuỗi hướng

gốc (bào tử ở ngay miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình bào tử

càng già), không phân nhánh Bào tử trần không vách ngăn, nhẵn ở mặt ngoài Tất cả

các chuỗi bào tử trần tạo thành từ các thể bình của một bọng đỉnh giá hợp thành khối

bào tử trần đỉnh bọng (conidial head) Khối bào tử trần đỉnh bọng hình tia tỏa tròn, khi

gặp điều kiện thuận lợi chúng sẽ phát tán và phát triển thành hệ sợi nấm mới (Bùi

Xuân Đồng và Nguyễn Huy Văn, 2000)

2.3 ENZYME PECTIN METHYLESTERASE (PME)

2.3.1 Tổng quan về PME

Pectin methylesterase (PME) thuộc nhóm enzyme pectinase, nhóm enzyme có khả

năng xúc tác sự thủy phân pectin PME còn được gọi là pectin esterase (PE) và được

đánh số trong hệ thống phân loại EC.3.1.1.11 PME cắt pectin tại vị trí các nhóm

cacborxyl methyl hóa (-COOCH3) của đơn vị galactose nằm kề đơn vị có nhóm

cacboxyl tự do (hình 3) Hiệu suất thủy phân có thể đạt đến 98% tạo ra sản phẩm là

acid pectinic, acid pectic và methanol (hình 4)

Hình 3: Sự phân cắt bắt đầu từ nhóm carboxyl tự do

(Nguồn: Johansson et al , 2002)

Hình 4: Sơ đồ thủy phân pectin của PME

(Nguồn: Reinikainen, 2004)

Các pectin đã bị khử ester hóa sẽ tạo gel khi có sự hiện diện của ion Ca2+ (Micheli,

2001) làm cho thành của tế bào thực vật trở nên cứng chắc Trong khi đó, sự thủy phân

OCOOCH3

OH

OHOOH

OH

COOCH3O

OH

COOHO

OO

OCOOH

OH

OHOOH

OH

COOHO

OH

COOHO

Pectine esterase

Pectine esterase

ngẫu nhiên các enzyme polygalacturonase và pectate lyase sẽ hoạt động và khử mạch

polymer của pectin Điều này cho thấy tiềm năng rất lớn của PME trong việc cải thiện

chất lượng sản phẩm chế biến có nguồn gốc thực vật (Van Buren, 1979)

2.3.2 Ứng dụng của PME

Trong sản xuất rượu vang và nước quả trong, PME khi bổ sung vào sẽ phân cắt nhóm

methyl của pectin tạo điều kiện cho enzyme polygalacturonase (PG) hoạt động phân

cắt pectin thành các đoạn ngắn, đồng thời làm giảm độ nhớt đối với những nguyên liệu

giàu pectin như bưởi, cam, dâu… nhờ đó làm tăng hiệu suất thu hồi dịch quả

PME còn là enzyme hỗ trợ cho quá trình lắng trong dịch quả khi được sử dụng cùng

với sự hiện diện của ion Ca2+ có trong nguyên liệu (hoặc bổ sung) dẫn đến sự tạo thành

phức hợp calcium pectate, mạng gel này như cái lưới kéo các phân tử gây đục Cũng

nhờ vào tác động hình thành calcium pectate do PME phân cắt nhóm methyl của

pectin, tạo điều kiện cho pectin liên kết với ion Ca2+, nhờ đó giúp cấu trúc của rau quả

được duy trì, tạo tính giòn và độ cứng chắc của sản phẩm, tăng giá trị cảm quan cho

sản phẩm (Baker và Wicker, 1996)

2.3.3 PME từ Aspergillus niger

Nhờ vào khả năng ứng dụng hiệu quả và rộng rãi trên nhiều lĩnh vực, việc sản xuất

PME được chú trọng, trong đó PME có nguồn gốc từ vi sinh vật, mà chủ yếu từ nấm

mốc Aspergillus spp được quan tâm nhiều nhất Aspergillus cũng được xác nhận là

loại nấm mốc có khả năng sinh PE hiệu suất cao và hoạt tính mạnh nhất, khi so sánh

với các loài khác như Penicillium, Rhizopuz, Fusarium (Rombouts và Pilnik, 1980)

Không những được chú trọng do hiệu quả sản xuất cao, giá thành hạ, hoạt tính tốt,

enzyme từ Aspergillus niger cũng được Viện nghiên cứu thực phẩm và thuốc của Mỹ

(FDA) chứng nhận sản phẩm an toàn (GRAS)

Về đặc điểm sinh lý, PME từ A.niger có giá trị pH tối thích 4,5 – khá phù hợp với hầu

hết các sản phẩm rau quả nên được ưa chuộng sử dụng Trong khi hầu hết các PME từ

nấm mốc thường thủy phân nhóm methyl ester của pectin một cách ngẫu nhiên, PME

nấm mốc từ A niger lại khử ester hóa với cơ chế ngẫu nhiên “có trật tự” theo từng

block (Limberg et al., 2000; Massiot et al., 1997; Ralet et al., 2003), điều này góp

phần hạn chế được sự thủy phân tự do, thúc đẩy sự khử ester do enzyme

polygalacturonase và pectate lyase, dẫn đến sự khử polymer pectin của các PME

nguồn gốc vi khuẩn khác Hay nói cách, A.niger PME có pH acid nên có sự duy trì gia

tăng hoạt tính khi chế biến ở điều kiện pH 4,5 Thêm vào đó nhờ vào khả năng có thể

phân cắt ngẫu nhiên “có trật tự” theo từng block nên hiệu quả tác động của PME từ

A.niger đối với việc phân cắt mạch pectin của thành tế bào trở nên nhanh chóng

(Sajjaanantakul và Pitifer, 1991; Duvetter, 2007)

2.4 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU CÓ LIÊN QUAN

A.niger được sử dụng phổ biến trong công nghệ thực phẩm trong nhiều thập kỷ qua và

không có tác động xấu đến sức khỏe con người Chính vì thế, việc nghiên cứu phân lập

A.niger ứng dụng trong điều chế acid citric hay các enzyme đã được tiến hành từ rất

lâu (Raper và Fennel, 1965; Magnuson và Lasure; Kashyap et al.,2001) Mặc dù vậy,

nghiên cứu phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc thích hợp cho việc sản xuất chủng

loại enzyme chuyên biệt còn chưa được quan tâm

Gần đây, Khan et al (2003) cũng đã xác nhận tầm quan trọng của việc phân lập và

tuyển chọn chủng A.niger phù hợp cho việc sản xuất xylanase Theo đó, với 104 chủng

A.niger được phân lập từ đất, khả năng sinh xylanase cũng thay đổi khác nhau, trong

đó, chỉ có 18 chủng sinh xylanase với hoạt tính 100 ÷ 150 U/ml, 7 chủng cho hoạt tính

xylanase từ 150 ÷ 200 U/ml và 3 chủng A.niger có khả năng thu nhận xylanase với

hoạt tính từ 200 ÷ 250 U/ml

Rogaiza Al-Gasgari (2002) đã tiến hành phân lập các chủng nấm mốc có trong 26 loại

nước quả ở Saudi Arabia và sử dụng các nấm mốc sau phân lập lên men sinh

pectinase Kết quả cho thấy, A.niger có mặt ở hầu hết các nguồn phân lập và có mật số

cao ở các loại cam hay nước quả hỗn hợp, tuy nhiên không tìm thấy loại nấm mốc này

trên hai mẫu nước táo và một mẫu nước xoài Đồng thời khi so sánh khả năng sinh

pectinase của A.niger và các nấm mốc khác, pectinase từ A.niger cũng được xác nhận

là nhóm có khả năng sinh pectinase hoạt tính cao

Nghiên cứu phân lập và tuyển chọn A.niger có khả năng sinh pectinase cao từ một số

phụ phẩm nông sản (cà phê, vỏ bưởi, chanh,…) của Lê Thị Thanh Hương và Nguyễn

Thùy Châu (2005) cũng cho thấy, với 80 mẫu nguyên liệu, chỉ phân lập được 50 chủng

A.niger, trong đó chỉ có 4 chủng sinh pectinase hoạt tính cao, tập trung ở A.niger trên

vỏ bưởi và chanh Đồng thời, khi so sánh khả năng sinh PME của A.niger và các nấm

mốc khác, nghiên cứu của Rogaiza Al – Gasgari (2002), PME của A.niger cũng được

xác nhận có hoạt tính mạnh hơn

Dựa trên các nghiên cứu có liên quan đã được khảo sát, có thể nhận thấy, việc chọn

đối tượng nghiên cứu là các chủng A.niger để kết hợp các chủng nấm mốc lại với nhau

cho quá trình lên men sinh enzyme PME có hoạt tính cao là một hướng đi phù hợp, có

tính cấp thiết

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHIỆM

3.1.1 Địa điểm, thời gian

Các thí nghiệm được thực hiện trong phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm,

khoa Nông nghiệp và sinh học ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ

Thời gian: Từ 8/2010 đến 12/2010

3.1.2 Thiết bị, hóa chất

(i) Thiết bị, dụng cụ

- Máy đo pH (HANA pH 212, Trung Quốc)

- Máy lắc ống nghiệm IKA, Đức

- Tủ ủ Sanyo

- Tủ cấy

- Máy ép trái cây

- Tủ sấy mẫu

- Thiết bị gia nhiệt, thanh trùng

- Ống nghiệm có nắp, đũa và que cấy, đĩa petri, bình tam giác 250 mL

- Acid citric (Merck)

- Pectin táo DE = 75% (Sigma)

- Một số hóa chất dùng trong phân tích

(iii) Nguyên liệu

- Bã từ táo ta (Ziziphus nummularia) được tách loại nước (bằng cơ học) ở 60  1°C

đến khi độ ẩm còn khoảng 6  1% (Joshi et al., 2006)

- Môi trường vỏ cam sành (Citrus nobilis var typica Hassk): cam sành rửa sạch, lấy

phần vỏ cam sành tươi, gọt bỏ phần vỏ xanh bên ngoài, cắt nhỏ, điều chỉnh đến độ ẩm

75%

(iv) Chủng nấm mốc

52 chủng nấm mốc Aspergillus niger được phân lập từ vỏ các loại quả họ citrus và táo

ta Các chủng này đã được xác định đặc tính hình thể theo khóa phân loại của Klich

(2002) và kiểm định bằng cách chạy PCR, giải trình tự gen 28s rRNA (Dương Đỗ

Thành Lân, 2010; Nguyễn Thị Kiều Linh, 2010; Lê Vương Hải Nguyệt, 2010)

Trong đó:

8 dòng có nguồn gốc từ vỏ táo Red Delicious (R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7 và R8)

6 dòng có nguồn gốc từ vỏ táo ta (T1, T2, T3,T4, T5 và T6)

5 dòng có nguồn gốc từ quả bưởi da xanh (X1, X2, X3, X4 và X5)

3 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả chanh núm (N1, N2, N3)

8 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả chanh giấy (G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7 và G8)

4 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả hạnh (H1, H2, H3 và H4)

3 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả cam sành (SA1, SA2 và SA3)

4 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả cam soàn (SO1, SO2, SO3, và SO4)

6 dòng có nguồn gốc từ vỏ quả chanh mật (M1, M2, M3, M4, M5 và M6)

5 dòng có nguồn gốc từ thịt và vỏ quả sung (S1, S2, S3, S4 và S5)

3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.2.1 Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu

Các chỉ tiêu, phương pháp phân tích, phân lập sử dụng trong nghiên cứu được tổng

hợp ở bảng 1

Bảng 1: Phương pháp phân tích và đo đạc các chỉ tiêu trong nghiên cứu

Thông số/chỉ tiêu Phương pháp

Xác định khả năng

sinh pectinase

Sử dụng môi trường pectin 0,5% và agar 2% (Khairnar et al., 2009),

đo kích thước vòng pectin bằng thuốc thử Lugol (iodine 2%) sau thời gian ủ 48 giờ (30 ± 2ºC): Kích thước vòng ≥ 20mm: pectinase cao (H), 15 ÷ 20mm: trung bình (M), 8 ÷ 15mm: yếu (W)

Tuyển chọn dòng

A.niger sinh PME

hoạt tính cao

Cấy các chủng A.niger có vòng phân giải pectin ≥ 20 mm lên môi

trường lên men rắn, sử dụng cơ chất giàu pectin gồm bã táo và cam

sành (Trần Thanh Trúc et al., 2010)

Phương pháp xác

định hoạt tính PME

Phương pháp chuẩn độ pH (theo Crelier et al., 1995; trích dẫn bởi

Duvetter, 2007), sử dụng pectin táo (DE 75%) trong NaCl 0,12M làm cơ chất phản ứng, chuẩn độ bằng NaOH 0,01N

 Lên men rắn trên môi trường bả táo + vỏ cam

 Xác định hoạt tính PME

Xác định hoạt tính PME  Thí nghiệm 3

Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát

(ii) Thí nghiệm 1: Khảo sát khả năng sinh pectinase của các chủng thuộc loài A.niger

- Mục đích: Chọn sơ bộ các chủng A.niger có khả năng sinh pectinase từ các chủng

nấm mốc ban đầu

- Môi trường: Môi trường thạch pectin

- Phương pháp: Đo vòng phân giải pectin

Nguyên tắc của phương pháp: hoạt tính pectinase được đánh giá trên cơ sở mức độ

thủy phân pectin dưới tác dụng xúc tác enzyme thông qua độ lớn của vòng phân giải

pectin bằng dung dịch chỉ thị Lugol 2%

- Cách tiến hành

Môi trường thạch pectin sau khi đun tan được phân phối vào các đĩa petri, dùng khoan

nút đục lỗ trên đĩa thạch

Hút vào mỗi lỗ 0,1ml dịch nuôi cấy nấm, nuôi ở nhiệt độ 30  2oC

Sau 48h, nhỏ dung dịch Lugol lên mặt thạch, sau đó xác định hoạt độ pectinase bằng

cách đo vòng phân giải pectin trên môi trường

- Kết quả thu nhận

Các chủng A.niger có khả năng sinh pectinase cao nhất dựa theo đường kính vòng

phân giải

(iv) Thí nghiệm 2: Tuyển chọn các chủng A.niger có khả năng sinh PME cao

- Mục đích: Chọn lựa các chủng A.niger có khả năng sinh PME cho hiệu suất và hoạt

tính cao

- Môi trường: Môi trường bã táo khô và cam sành (tỉ lệ 3:1, độ ẩm môi trường 60%)

- Cách tiến hành

Từ các chủng A.niger có khả năng sinh pectinase cao, lên men rắn trong môi trường

giàu pectin từ bã táo và cam sành (Trần Thanh Trúc et al.,2010) ở nhiệt độ phòng với

thời gian ủ 96 giờ

Cho 5g cơ chất vào các bình tam giác 250ml, bổ sung dung dịch đệm citrate –

phosphate (pH 4,5) đến pH 3,5, độ ẩm môi trường 60%, thanh trùng ở 121oC trong 15

phút Làm mát các bình tam giác sau khi thanh trùng, kế tiếp cho 2 ml dịch huyền phù

bào tử A.niger vào mỗi bình (khoảng 107 bào tử/ml) và ủ ở nhiệt độ phòng Sau 96 giờ

ủ (4 ngày), trích lấy dịch chứa enzyme PME bằng dung dịch đệm citrate – phosphate

pH 4,5 Xác định hoạt tính PME theo phương pháp chuẩn độ điện thế

- Kết quả thu nhận

Xác định được chủng nấm mốc có khả năng sinh PME hoạt tính cao

(v) Thí nghiệm 3: Khảo sát việc kết hợp các chủng nấm mốc A.niger đến khả năng

sinh PME hoạt tính cao

- Mục đích: khảo sát khả năng cạnh tranh của việc kết hợp các chủng A.niger có khả

năng sinh PME cho hiệu suất và hoạt tính cao

- Môi trường: Môi trường bã táo khô và cam sành (tỉ lệ 3 : 1, độ ẩm môi trường 60%)

- Cách tiến hành

Từ các chủng A.niger có khả năng sinh pectinase cao, lên men rắn trong môi trường

giàu pectin từ bã táo và cam sành (Trần Thanh Trúc et al.,2010) ở nhiệt độ phòng với

thời gian ủ 96 giờ

Cho 5 g cơ chất vào các bình tam giác 250 mL, bổ sung dung dịch đệm citrate –

phosphate (pH 4,5) đến pH 3,5, độ ẩm môi trường 60%, thanh trùng ở 121oC trong 15

phút Làm mát các bình tam giác sau khi thanh trùng, kế tiếp cho 2 mL dịch huyền phù

bào tử A.niger vào mỗi bình (khoảng 107 bào tử/mL), đối với các chủng kết hợp thì lấy

mỗi chủng 1 mL cho vào mỗi bình và ủ ở nhiệt độ phòng Sau 96 giờ ủ (4 ngày), trích

lấy dịch chứa enzyme PME bằng dung dịch đệm citrate – phosphate pH 4,5 Xác định

hoạt tính PME theo phương pháp chuẩn độ điện thế

- Kết quả thu nhận

Xác định được chủng nấm mốc có khả năng sinh PME hoạt tính cao

3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý số liệu

Các chủng nấm mốc A.niger được xác định hoạt tính sinh enzyme, số liệu được thu

thập và thống kê, phân tích phương sai (ANOVA) theo kiểm định LSD để kết luận về

sự sai khác giữa trung bình các nghiệm thức, sử dụng phần mềm Statgraphic 3.1