Ảnh hưởng của chất dinh dưỡng, nồng độ natri metabisulfite xử lý trong quá trình thu hoạch đến chất lượng rượu vang thốt

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG LÊ VĂN CÔNG METABISULFITE XỬ LÝ TRONG QUÁ TRÌNH THU HOẠCH ĐẾN CHẤT LƯỢNG RƯỢU VANG THỐT NỐT LÊN MEN Ở NHIỆT ĐỘ MÁT LUẬN V

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

LÊ VĂN CÔNG

METABISULFITE XỬ LÝ TRONG QUÁ TRÌNH THU HOẠCH

ĐẾN CHẤT LƯỢNG RƯỢU VANG THỐT NỐT

LÊN MEN Ở NHIỆT ĐỘ MÁT

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP KỸ SƯ Ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã ngành: 08

Ngày 6 tháng 12 năm 2010

Luận văn tốt nghiệp kèm theo đây với tên đề tài là “ẢNH HƯỞNG CỦA CHẤT DINH DƯỠNG, NỒNG ĐỘ SODIUM METABISULFITE XỬ LÝ TRONG QUÁ TRÌNH THU HOẠCH ĐẾN CHẤT LƯỢNG RƯỢU VANG THỐT NỐT LÊN MEN

đã được hội đồng chấm luận văn thông qua

Giáo viên hướng dẫn Giáo viên phản biện Giáo viên phản biện

Cần Thơ, ngày……tháng…….năm 2010

Chủ Tịch Hội Đồng

LỜI CẢM TẠ

Lời đầu tiên con xin gửi lời kính yêu đến Cha, Mẹ Người đã tận tâm nuôi dưỡng con khôn lớn thành người, quan tâm chia sẽ những niềm vui và khó khăn trong cuộc sống Xin chân thành cảm ơn PGs TS Nguyễn Minh Thủy Cô đã tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức thật bổ ích cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài

Xin gửi lời tri ân đến quý Thầy, Cô trong bộ môn Công nghệ thực phẩm trường Đại Học Cần Thơ đã tận tình truyền đạt các kiến thức trong suốt thời gian học tập vừa qua Xin chân thành cảm ơn Ths Trần Thanh Tuấn, Ks Nguyễn Phú Cường và các bạn sinh viên khóa 33 ngành Công nghệ thực phẩm, Trường Đại Học Cần Thơ đã nhiệt tình cộng tác, chia sẻ kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài Xin cám ơn các bạn lớp Công nghệ thực phẩm K33B đã chia sẽ kinh nghiệm, động viên tinh thần và tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường

Xin chúc tất cả có thật nhiều sức khỏe, niềm vui trong cuộc sống và thành công trong công việc

LỜI CAM ĐOAN

Luận văn này là công trình nghiên cứu của giáo viên hướng dẫn và bản thân Các thông tin về số liệu, hình ảnh, kết quả đã được trình bày trong luận văn đều trung thực

và chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu nào trước đây

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010

Sinh viên thực hiện

Lê Văn Công

TÓM TẮT

Với mục đích nhằm tận dụng triệt để lượng nước thốt nốt, đa dạng hóa sản phẩm, nâng cao giá trị cho nước thốt nốt và tăng thu nhập cho người dân địa phương ở huyện Tịnh Biên tỉnh An Giang, nghiên cứu được thực hiện khảo sát ở các nồng độ xử

lý sodium metabisulfite trên nguyên liệu khác nhau 0,1%; 0,05% và mẫu đối chứng (trong quá trình thu hoạch) Trong quá trình lên men ở nhiệt độ mát (2025 o C) thực hiện bổ sung các chất dinh dưỡng sulfate amon (0,3 g/l; 0,2 g/l; 0,1 g/l và mẫu đối chứng) và thiamine (0,75 mg/l; 0,5 mg/l; 0,25 mg/l và mẫu đối chứng)

Kết quả nghiên cứu cho thấy:

Sử dụng 0,1% sodium metabisulfite để xử lý nước thốt nốt trong quá trình thu hoạch cho hiệu quả tốt nhất Rượu vang được sản xuất từ nguyên liệu được xử lý ở nồng độ này có hàm lượng ethanol cao (trung bình 13,75 %v/v) và các chỉ tiêu (SO 2 , methanol, acid, ester, đường sót) đều đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7045:2002) Trong quá trình lên men ở nhiệt độ mát (2025 o C) hàm lượng 0,2 g/l sulfate amon bổ sung vào dịch lên men sẽ cho sản phẩm rượu vang có chất lượng tốt nhất với hàm lượng ethanol cao (trung bình 14,25 %v/v) Các chỉ tiêu khác như: hàm lượng đường sót, methanol, SO 2 , acid và ester đều đạt yêu cầu theo TCVN 7045:2002

MỤC LỤC

LỜI CẢM TẠ iii

LỜI CAM ĐOAN iv

TÓM TẮT v

DANH SÁCH BẢNG viii

DANH SÁCH HÌNH ix

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ 1

1.1 Giới thiệu 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2

2.1 Cây thốt nốt 2

2.1.1 Giới thiệu 2

2.1.2 Phân loại 2

2.1.3 Giá trị dinh dưỡng 3

2.1.4 Phương pháp xử lý trong quá trình thu hoạch nước thốt nốt 5

2.2 Rượu vang 6

2.2.1 Chuẩn bị dịch lên men 7

2.2.2 Lên men chính 7

2.2.3 Lên men phụ 7

2.3 Nấm men 7

2.3.1 Phân loại 7

2.3.2 Cấu tạo 7

2.3.3 Sinh sản của nấm men 8

2.3.3 Một số chủng nấm men sử dụng trong rượu vang 8

2.4 Tuyển chọn giống nấm men 11

2.4.1 Tách giống thuần chủng từ khuẩn lạc riêng biệt 11

2.4.2 Quá trình phân lập nấm men từ nước thốt nốt 11

2.5 Kiểm tra các đặc tính của giống nấm men phân lập 13

2.5.1 Hoạt lực lên men 13

2.5.2 Khả năng chịu cồn 13

2.5.3 Khả năng chịu sulfite 13

2.5.4 Tính chịu acid 13

2.6 Quá trình lên men rượu 14

2.6.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu 14

2.6.2 Các sản phẩm trong quá trình lên men 16

Có thể viết dưới dạng tổng quát sau: 16

2.7 Hóa chất sử dụng 16

2.7.1 Thiamine (vitamin B 1 ) 16

2.7.2 Natri bisulfite (NaHSO 3 ) 17

3.1 Phương tiện 18

3.1.1 Thời gian và địa điểm 18

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị 18

3.1.3 Nguyên liệu và hóa chất 19

3.2 Phương pháp nghiên cứu 19

3.2.1 Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của nồng độ sodium metabisulfite xử lý trong quá

trình thu hoạch đến chất lượng rượu vang thốt nốt 19

3.2.2 Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của tỷ lệ chất dinh dưỡng đến chất lượng rượu vang thốt nốt khi lên men ở nhiệt độ mát (2025 o C) 20

3.2.3 Phương pháp phân tích 20

3.3 PHƯƠNG PHÁP THỐNG KÊ 21

4.1 Ảnh hưởng của nồng độ xử lý sodium metabisulfite trong quá trình thu hoạch đến chất lượng rượu vang thốt nốt 22

4.1.1 Hàm lượng ethanol của sản phẩm 23

4.1.2 Hàm lượng đường sót 24

4.1.3 Hàm lượng acid tổng số trong rượu 24

4.1.4 Hàm lượng ester trong sản phẩm 26

4.1.5 Hàm lượng methanol trong rượu vang thốt nốt 26

4.1.6 Hàm lượng SO 2 tổng số trong sản phẩm 27

4.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ các chất dinh dưỡng bổ sung vào dịch lên men đến chất lượng rượu vang thốt nốt khi lên men ở nhiệt độ mát (2025oC) 27

4.2.1 Hàm lượng ethanol trong sản phẩm 28

4.2.2 Hàm lượng đường sót trong sản phẩm 30

4.2.3 Hàm lượng acid tổng số trong sản phẩm 31

4.2.4 pH của sản phẩm 33

4.2.5 Hàm lượng ester của sản phẩm 33

4.2.6 Hàm lượng SO 2 tổng số trong rượu vang 34

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 38

5.1 Kết luận 38

5.2 Đề nghị 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 39

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Thành phần hóa học trong 100ml nước thốt nốt 4 Bảng 2.2 Thành phần hóa học của nước thốt nốt trên cây đực và cái tính trên 100ml 4 Bảng 2.3 Kiểu hoạt động của một số chất bảo quản trên vi sinh vật 6 Bảng 3.1 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa học 21 Bảng 4.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu với các nồng độ xử lý sodium metabisulfite

22 Bảng 4.2 Hàm lượng ethanol (%v/v) hình thành với tỷ lệ các chất dinh dưỡng khác nhau (nhiệt độ 2025oC, thời gian lên men 25 ngày,oBx=24, mật số nấm men là 105cfu/ml) 28 Bảng 4.3 Hàm lượng đường sót (%) trong rượu vang với tỷ lệ các chất dinh dưỡng khác nhau (nhiệt độ 2025oC, oBx = 24, thời gian lên men 25 ngày, mật số nấm men

105 cfu/ml) 30 Bảng 4.4 Hàm lượng acid (mg/l) trong rượu với tỷ lệ các chất dinh dưỡng khác nhau (nhiệt độ 2025oC, oBx = 24, thời gian lên men 25 ngày, mật số nấm men 105 cfu/ml) 31 Bảng 4.5 pH của sản phẩm với tỷ lệ các chất dinh dưỡng khác nhau (nhiệt độ

2025oC, thời gian lên men hơn 25 ngày, oBx = 24, mật số nấm men 105 cfu/ml) 33 Bảng 4.6 Hàm lượng ester (g/l) trong sản phẩm với tỷ lệ các chất dinh dưỡng khác nhau (nhiệt độ 2025oC, thời gian lên men 25 ngày, oBx = 24, mật số nấm men 105cfu/ml) 34

nhau (nhiệt độ 2025oC, thời gian lên men 25 ngày, oBx = 24, mật số nấm men là 105cfu/ml) 35 Bảng 4.8 Hàm lượng methanol (g/l) trong sản phẩm với tỷ lệ các chất dinh dưỡng khác nhau (nhiệt độ 2025oC, thời gian lên men 25 ngày, oBx = 24, mật số nấm men

là 105 cfu/ml) 36 Bảng 4.9 Các chỉ tiêu phân tích chất lượng rượu vang thốt nốt khi lên men ở nhiệt độ phòng và nhiệt độ mát 37

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Cây thốt nốt 2

Hình 2.2 Công thức cấu tạo của Na2S2O5 5

Hình 2.3 Saccharomyces cerevisiae 9

Hình 2.4 Saccharomyces uvarum 9

Hình 2.5 Saccharomyces chevalieri 10

Hình 2.6 Saccharomyces oviformic 10

Hình 2.7 Kloeckera apiculata 11

Hình 2.8 Cấu tạo thiamine 17

Hình 2.9 Công thức cấu tạo của NaHSO3 17

Hình 3.1 Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 18

Hình 3.2 Quy trình sản xuất rượu vang thốt nốt 19

Hình 4.1 Hàm lượng đường sót và ethanol tạo thành với các nồng độ xử lý sodium metabisulfite khác nhau 23

Hình 4.2 Hàm lượng acid và ester tạo thành với các nồng độ xử lý sodium metabisulfite khác nhau 25

Hình 4.3 Hàm lượng SO2 tổng số với các nồng độ xử lý sodium metabisulfite khác nhau 27

Hình 4.4 Đồ thị biểu diễn sự so sánh hàm lượng đường sót với các tỷ lệ dinh dưỡng khác nhau khi lên men ở nhiệt độ mát (2025oC) 31

Hình 4.5 Đồ thị biểu diễn sự so sánh hàm lượng acid tổng số với các tỷ lệ chất dinh dưỡng khác nhau khi lên men ở nhiệt độ mát (2025oC) 45

Hình 4.6 Đồ thị biểu diễn sự so sánh hàm lượng SO2 với các tỷ lệ chất dinh dưỡng khác nhau khi lên men ở nhiệt độ mát (2025oC) 36

Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ

1.1 Giới thiệu

Thiên nhiên dường như ưu đãi cho vùng Bảy núi tỉnh An Giang một phong cảnh tuyệt vời với non xanh hùng vĩ mà khó có nơi nào sánh kịp Bên cạnh lợi thế sẵn có về mặt địa hình, người dân nơi đây còn biết điểm tô thêm bức tranh du lịch bằng những đặc sản của địa phương Một trong số đó là các sản phẩm từ cây thốt nốt như: đường thốt nốt, nước thốt nốt tươi, bánh thốt nốt (được làm từ gạo Nàng Nhen cùng với cơm thốt nốt)…cây thốt nốt có một vị trí quan trọng đối với người dân nơi đây, đặc biệt là cộng đồng người dân tộc kh’mer với hơn 4.000 lao động khai thác, chế biến đường tại hơn 1.400 cơ sở Nhìn chung các sản phẩm làm từ thốt nốt chỉ qua sơ chế đơn giản, chủ yếu làm bằng phương pháp thủ công truyền thống nên không nâng cao được giá trị đầy tiềm năng của loài cây này Đặc biệt là nước thốt nốt từ trước đến nay người dân nơi đây chỉ biết dùng làm nước giải khát và đường thốt nốt Với đặc tính dễ bị hư hỏng do lên men tự nhiên nên nước thốt nốt không được tồn trữ lâu và khai thác với số lượng lớn

Ở An Giang, cây thốt nốt phân bố chủ yếu xung quanh khu vực núi Cấm, nơi tập trung đông đúc cộng đồng dân tộc kh’mer Việc ổn định và nâng cao đời sống cho người dân nơi đây có một ý nghĩa chiến lược rất quan trọng, muốn làm được việc này một cách bền vững phải phát huy những thế mạnh sẵn có của địa phương như tiềm năng về

du lịch gắn liền với các làng nghề thủ công trong đó có nghề làm đường thốt nốt Với hơn 100.000 cây thốt nốt, sản lượng nước khai thác 300-500 lít/năm/cây thì sản lượng nước thốt nốt là vô cùng to lớn Tuy nhiên việc làm đường cũng không thể nào sử dụng hết nguồn nguyên liệu dồi dào này và giá trị kinh tế không cao

Để tận dụng một cách triệt để nguồn nguyên liệu phong phú, nâng cao giá trị khai thác

và nhằm góp phần làm đa dạng các sản phẩm từ cây thốt nốt, từng bước nâng cao thu nhập cho người dân địa phương ở huyện Tịnh Biên tỉnh An Giang, đặc biệt là đồng bào dân tộc kh’mer Trên cơ sở đó sản xuất rượu vang từ nước thốt nốt sẽ là một đặc trưng cho làng du lịch của vùng Thất Sơn, làm tăng giá trị cho nước thốt nốt và tăng thu nhập cho người dân

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

Đề tài nghiên cứu hướng tới mục tiêu xác lập quy trình sản xuất rượu vang thốt nốt với hàm lượng tối ưu natri metabisulfite xử lý nước thốt nốt trong quá trình thu hoạch

và hàm lượng chất dinh dưỡng bổ sung vào dịch lên men thích hợp cho hoạt động của nấm men

Chương 2 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

2.1 Cây thốt nốt

2.1.1 Giới thiệu

Những ai đi qua khu vực núi Cấm tỉnh An Giang thì không thể nào không biết đến loài cây có tên là “thốt nốt” hay “thốt lốt” một loài cây gắn liền với hình ảnh phum sóc nơi đây Tên gọi “thốt nốt” theo cách gọi thông thường của chúng ta ngày nay có nguồn gốc từ tiếng kh’mer là “th’nôt”

Theo từ điển bách khoa Việt Nam (1991), thốt nốt có tên khoa học là Borassus

flabellifer Đây là một loài cây nhiệt đới thuộc họ Cao Cây thẳng đứng có hình dáng

tương tự như cây dừa, nhưng lá mọc tập trung ở đầu thân có dạng hình quạt rộng từ

23 m xòe như nan quạt Thời gian sinh trưởng của loài cây này tương đối chậm,

có thể khai thác nước từ loài cây này Ngoài tự nhiên chúng có thể sống trên 50 năm Thốt nốt chia làm 2 loại: cây đực và cây cái, điểm khác biệt ở 2 loại này là cây cái thì cho quả còn cây đực thì không, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới như: Châu Phi (Ethiopia, Nigieria, Togo…) miền Nam Châu Á (Campuchia, Ấn Độ, Việt Nam…) Các sản phẩm từ cây thốt nốt rất đa dạng như:

Nước thốt nốt tươi: một loại dịch lấy từ bông của loài cây này được người dân khai

thác và xử lý ban đầu bằng gỗ sến nhằm tránh lên men tự nhiên

Đường thốt nốt: nước được lấy đem về cô đặc lại cho đến khi nước sánh kẹo lại rồi đổ

vào những khuôn chứa Hương thơm của loại đường này rất đặc trưng mà không loại đường nào có được

Lá thốt nốt: người dân nơi đây sử dụng chúng làm chuồng dơi, giỏ…

Ngoài ra còn có trái thốt nốt, gỗ…có thể thấy được những lợi ích vô cùng to lớn của loài cây này

Chi (genus): Borassus L Hình 2.1 Cây thốt nốt

Loài (species): flabellifer (Nguồn: http://images.google.com.vn/imglanding?q=caythotnot)

Tên hai phần: Borassus flabellifer

Thốt nốt (hình 2.1) có danh pháp khoa học là Borassus flabellifer L, thuộc họ cau (Arecaceae) - thốt nốt châu Á (miền nam châu Á) còn gọi đơn giản là thốt nốt (Ấn Độ,

Sri Lanka, Thái Lan, Campuchia, Việt Nam, Malaysia, New Guinea)

Theo Beccari (1913), chuyên gia tổng hợp những cây họ cau và đã phân thành 7 loại

thốt nốt: Borassus flabellifer (ở Châu Á); Borassus sundaica (ở Malaysia); Borassus

aethiopum, với 2 giống: senegalensis và bagamojensis (ở Châu Phi); Borassus deleb

(ở Sudan và ở Nuybi); Borassus Sambiranensis và Borassus madagascarensis (ở Madagascar); Borassus heineana (ở Nouvell – Guinée)

Hai loài thốt nốt là Borassus madagascariensis và Borassus sambiranensis được liệt

kê trong sách đỏ IUCN đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng cần được bảo vệ Ngày

nay chỉ còn 2 loại chiếm ưu thế, một loại ở Châu Á: Borassus flabellifer, loại khác ở

Châu Phi: Borassus aethiopum Cây thốt nốt mọc nhiều ở Campuchia và rãi rác ở

vùng nam bộ Việt Nam Thốt nốt là một cây điển hình trong cảnh quan đồng bằng Campuchia Ở Campuchia, cây thốt nốt tập trung ở các tỉnh Kandal, Kompôngpen, Kompongchnang, Takeo có khoảng 2 triệu cây trưởng thành, trong đó có khoảng 30% được khai thác, khoảng 600 ngàn cây đựơc lấy dịch làm đường, mỗi cây sản xuất được

hai chum đường (66 kg), mỗi năm tổng sản lượng khoảng 40 ngàn tấn

Ở Việt Nam, cây thốt nốt được trồng chủ yếu ở vùng Núi Cấm tỉnh An Giang Riêng

vùng núi Thất Sơn-An Giang hiện có hơn 100.000 cây thốt nốt trồng tập trung ở các huyện Tri Tôn, Tịnh Biên, trong đó có gần 60.000 cây đang trong thời kỳ cho thu hoạch trái với 4.000 lao động khai thác nước thốt nốt Theo thống kê của ngành công nghiệp An Giang, mỗi năm rừng thốt nốt ở An Giang cung cấp khoảng 5.600 tấn đường trong đó thị trường Mỹ, Đài Loan, Úc hơn 100 tấn, trị giá khoảng 56 tỉ đồng

(Nguồn http://vietbao.vn/Phong-su/Rung-thot-not-lam-nguy)

2.1.3 Giá trị dinh dưỡng

Nước thốt nốt thông thường có từ 1315oBx (chủ yếu là saccharose), là một nguồn năng lượng rất tốt cho cơ thể ngoài ra trong thành phần nước của chúng còn chứa nhiều vitamin, chất khoáng và nguồn protein tương đối cao, đặc biệt trong thành phần nước thốt nốt còn có một hàm lượng vitamin C đáng kể 13,25 mg/100 ml (Hoàng Xuân Phương, 2004) Vì vậy khi được dùng làm nước giải khát thì nước thốt nốt sẽ mang lại cho cơ thể con người nguồn năng lượng dồi dào, các vitamin và khoáng chất rất phong phú đa dạng Ngoài việc dùng làm nước giải khát thì nước thốt nốt còn sản xuất đường, nhưng nhìn chung các giá trị dinh dưỡng mà cây thốt nốt mang lại đều là nằm trong nước của loài cây này Giá trị dinh dưỡng của nước thốt nốt được tóm tắt ở bảng 2.1

Bảng 2.1 Thành phần hóa học trong 100ml nước thốt nốt

(Nguồn: Hoàng Xuân Phương, 2004)

Ở Ấn Độ có một công trình nghiên cứu được thực hiện trên hai loại cây đực và cái, lấy trên các cây có độ tuổi khoảng 20 năm, thực hiện trên hai điều kiện trước và sau lên

men 24 giờ Kết quả được thể hiện ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Thành phần hóa học của nước thốt nốt trên cây đực và cái tính trên 100ml

Thông số

Cây thốt nốt

Trước lên men Sau 24 giờ lên

men Trước lên men

Sau 24 giờ lên men

(Nguồn: Debmalya và Mazumdar, 2000)

Kết quả cho thấy sau khi lên men 24 giờ, các thành phần trong dịch lên men đều giảm sau quá trình lên men, ethanol đều tăng sau 24 giờ do lên men tự nhiên

2.1.4 Phương pháp xử lý trong quá trình thu hoạch nước thốt nốt

Nước của loài cây này được thu hoạch bằng cách kẹp những cuống hoa cho chảy dịch

ra từ từ Trong quá trình thu hoạch nước thốt nốt do không được che chắn cẩn thận nên có rất nhiều côn trùng rơi vào dụng cụ hứng, bên cạnh đó do thành phần chất dinh

thích hợp cho nhiều loài vi sinh vật phát triển Vì vậy quá trình hư hỏng nước thốt nốt

là không thể tránh khỏi quan trong nhất là sự lên men tự nhiên Để khắc phục tình trạng này trên thực tế đã sử dụng một số cách như:

a Xử lý bằng gỗ sến

Trên thực tế gỗ sến được cho vào dụng cụ chứa trước khi đi thu hoạch nước thốt nốt

Nó có tác dụng chống sự lên men tự nhiên khá tốt Tuy nhiên trong thành phần hóa học của gỗ sến có chứa các hợp chất phenol không tốt cho cơ thể, ở nồng độ cao có thể gây ung thư

Sến – tên khoa học: Madhuca pasquieri – Là loại cây gỗ to, cao đến 30 m, vỏ thân

màu nâu sẫm Chi Madhuca Gmel có khoảng 85 loài phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới

Châu Á Ở Indonesia có 28 loài, Malaysia có 25 loài, Thái Lan 8 loài, Silanca 5 loài,

Myanma 3 loài, Đông Dương 13 loài trong đó Việt Nam 9 loài (Đỗ Duy Bích và cộng

sự, 2005) Hai loài được coi là đặc hữu: sến núi cao (M alpina) ở các tỉnh phía nam

và sến mật (M pasquiqueri) chỉ có ở các tỉnh phía bắc

b Xử lý bằng sodium metabisulfite (Na 2 S 2 O 5 )

Sodium metabisulfite là một chất sát khuẩn có tác dụng bảo quản, trên thị trường chất này được bán dưới dạng bột màu trắng hay ngã vàng Công thức cấu tạo được cho ở

Bảng 2.3 Kiểu hoạt động của một số chất bảo quản trên vi sinh vật

++

++

-

- ++

++

+++ +++ +++ ++

- Theo màu sắc: có vang đỏ (bordaux), vang trắng

- Theo hàm lượng đường còn sót lại: vang chát hay vang khô (hết đường) và vang ngọt (còn đường)

Nếu uống một lượng vừa phải thì có tác dụng kích thích các trung tâm thần kinh có lợi cho sức khỏe Ngoài ra trong rượu vang còn có các vitamin, chất khoáng, acid hữu cơ, protein (Lương Đức Phẩm, 2005) Lên men rượu vang thường chia thành các giai đoạn: chuẩn bị dich lên men, lên men chính, lên men phụ và ổn định sản xuất

2.2.1 Chuẩn bị dịch lên men

Đặc trưng của sản xuất rượu vang là từ nước của các loại quả, tuy nhiên hàm lượng đường của chúng không cao nên cần bổ sung đường vào dịch lên men Bên cạnh đó cũng cần có sự điều chỉnh pH môi trường cho thích hợp vì dịch lên men là môi trường thích hợp cho nhiều loài vi sinh vật phát triển Do vậy cần phải sát khuẩn dịch lên men

trước khi bổ sung nấm men

2.2.2 Lên men chính

với khối lượng dịch trái cây (Nguyễn Đức Lượng, 2006) Nhiệt độ lên men chính thường duy trì 2022oC thời gian kéo dài 1020 ngày Nếu lên men ở nhiệt độ cao hơn 2530oC thì thời gian rút ngắn lại 67 ngày Cuối giai đoạn lên men chính dịch lên men trong dần vì protein và pectin lắng xuống

2.2.3 Lên men phụ

Mục đích của len men phụ là làm ổn định chất lượng rượu vang, làm sáng trong rượu

và tăng hương thơm Lên men phụ thường được tiến hành ở nhiệt độ thấp hơn lên men chính 1518oC sự tạo thành cồn chậm lại, tăng các hợp chất thơm Sau khi chỉnh

không tan sẽ lắng xuống đáy ta tiến hành lọc Sản phẩm sau khi lọc cần được tồn trữ lại trước khi uống càng lâu càng tốt

2.3 Nấm men

2.3.1 Phân loại

Theo hệ thống phân loại nấm men thuộc vào giới nấm (Kingdom Fungi theo Whitaker, 1996; Takhtakjan, 1970) Fungi bắt nguồn từ chữ la tinh Fungus có nghĩa là nấm, đôi khi dùng Mycetes bắt nguồn từ chữ Hy Lạp Mukes

Nấm men là nhóm cơ thể đơn bào hoặc tập hợp đơn bào, nhân chuẩn, hiển vi Nấm

men có thể thuộc về 2 lớp nấm: nấm túi (Ascomycetes) và nấm bất toàn (nhóm nấm

không tạo thành bào tử - lớp nấm không hoàn thiện) (Deuteromecetes hoặc Fungi imperfect)

Đơn vị cơ bản phân loại nấm men trong sản xuất lên men là nòi hoặc chủng Đây là

các tế bào thuần chủng của một loài xác định Các nòi (chủng) được tập hợp thành loài

(Species), các loài tập hợp thành giống (genus, genera), các giống hợp thành họ… 2.3.2 Cấu tạo

Khi quan sát dưới kính hiển điện tử thì cấu tạo tế bào nấm men có thể phân biệt các thành phần như sau: màng tế bào, nguyên sinh chất (Protoplasma, Cytoplasma), nhân (Nguyễn Công Hà, 2000)

Màng tế bào: là một thành mỏng, trong suốt có tính đàn hồi, có nhiệm vụ bảo vệ tế

bào tránh những tác động bên ngoài đồng thời điều chỉnh áp suất thẩm thấu giữa bên trong và bên ngoài tế bào

Màng có cấu tạo từ polysaccharide kiểu hemicellulose gồm glucan và manan Ngoài

ra vỏ tế bào còn chứa một lượng nhỏ chất béo, protid chất khoáng và chitin ở lớp màng này có 2 vùng mang tính thẩm thấu có chọn lọc đối với các chất khác nhau, trên màng có nhiều lổ nhỏ có đường kính đến 3,6 nm, nước và các chất dinh đưỡng đi vào

tế bào bằng con đường này (Lương Đức Phẩm, 2005)

Nguyên sinh chất: nguyên sinh chất của tế bào hay cytoplasma còn có tên chung là

protoplasma Protoplasma của nhân tế bào còn có tên riêng là nucleoplasma, còn ở ngoài nhân thì gọi là cytoplasma

Cytoplasma: là một hệ thống keo, độ nhớt của nó phụ thuộc vào thời kì sinh trưởng và

các yếu tố sinh lý Tế bào còn trẻ thì độ nhớt thấp hơn tế bào già, bảo đảm cho việc trao đổi chất tốt hơn

Nhân: bên ngoài nhân có lớp vỏ nhân (màng), bên trong chứa đầy nucleoplasma trong

suốt và những sợi chỉ nhỏ dài gọi là cromosome Cromosome có cấu tạo từ protid và acid dezoxyribonucleic Trong cromosome còn có chứa các enzyme và acid ribonucleic Cromosome thực hiện chức năng di truyền, kiểm soát sự phân hóa tế bào

và tổng hợp protid Nhân có dạng hình tròn đường kính 1 đến 2 micromet, ngăn cách với cytoplasma bởi 2 lớp màng Các màng này thông với nhau bởi các lỗ có đường kính 3 đến 100 nm Qua đó nucleoplasma và cytoplasma có sự liên hệ với nhau (Lương Đức Phẩm, 2005)

2.3.3 Sinh sản của nấm men

Nấm men có thể sinh sản vô tính bằng cách mọc chồi hoặc sinh sản hữu tính bằng cách hình thành nang bào tử Trong quá trình sinh sản vô tính, chồi mới phát triển từ men mẹ khi các điều kiện thích hợp và sau đó, khi chồi đạt tới kích thước của men trưởng thành thì nó tách ra khỏi men mẹ Khi các điều kiện dinh dưỡng kém các men

có khả năng sinh sản hữu tính sẽ tạo ra các nang bào tử Các men không có khả năng

đạt được chu trình sinh sản hữu tính đầy đủ được phân loại trong chi Candida (Lương

Đức Phẩm, 2005)

2.3.3 Một số chủng nấm men sử dụng trong rượu vang

Nấm men trong sản xuất rượu vang thuộc giống Saccharomyces Meyer Meyer là

người đầu tiên gộp các loài nấm men bia và rượu vang thành một giống

Giống Saccharomyces có 18 loài, nhưng chỉ có 7 loài thường gặp trong nước quả

(Lương Đức Phẩm, 1998)

năng kết lắng của nó phụ thuộc vào từng nòi: các tế bào dạng bụi hoặc dạng bông

Đa số các tế bào của loài này hình ovan có kích thước (3÷8) x (5÷8) m, sinh sản theo

lối nảy chồi và tạo thành bào tử Saccharomyces cerevisiae sinh ra enzyme invertase

có khả năng khử đường saccharose thành fructose và glucose, vì vậy trong lên men ta

có thể bổ sung loại đường này vào dung dịch quả và hàm lượng rượu được tạo thành bình thường đối với nhiều nòi của men này chỉ đạt được 8÷10% so với thể tích

b Saccharomyces uvarum

Men Saccharomyces uvarum (hình 2.4) được tách từ nước nho, rượu và nước quả

Phúc Bồn Tử lên men tự nhiên Về hình thái nó không khác với các loài khác Các nòi

dùng trong sản xuất rượu vang

Hình 2.4 Saccharomyces uvarum

(Nguồn: http://www.iisalessandrini.it/progetti/studenti/ainvernizzi/immagini/sacc%20uvarium.jpg)

c Saccharomyces chevalieri

Hình 2.5 Saccharomyces chevalieri

(Nguồn: http://eniw.ru/vinnye-drozhzhi.htm)

Saccharomyces chevalieri (hình 2.5) thuần chủng lên men nước nho có thể tạo 16o

cồn Nó thường nhầm lẫn với Saccharomyces vini

d Saccharomyces oviformis

Hình 2.6 Saccharomyces oviformic

(Nguồn: http://www.amigasdovinho.com.br/vinho/fermentacao_dir.htm)

Giống Saccharomyces oviformis (hình 2.6) thuần chủng phát triển tốt trong nước nho

và các loại nước quả khác, có khả năng chịu được đường cao, cồn cao, lên men kiệt đường và tạo thành tới 18o cồn Các yếu tố sinh trưởng của loại này giống như

Saccharomyces vini, Saccharomyces oviformis lên men được glucose, fructose,

mannose, saccharose, maltose và 1/3 rafinose, không lên men được lactose, pentose

Điều khác nhau cơ bản của hai loài này là: Saccharomyces oviformis không lên men được galactose và men nổi lên bề mặt dịch men tạo thành màng và ngược lại

e Kloeckera apiculata - Hanseniaspora apiculata

Kloeckera apiculata (hình 2.7) kích thước tương đối, có hình ovan – elip hoặc hình

quả chanh, tế bào có một đầu nhỏ người ta thường gọi là men hình chùy

Hình 2.7 Kloeckera apiculata

(Nguồn: http://www.lwg.bayern.de/analytik/mikrobiologie/31908/)

Kloeckera apiculata sinh sản bằng cách nảy chồi, rất phổ biến ở vỏ quả và nhiễm vào

nước quả chiếm tới 90% tổng số men khi bắt đầu lên men Nó có thể lên men tạo thành 6÷7o cồn, nhưng tạo ra một loạt các acid bay hơi cũng giống như các ester của chúng làm cho dịch lên men có mùi hỗn tạp và nó còn kìm hãm các loài nấm men

chính khác trong quá trình lên men, Kloeckera apiculata nhạy cảm với SO2 Trong nghề làm rượu vang người ta không mong muốn loài men này phát triển

2.4 Tuyển chọn giống nấm men

2.4.1 Tách giống thuần chủng từ khuẩn lạc riêng biệt

Đây là một phương pháp phổ biến thường dùng trong các phòng thí nghiệm vi sinh vật Phương pháp dựa trên cơ sở là tách giống sạch từ khuẩn lạc nấm men mọc riêng

rẽ trên môi trường đặc Muốn vậy phải gieo cấy giống từ (đất, hoa quả ) sau khi pha loãng tới 10-6 đến 10-8 trên môi trường đặc (thạch-malt hoặc thạch-dịch quả ) trong đĩa Petri, giàn đều rồi để 2 đến 3 ngày cho giống mọc tốt trên bề mặt môi trường đã được thanh trùng Từ một tế bào riêng biệt sẽ sinh sản và phát triển thành một khuẩn lạc trên bề mặt môi trường

Phân lập nấm men từ dịch quả: dùng que cấy vô trùng cấm sâu vào dịch quả rồi

nhúng que cấy vào ống nghiệm có sẵn 5 ml nước cất Từ đây dùng phương pháp cấy tia gieo vào đĩa Petri đã có sẵn môi trường nuôi cấy Giống đã được cấy qua đĩa Petri rồi đem rồi ủ ở 2528oC trong 2 đến 3 ngày để giống phát triển, từ đây tiến hành phân lập để chọn các chủng sạch từ các khuẩn lạc riêng lẽ (Lương Đức Phẩm, 2005)

2.4.2 Quá trình phân lập nấm men từ nước thốt nốt

a Thu hoạch nước thốt nốt

Nước thốt nốt thu hoạch vào buổi sáng và buổi chiều với 3 điều kiện xử lý (không xử

lý, xử lý gỗ sến, xử lý sodium metabisulfite) ở huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang Sau khi thu hoạch, mẫu nước thốt nốt được tiến hành kiểm tra đánh giá chất lượng tại

ruộng, sau đó vận chuyển về phòng thí nghiệm tiến hành phân lập Điều kiện tồn trữ mẫu trong quá trình vận chuyển là 05oC, đảm bảo nguyên liệu khi về đến phòng thí nghiệm không bị biến đổi chất lượng

b Quá trình phân lập nấm men từ nước thốt nốt

Trước khi thực hiện phân lập nấm men tự nhiên từ nước thốt nốt, nguyên liệu được kiểm tra các giá trị pH, hàm lượng chất khô hòa tan trong nguyên liệu nhằm xác định được sự biến đổi chất lượng của nước thốt nốt trong quá trình vận chuyển

Nguyên liệu có chất lượng tốt được tiến hành phân lập để tuyển chọn những dòng nấm men tự nhiên có trong nguyên liệu này Tại đây, các công đoạn ban đầu như chuẩn bị môi trường nuôi cấy nấm men, dụng cụ phải được thanh trùng và chuẩn bị kỹ càng, đảm bảo cho quá trình nuôi cấy và tuyển chọn các dòng nấm men được thực hiện trong điều kiện thích hợp tối ưu nhất

trên môi trường thạch đĩa, lấy những khuẩn lạc khác nhau làm tiêu bản giọt ép trên lam kính để quan sát tế bào nấm men và ghi nhận hình dạng bằng kính hiển vi Thông thường mẫu nước thốt nốt mới phân lập có các khuẩn lạc khác nhau trên môi trường thạch đĩa và nhiều hình dạng tế bào nấm men Do đó, phải tiếp tục cấy chuyền những khuẩn lạc khác nhau trên đĩa môi trường, cho đến khi tạo được các khuẩn lạc giống nhau trên cùng 1 đĩa (tạo được giống nấm men đồng nhất)

Sau thời gian phân lập thu được 21 dòng nấm men từ nước thốt nốt, cấy chuyền 21 dòng này vào 2 môi trường tổng hợp Sabouraud và MEA, theo dõi khả năng phát triển của khuẩn lạc bằng cách đếm số lượng khuẩn lạc trên đĩa khi nuôi cấy cùng một lượng mẫu ban đầu (số lượng khuẩn lạc dao động 30300/đĩa), và số lượng nấm men/ ml mẫu bằng buồng đếm thoma khi nuôi cấy trên môi trường dịch thể (Bùi Thị Thúy Ngân, 2010)

Kết quả 21 dòng nấm men phát triển tốt trong môi trường Sabouraud, với số lượng khuẩn lạc và số lượng nấm men phát triển vượt trội Sử dụng môi trường Sabouraud

để phân lập và bảo quản các giống nấm men trong môi trường ống thạch nghiêng, nhiệt độ bảo quản 410oC, định kỳ cấy chuyền 2 tháng/lần

Dựa vào khóa phân loại các giống nấm men, chủ yếu dựa vào các đặc điểm hình thái nấm men, quan sát tế bào nẩy chồi khi nuôi cấy trong môi trường lỏng cao mạch nha – cao nấm men – glucose – pepton, quan sát sự hình thành bào tử nấm men khi nuôi cấy trên môi trường nghèo dinh dưỡng thạch – agar, các đặc điểm sinh lý như khả năng lên men đường và khả năng đồng hóa urea Bước đầu xác định 21 dòng nấm men phân

lập thuộc 3 giống nấm men Saccharomyces, Hanseniaspora và Candida (Bùi Thị

Thúy Ngân, 2010)

2.5 Kiểm tra các đặc tính của giống nấm men phân lập

2.5.1 Hoạt lực lên men

Để xác định hoạt lực lên men của một giống nấm men có thể dùng phương pháp trọng lượng, phương pháp thể tích dựa trên khả năng làm thoát CO2

Phương pháp trọng lượng: xác định lượng CO2 thoát ra tới khi kết thúc lên men

thông ra ngoài nối với bầu chứa H2SO4 để chặn không khí từ ngoài vào bình Gieo cấy men giống vào dịch lên men trong bình rồi ủ 2528oC đối với men rượu, 1525oC với men rượu vang, 79oC với men bia Cân bình sau khi cấy giống và trong quá trình lên men đến khi trọng lượng bình và dịch lên men không đổi (kết thúc lên men) Hiệu số trọng lượng của bình trước và sau khi lên cho ta trọng lượng CO2 sinh ra từ đó tính ra

2.5.2 Khả năng chịu cồn

Để xác định khả năng chịu cồn, chuẩn bị dịch lên men 2% đường và 1012% cồn,

ở nhiệt độ trên, hàng ngày quan sát sự sủi bọt Chủng nào lên men được ở 15% cồn là chủng chịu được độ cồn cao có khả năng sinh ra nhiều cồn (Lương Đức Phẩm, 2005)

2.5.3 Khả năng chịu sulfite

Là một đặc điểm rất cần cho các chủng nấm men trong sản xuất rượu vang, đầu tiên chuẩn bị các mẫu thử với hàm lượng SO2 khác nhau, sau mỗi giờ lại bổ sung SO2 vào

chất trong dịch lên men Đặt các mẫu vào tủ ấm trong 10 ngày, hàng ngày quan sát sự sinh trưởng và lên men (Lương Đức Phẩm, 2005)

2.5.4 Tính chịu acid

Không phải tất cả các chủng nấm men đều chịu được pH thấp, chọn được chủng chịu

pH thấp có ý nghĩa quan trọng trong nghề sản xuất rượu vang Cách làm là gieo các chủng nấm men thử nghiệm vào dịch quả có pH = 2,6 với hàm lượng đường 18% ủ

2527oC rồi dùng acid tartaric để điều chỉnh pH Quan sát xem chủng nào phát triển

và lên men sớm (Lương Đức Phẩm, 2005)

Sau khi phân lập được các tế bào nấm men thuần chủng và kiểm tra tất cả các hoạt tính lên men của các chủng nấm men vừa phân lập được rồi chọn ra chủng nấm men phù hợp với yêu cầu tiến hành nhân giống và đưa vào sản xuất Việc phân lập nấm men có một ý nghĩa quan trọng, việc làm này sẽ tránh nhiễm các vi sinh vật không mong muốn trong nguồn nấm men bổ sung và chủ động được nấm men giống

C6H12O6 + 2(P) + 2ATP 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP

2.6 Quá trình lên men rượu

Lần đầu tiên, mối quan hệ giữa nấm men và sự lên men rượu được làm rõ do Cagnard Latour, Schwann và Kutzing vào thế kỷ 19 Pasteur (1866) đã đưa ra những bằng chứng khoa học rằng sự lên men được tạo ra từ những tế bào sống Lên men rượu là quá trình phân giải đường thành rượu và tạo ra khí carbonic dưới tác dụng của vi sinh vật trong môi trường yếm khí

Sơ đồ tổng quát của quá trình lên men:

Đường và các chất dinh dưỡng có trong môi trường lên men được hấp thụ trên bề mặt sau đó qua màng bán thấm vào bên trong tế bào nấm men, sự phân hủy đường thành rượu trong tế bào nấm men xảy ra bằng hàng loạt các phản ứng với sự tham gia của rất nhiều loại enzyme khác nhau, bước cuối cùng là sự chuyển hóa acid pyruvic thành rượu ethylic và CO2 Trên thực tế cuối quá trình lên men có thể có các sản phẩm khác nhau tùy thuộc vào điều kiện lên men Nếu lên men trong môi trường kiềm yếu thì sản

nó kết hợp với acetaldehyde bisulfitnatri rất khó tan Khi đó không có acetaldehyde làm chất nhận hydro, vì vậy lúc này chất nhận H2 là dioxyaceton photphat kết quả là tạo thành glycerin

2.6.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu

a Ảnh hưởng của nồng độ đường

Tất cả nấm men chỉ có khả năng lên men các loại đường đơn giản (glucose, fructose),

đường đôi maltose và sucrose Riêng lactose chỉ có Saccharomyces lactic mới sử dụng

được Nấm men hoàn toàn không cá khả năng sử dụng các loại đường đa Nồng độ đường quá cao khoảng 30% sẽ ức chế quá trình lên men Trong sản xuất rượu vang nồng độ đường thường sử dụng 16÷25%, và sử dụng nấm men chìm, khi kết thúc quá trình lên men lượng đường còn sót lại sẽ tạo vị ngọt cho rượu

b Ảnh hưởng của oxy

Nấm men là loài hiếu khí tùy tiện, trong điều kiện có mặt của oxy nấm men sẽ phát triển sinh khối, còn trong điều kiện yếm khí thì nó sẽ theo con đường lên men rượu Hiệu ứng pasteur: là hiệu ứng ức chế quá trình lên men rượu khi có mặt oxy Sự

dụng đường (Lương Đức Phẩm, 1998)

c Ảnh hưởng của độ rượu

Rượu được tích tựu dần trong dịch lên men và chính nó là chất kìm hãm sự phát triển của nấm men Nấm men chịu cồn từ 8÷12% đa số bị ức chế ở 16÷18% Khả năng chịu

cồn là nồng độ cồn ức chế sự phát triển và hoạt động của nấm men sau 72 giờ nuôi cấy ở 300C

d Ảnh hưởng của pH

bào, làm tăng hoặc giảm mức độ thẩm thấu các chất dinh dưỡng cũng như chiều hướng của quá trình lên men

Nấm men có thể phát triển trong môi trường pH từ 28 nhưng thích hợp nhất là 4  4,5 Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn Ở pH < 4,2 nấm men phát triển tuy chậm hơn pH = 4,55 nhưng tạp khuẩn hầu như không phát triển Vì vậy trong quá trình lên men rượu nên thực hiện pH 3,8  4,0

pH có ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình lên men rượu Tùy thuộc vào mục đích lên men thu sản phẩm gì mà có hướng điều chỉnh thích hợp

- pH là môi trường acid thì sản phẩm thu được là rượu ethylic

- pH là môi trường acid yếu thì thu được ethylic và glycerin

- pH là môi trường kiềm thì sản phẩm là rượu ethylic, acid acetic và glycerin

f Ảnh hưởng của nhiệt độ

Đa số nấm men nhiệt độ tối thích vào khoảng 28÷32oC, nhưng với lên men thì lại không hoàn toàn trùng với khoảng nhiệt độ này Khi nhiệt độ lên men cao thì sự tích

tụ rượu ethylic càng sớm, tốc độ lên men nhanh và kết thúc sớm, nhưng không lên men được hết đường, mặt khác nhiệt độ càng cao càng dễ sinh ra và tích tụ các sản phẩm phụ và làm ảnh hưởng đến chất lượng của rượu vang (Lương Đức Phẩm, 2005) Theo Saller (1955) cho rằng ở nhiệt độ cao cồn sẽ bị cuốn theo CO2 làm giảm hàm lượng ethanol, ông cũng chỉ ra rằng acohol mất khoảng 0,65% với nhiệt độ lên men

20oC; 0,18% ở 5oC và 1,5% ở 32oC (Amarine, 1979)

Tùy thuộc vào nấm men sử dụng là nấm men nổi hay chìm mà có hướng điều chỉnh

quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được nhiệt độ khá rộng từ 145oC, nếu nhiệt độ quá 50oC (Lương Đức Phẩm, 2005) thì nấm men sẽ chết Theo Jacob và cộng sự (1964) thời gian chết nhiệt của Saccharomces cerevisiae là một phút ở 58oC và 0,1 phút ở 62oC

Ở 20÷22oC trong môi trường lên men sẽ hạn chế được sự phát triển của tạp khuẩn, nhiệt độ cao hơn khoảng 30oC nấm men dại phát triển cao hơn Saccharomyces 2÷3

lần Trong quá trình lên men rượu, nếu lên men ở nhiệt độ cao sẽ tạo nhiều ester aldehyde và tổn thất rượu theo CO2 sẽ tăng

2.6.2 Các sản phẩm trong quá trình lên men

Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong các quá trình lên men phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố Hàm lượng sản phẩm phụ hình thành trong quá trình lên men rượu thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu (Nguyễn Đình Thưởng và Nguyễn Thanh Hằng, 2005)

a Các acid

Thường gặp trong vang là acid acetic, propionic, izobutyric, butyric…acid acetic được tạo thành từ phản ứng oxy hóa khử giữa hai aldehyde acetic - một phân tử bị oxy hóa, phân tử thứ hai sẽ bị khử:

Acid lactic được tạo bởi pyruvate dehydrogenase theo phản ứng:

Các acid bay hơi được tích tụ chủ yếu trong giai đoạn đầu lên men và giảm dần trong giai đoạn cuối Một số nấm men có thể sử dụng nguồn dinh dưỡng carbon từ các acid này

Thiamine được tách ra ở dạnh tinh khiết do Casimir Funk (1912), đa số ở dạng tự do còn một phần ở dạng thiamine pyrophotphate (hình 2.8) Thiamine phân bố rộng rãi trong tế bào ở dạng hoạt động coenzyme-thiamine-pyrophotphate (carboxylase)

Hình 2.8 Cấu tạo thiamine

(Nguồn: http://images.google.com.vn/thiamine)

Tính chất: dạng tinh thể nhỏ trắng, tan dễ trong nước, vị đắng Bền trong môi trường

acid, hoạt tính của nó không bị giảm khi đun nóng dung dịch có pH = 3, ở 140oC

chất oxy hóa bị phá hủy dưới tác dụng của HNO3 và KMnO4

Tác dụng: ở dạng thiamin pyrophotphate thì tham gia vào thành phần coenzyme

decarboxylase và transcetolase Thiếu B1 thì sẽ dẫn đến tích lũy các ketoacid ở máu não và các mô làm ảnh hưởng đến thần kinh, suy nhược, mất ngủ, viêm dây thần kinh

và hoạt động của tim bị rối loạn Thiamine có nhiều trong cám, phôi bột hòa thảo, lòng đỏ trứng, gan… đặc biệt là có nhiều trong nấm men (Nguyễn Minh Chơn, 2004)

2.7.2 Natri bisulfite (NaHSO 3 )

Đây là một chất sát khuẩn thông dụng trong nghành công nghiệp sản xuất đồ uống (công thức cấu tạo được cho ở hình 2.9)

Hình 2.9 Công thức cấu tạo của NaHSO3

(Nguồn: http://images.google.com.vn/imglanding?q=NaHSO3)

Sodium bisulfite ở dạng tinh thể mịn, tồn tại ở dạng khí SO2 khi hoà tan vào nước Khí này sẽ bị bay hơi dần theo thời gian, khí SO2 giải phóng từ sodium bisulfite hoạt động giết chết các loại nấm mốc, vi khuẩn dại cũng như các vi sinh vật không mong muốn khác trong quá trình lên men

Chương 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Phương tiện

3.1.1 Thời gian và địa điểm

Thời gian: Đề tài được bắt đầu ngày 15/8/2010 và kết thúc ngày 15/10/2010

Địa điểm: Đề tài được thực hiện tại phòng D101, bộ môn Công nghệ thực phẩm, khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng, trường Đại Học Cần Thơ

3.1.2 Dụng cụ và thiết bị

Các thiết bị sử dụng cho quá trình nghiên cứu được trình bày ở hình 3.1 bao gồm:

Chiết quang kế, máy quang phổ hấp thụ Spectrophotometer, máy đo pH, cân điện tử,

tủ hút, nồi thanh trùng, kính hiển vi, máy voltex, tủ đông, và các thiết bị khác

Hình 3.1 Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Dụng cụ: cồn kế, hệ thống chưng cất, bình lên men, một số dụng cụ phân tích khác

3.1.3 Nguyên liệu và hóa chất

Nguyên liệu: nước thốt nốt được thu hoạch tại huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang Trong quá trình thu hoạch nước được xử lý ban đầu nhằm tránh lên men tự nhiên được tồn trữ lạnh trong quá trình vận chuyển không quá 24 giờ Nếu chưa được sử dụng nước thốt nốt được bảo quản ở nhiệt độ < 0oC Ngoài ra còn có nấm men phân lập, đường saccharose

Hóa chất dùng trong phân tích: HCl đậm đặc, NaOH, Chì acetate, Na2SO4, CuSO4, Kalinatritartrate, Fe2(SO4)3, H2SO4 đậm đặc, Na2S2O5…

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Quy trình sản xuất rượu vang thốt nốt từ giống nấm men phân lập được thực hiện theo

quy trình được thể hiện ở hình 3.2

Hình 3.2 Quy trình sản xuất rượu vang thốt nốt

3.2.1 Thí nghiệm 1 Ảnh hưởng của nồng độ sodium metabisulfite xử lý trong quá trình thu hoạch đến chất lượng rượu vang thốt nốt

a Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố, 2 lần lặp lại

Nguyên liệu: nước thốt nốt được thu hoạch tại huyện Tịnh Biên vào buổi sáng

Nhân tố: xử lý sodium metabisulfite trong quá trình thu hoạch nước thốt nốt với các

nồng độ khác nhau (0,05%; 0,1% và mẫu đối chứng)

Nước thốt nốt

Phối chế

Lên men Làm trong

Tồn trữ Sản phẩm

Nước thốt nốt lên men tự nhiên

Nhân giống nấm men

Xử lý

Phân lập nấm men

Thực hiện thí nghiệm: cân khối lượng sodium metabisulfite theo yêu cầu thí nghiệm

cho vào các dụng cụ thu hoạch (đã được sát khuẩn bằng cồn 90o) và lấy đúng thể tích nước thốt nốt theo yêu cầu xử lý của thí nghiệm (hàm lượng sodium metabisulfite xử

lý là 0,05 g/l, 0,1 g/l và mẫu đối chứng) Kiểm tra sơ bộ chất lượng nguyên liệu ban đầu (oBx, pH)

Nước thốt nốt thu được sau khi xử lý sodium metabisulfite được tiến hành lên men với các thong số cố định (pH = 4,5; oBrix = 24 thanh trùng bằng NaHSO3 (hàm lượng 140 mg/l) trong 2 giờ chủng nấm men phân lập với mật số nấm men là 105 cfu/ml vào dịch lên men chứa trong các bình lên men đã được rửa sạch và sấy khô)

b Chỉ tiêu theo dõi

Khi kết thúc quá trình lên men tiến hành phân tích các chỉ tiêu:

- Hàm lượng đường sót (%) còn lại trong rượu khi kết thúc quá trình lên men, hàm lượng ethanol hình thành (%v/v), pH, acid tổng số (mg/l), ester (mg/l), methanol (g/l),

SO2 tổng số (mg/l)

3.2.2 Thí nghiệm 2 Ảnh hưởng của tỷ lệ chất dinh dưỡng đến chất lượng rượu vang thốt nốt khi lên men ở nhiệt độ mát (2025 o C)

a Bố trí thí nghiệm

Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với hai nhân tố, hai lần lặp lại

- Nhân tố A: nồng độ Sulfate amon (g/l) 0,1; 0,2; 0,3 và mẫu đối chứng

- Nhân tố B: nồng độ thiamine (mg/l) 2,5; 5; 7,5 và mẫu đối chứng

Tổng số nghiệm thức: 4 x 4 = 16 nghiệm thức

b Tiến hành thí nghiệm: nguyên liệu ban đầu được xử lý với hàm lượng sodium

metabisulfite tối ưu ở thí nghiệm trên, kiểm tra sơ bộ chất lượng nguyên liệu (oBx,

mg/l) trong 2 giờ, cuối cùng bổ sung nấm men phân lập với mật số nấm men 105cfu/ml, đậy kín tạo môi trường yếm khí và thực hiện quá trình lên men trong kho lạnh (2025oC)

c Chỉ tiêu theo dõi

Khi kết thúc quá trình lên men chính (hết sủi bọt khí CO2) Xác định hoạt lực nấm men sử dụng thông qua phân tích các chỉ tiêu:

Hàm lượng đường sót (%) trong rượu khi kết thúc lên men, hàm lượng ethanol hình thành (%v/v), pH, acid tổng số (mg/l), ester (mg/l), SO2 tổng số (mg/l), methanol (g/l)

Bảng 3.1 Phương pháp phân tích các chỉ tiêu hóa học

Acid (mg/l) Cho 100 ml rượu đun sôi đuổi hết CO 2 Trung

hòa bằng NaOH 0,1 N với chất chỉ thị phenoltalein đến khi xuất hiện màu hồng nhạt Ester (mg/l)

Hàm lượng SO 2 (mg/l)

Thêm 5 ml NaOH 0,1N vào dịch chuẩn acid ở trên Đem đun dưới hệ thống chảy ngược 1 giờ Cho thêm 5 ml H 2 SO 4 1:3 rồi chuẩn độ bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng

Oxy hóa SO 2 bằng dung dịch I 2

Hàm lượng methanol (g/l) Phản ứng giữa KMnO4 và methanol

Nồng độ cồn (%v/v) Chưng cất, đo bằng cồn kế ở 20oC

Hàm lượng đường sót (%) Phương pháp của Lane-Eynon: Phản ứng giữa

đường khử và đồng trong dung dịch Fehling tạo ra Cu 2 O màu đỏ gạch

(Nguồn Lê Thanh Mai và cộng sự, 2007)

X n

Trong đó: n: số lần lặp lại; X i: lần phân tích thứ i; X : giá trị trung bình

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Ảnh hưởng của nồng độ xử lý sodium metabisulfite trong quá trình thu hoạch đến chất lượng rượu vang thốt nốt

yếu là saccharose) nên nước thốt nốt rất dễ bị vi sinh vật tấn công và lên men tự nhiên

do nấm men dại phát triển gây ảnh hưởng đến chất lượng nước thốt nốt nếu không có biện pháp xử lý trong quá trình thu hoạch Trong thực tế người dân sử dụng gỗ sến xử

lý nước thốt nốt để tránh sự lên men tự nhiên, tuy nhiên phương pháp xử lý này vẫn chưa có công trình nghiên cứu về tính an toàn thực phẩm Một phương pháp khác xử

lý nước thốt nốt cũng mang lại hiệu quả là sử dụng sodium metabisulfite trong quá trình thu hoạch, để đảm bảo về tính an toàn thực phẩm và chất lượng nguyên liệu ban đầu để sản xuất rượu vang thốt nốt đạt yêu cầu theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN 7045:2002) thì các nồng độ xử lý sodium metabisulfite cần được nghiên cứu

Kết quả phân tích các chỉ tiêu trong sản phẩm rượu vang thốt nốt theo tiêu chuẩn chất

lượng rượu, bia của Việt Nam (TCVN 7045:2002) được trình bày ở bảng 4.1

Bảng 4.1 Kết quả phân tích các chỉ tiêu với các nồng độ xử lý sodium metabisulfite khác nhau (lên men ở nhiệt độ phòng; mật số nấm men 10 5 cfu/ml; pH=4,5; o Bx=24)

Nồng độ Na2S2O5

(%)

Các chỉ tiêu phân tích Hàm

lượng ethanol (%v/v)

Đường sót (%)

Hàm lượng acid (mg acetic/l)

Hàm lượng ester (mg/l)

Hàm lượng methanol (g/l)

Hàm lượng SO2 (mg/l)

pH khi kết thúc lên men

lập là 105 cfu/ml và kết thúc lên men sau 9 ngày Kết quả phân tích cho thấy ở tất cả các chỉ tiêu đều có sự khác biệt so với mẫu đối chứng (ở mức ý nghĩa 5%) Điều này thể hiện hiệu quả về khả năng chống hư hỏng của sodium metabisulfite do các mẫu nước thốt nốt được xử lý ban đầu đều cho chất lượng rượu cao hơn mẫu đối chứng, đặc biệt là hàm lượng ethanol hình thành (13,75 %v/v của mẫu xử lý 0,1% so với 9,13

%v/v của mẫu đối chứng) Nước thốt nốt được bảo quản tốt thì sự hư hỏng không xảy

ra và các chất dinh dưỡng không bị hao hụt, điều này rất quan trọng vì giá trị dinh

dưỡng rượu vang mang lại cho con người từ nguồn vitamin và khoáng chất sẵn có trong nguyên liệu ban đầu

4.1.1 Hàm lượng ethanol của sản phẩm

Kết quả phân tích cho thấy trong các mẫu rượu vang có hàm lượng ethanol hình thành đều có sự khác biệt ý nghĩa thống kê (ở mức 5%) và tỷ lệ thuận với nồng độ xử lý sodium metabisulfite Các mẫu rượu được xử lý sodium metabisulfite 0,1% có hàm lượng ethanol hình thành cao nhất 13,75 (%v/v) và cao hơn so với 12,75 (%v/v) ở nồng độ xử lý 0,05% và 9,13 (%v/v) của mẫu đối chứng Điều này chính là do nước thốt nốt có hàm lượng chất khô hòa tan cao 1315oBx (chủ yếu là saccharose) một nguồn dinh dưỡng lý tưởng cho vi sinh vật phát triển Đặc biệt là nấm men dại sẽ lên men tự nhiên cùng với vi khuẩn lactic, acetic và các vi khuẩn khác cũng sẽ phát triển, chúng là một hệ cạnh tranh và nhanh chóng sử dụng nguồn dinh dưỡng sẵn có trong nước thốt nốt Kết quả là nhiều acid được tạo thành và hàm lượng chất khô hòa tan cũng như các chất dinh dưỡng khác trong nước thốt nốt cũng giảm theo Các chất dinh dưỡng bị giảm đi cùng với hàm lượng acid hình thành trong quá trình phát triển của vi khuẩn và nấm men dại sẽ ảnh hưởng đến hoạt động sống của nấm men phân lập và quá trình lên men, nên mẫu rượu đối chứng có hàm lượng ethanol hình thành thấp 9,13 (%v/v) Hàm lượng ethanol hình thành trong rượu vang được xử lý với các nồng

độ sodium metabisulfite khác nhau được thể hiện ở hình 4.1