Kỹ thuật chuyển gen tế bào động vật

KHÁI NIỆM: - Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmix tái tổ

I KHÁI QUÁT CHUNG:

1 KHÁI NIỆM:

- Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa 1 hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmix tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ,các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen

- Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen được xem là thành công khi gen chuyển vào được tổ hợp vào genome của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp được duy trì ổn định qua các thế hệ con cháu

2 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN

3 MỤC ĐÍCH CHUYỂN GENE:

- Chuyển gen vào các dòng tế bào động vật nuôi để sản xuất protein tái tổ hợp

- Tạo vật nuôi chuyển gen với đặc tính cải tiến mới về các sản phẩm sữa, thịt, lông…

- Biến vật nuôi thành bioreacter sản xuất protein tái tổ hợp

- Tạo vật nuôi chuyển gen “knock out” làm mô hình nguyên cứu về y sinh học các bệnh di truyền

- Chuyển gen liệu pháp nhằm chữa trị các bệnh di truyền (của người)

4 ĐỐI TƯỢNG CHUYỂN GENE:

- Hầu hết các phương pháp chuyển gen đều được phát triển trên mô hình chuột và sau đó chúng được ứng dụng trên gia súc, gia cầm

- Việc chuyển gen thường được thao tác trên:

+ Tế bào trứng đã thụ tinh

+ Tế bào tinh trùng

+ Mô phôi ở giai đoạn sớm

+ Tế bào gốc phôi

II CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GENE:

Gồm các bước cơ bản sau:

- Tách chiết, phân lập gene mong muốn

- Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật

- Tạo cơ sở vật liệu biến nạp gene

- Biến nạp gene tạo phôi đông vật

- Nuôi cấy phôi và cấy truyền hợp tử ( đối với ĐV bậc cao)

- Phân tích đánh giá tính ổn định và sự biểu hiện của gene lạ và tạo ra dòng động vật chuyển gene gốc một cách liên tục

- Sản xuất động vật chuyển gene

Bước 1: Tách chiết, phân lập gene mong muốn:

- Gen ngoại lai trước khi được chuyển vào genome của tế bào vật chủ để tạo ra động vật chuyển gen phải được phân lập và tinh chế(tạo dòng)

- Công cụ sử dụng để tạo dòng:

+ Enzyme cắt và nối DNA (enzyme hạn chế và ligase)

+ Các mẫu dò (probe)

+ Vector

+ Tế bào vật chủ( thường là E.coli)

QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, PHÂN LẬP :

- Cắt DNA mẫu và plasmid được cắt bởi cùng một enzyme hạn chế

- Chèn gene mong muốn vào plasmid Tạo plasmid tái tổ hợp

- Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vật chủ

- Tạo điều kiện thuận lợi cho vật chủ sinh trưởng phát triển

Người ta cũng có thể phân lập được gen mong muốn từ sản phẩm biểu hiện của nó như mRNA hoặc protein

+ Từ mRNA dưới tác động của enzyme sao chép ngược sẽ tổng hợp ra DNA bổ sung mạch đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), tiếp theo là DNA bổ sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA DNA bổ sung (complement DNA- cDNA) này khác với DNA gốc là không chứa các intron mà chỉ bao gồm các exon (Hình 4.2) + Từ sản phẩm protein,có thể suy ra trình tự nucleotid của gen cấu trúc trên cơ sở trình tự các axit amin trong phân

tử protein.Sau đó có thể thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn

Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển

Dạng genome bao gồm tất cả các đoạn exon và intron xuất hiện một cách tự nhiên Các đoạn intron liên quan đến việc cắt ghép mRNA và biểu hiện của gen Dạng cDNA là một trình tự chỉ bao gồm các đoạn exon mã hoá protein của gen

Bước 2 : Tạo tổ hợp gene biểu hiện trong tế bào động vật:

- Các vùng chức năng khác nhau của gen có nguồn gốc từ các loài khác nhau có thể được kết hợp lại với nhau trong ống nghiệm bằng cách sử dụng enzyme hạn chế và ligase

- Bổ sung các trình tự polylinker chứa một số vị trí nhận biết các enzyme hạn chế khác nhau

- Gen chuyển được đi kèm với các trình tự không mã hoá có vai trò điều hoà sự biểu hiện của gen Các yếu tố điều hoà cũng có thể nằm ở trong đoạn intron Yếu tố điều hoà ở gần đầu 5’ của gen là promoter, có vai trò quyết định trong việc điều hoà sự biểu hiện của gen

- Phương pháp chuyển gene trực tiếp:

Chuyển gene nhờ calcium phosphate

Chuyển gene nhờ xung điện

Chuyển gene nhờ vi tiêm

Chuyển gene nhờ liposome,…

- Phương pháp chuyển gene gián tiếp:

Chuyển gene nhờ virus:

+ vector retrovirus ( RNA )

+ vector adenovirus ( DNA sợi kép )

+ vector adeno-associated virus ( DNA sợi đơn )

+ vector herpes simplex virus ( DNA sợi kép )

+ vector baculovirus ( DNA vòng kép ),…

a Phương pháp vi tiêm:

Nguyên tắc:

- Tiêm trực tiếp DNA ngoại lai vào nhân tế bào động vật nhờ dụng cụ vi tiêm với kim tiêm rất mảnh

- Phương pháp này cho kết quả rất cao nhưng số lượng tế bào được xử lý nhỏ do phải thao tác trên từng tế bào

- Thường được dùng để đưa DNA vào hợp tử hoặc các tế bào phôi sớm

- Chuyển gene vào tinh trung hoặc trứng khi đã thụ tinh nhưng chưa kết hợp thành hợp tử lưỡng bội

- Việc chuyển gene chỉ thành công khi gene chuyển vào di truyền cho các thế hệ sau

Qui trình:

- Thiết kế cấu trúc gene chuyển, lựa chọn gene thích hợp và tạo dòng

- Thu nhận trứng đã thu tinh

- Chuẩn bị dung dịch DNA cho vi tiêm, nồng độ từ 1-5 µm/ml

- Chuẩn bị tế bào hợp tử

- Vi tiêm DNA vào tiền nhân

- Chuyển phôi vi tiêm vào cơ thể nhận

- Kiểm tra gene chuyển ở con non Lai tạo để củng cố di truyền

b Chuyển gene nhờ xung điện:

Nguyên tắc:

- Khi trong điện trường có một mật độ tế bào cao và tạo ra một xung điện ( điện cao thế trong một thời gian rất ngắn) lúc đó trên tế bào xuất hiện các lỗ nhỏ

- Qua các lỗ này, DNA có thể đi sâu vào trong tế bào và ở một số tế bào chúng có thể tương tác với genome của tế bào  tế bào chuyển gene

- Máy tạo xung điện có công suất ổn định,điện thế từ 500-1500 v/cm

- Sau mỗi lần thực nghiệm thì có 20-50% tế bào còn sống

Chú ý:

- Các DNA duỗi thẳng cho hiệu quả chuyển gene cao hơn, do khả năng dung hợp với genome của tế bào đích

- Tránh để tế bào dính vào nhau, nên thực hiện trong dung dịch huyền phù đơn

- Cần dùng nhiều DNA và tế bào đơn

- Các tế bào khác nhau thì các thông số sử dụng khác nhau

Chuyển gene nhờ vector retrovirus:

1 Đặc điểm cấu tạo và di truyền của retrovirus:

- Là loại virus RNA, có khả năng xâm nhiễm vào tế bào vật chủ và gắn bộ gene virus vào genome tế bào chủ

- Cấu trúc gồm :

+ Có cấu tạo vỏ gồm: vỏ ngoài cùng glycoprotein, vỏ trong là lipide kép, vỏ trong cùng là capside

+ Phần lõi RNA gồm 2 sợi đồng dạng và các enzyme

+ Enzyme phiên mã ngược ( reverse

Transcriptase ), enzyme cài xen ( integrase ) giúp cho quá trình cài xen bộ gene của virus với genome tế bào vật chủ ở những điểm tương đồng

2 Cơ chế hoạt động của vector:

- RNA của virus được loại bỏ các gene gag, pol, env và thay vào đó là gene cần chuyển

- Vector retrovirus được đưa vào tế bào vật chủ bằng nhiều phương pháp khác nhau

- Khi vào trong tế bào chất thì phần vỏ của vector bị phân hủy, giải phóng RNA

- Enzyme phiên mã ngược xúc tác RNA  cDNA  vào trong nhân tế bào  enzyme cài xen giúp gắn cDNA vào genome tế bào vật chủ  các sản phẩm protein của gene mục tiêu trong tế bào đích

- Bước 5: nuôi cấy phôi trong ống nghiệm

- Tế bào trứng tiền nhân  phôi dâu ( morula ) hoặc túi phôi ( blastocyst )  cấy chuyền vào con nhận được gây chữa giả

Bước 6: Các phương pháp đánh giá động vật sau khi sinh ra từ phôi chuyển gene:

- Southern blot

- Northern blot

- Western blot

- RT-PCR

- Miễn dịch Elisa

- Bước 7: tạo nguồn động vật chuyển gene một cách liên tục

Phương pháp ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay )

1 Nguyên tắc:

- Thông qua sự kết hợp của kháng thể và kháng nguyên trong huyết thanh

- Kháng thể không gắn kháng nguyên sẽ bị rữa trôi

- Nhận biết sự gắn này bằng một cơ chất đặc biệt làm thay đổi màu

3 Ý nghĩa, thuận lợi và khó khăn :

3.1.Ý nghĩa :

a Trong nghiên cứu :

- Tạo niềm tin vững chắc cho khoa học sự sống

- Ứng dụng công nghệ gene trong chọn tạo giống

- Thay cho phương pháp cổ điển trong chọn gióng vật nuôi

b.Trong sản xuất:

- Tạo ra vật nuôi có thể sinh trưởng nhanh, cho chất lượng sản phẩm tốt và số lượng dồi dào

- Đáp ứng được những nhu cầu ngày càng tăng của con người, cả về số lượng và chất lượng

- Đêm lại nguồn thu nhập khổng lồ cho người nông dân từ chăn nuôi (sản lượng thịt, trứng, sữa… tăng, hàm lượng các chất cần thiết tăng, thêm nhiều chất quý… )

3.2.Thuận lợi:

- Thế kỷ 21 là thế kỷ của công nghệ sinh học

- Kiến thức về kỹ thuật di truyền và công nghệ gene ngày càng phong phú, đầy đủ, sự giao lưu khoa học quốc tế giúp các nhà nghiên cứu tiết kiệm được thời gian, công sức và tiền bạc, đồng thời thu được hiệu quả thành công cao hơn 3.3.Khó khăn:

Mỗi cơ thể sinh vật đều có tính ổn định, do đó việc chuyển những gene mong muốn là không hề đơn giản, các nhà khoa học vẫn chưa bằng lòng với những gì đã có được vì chủ yếu chúng vẫn nằm trong điều kiện phòng thí nghiệm, khó ứng dụng đuợc ra sản xuất

SO SÁNH KỸ THUẬT CHUYỂN GENE

Ở VI KHUẨN, ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT

GiỐNG NHAU

• Mục đích tạo ra những sinh vật chuyển gene mang các đặc tính vượt trội hơn những sinh vật trước

đó, phụ thuộc vào mục đích của con người – Như tăng năng suất

– Giảm thiểu ô nhiễm môi trường

– Tạo ra các sản phẩm sinh học ( sản lượng thịt, trứng…)

• Đều dùng các vector chuyển gene

• Đều cần có sự tham gia của các enzyme

• Khả năng tiếp nhận DNA (RNA) đều phụ thuộc vào tế bào nhận và gene cần chuyển

• Sau khi gene được chuyển vào tế bào nhận đều có khả năng phân cắt bởi các enzyme nuclease

• Đều phải tạo dòng gene từ các tế bào cho bằng phương pháp PCR hoặc bằng vi khuẩn

• Đều phụ thuộc vào hoạt động sinh lý của tế bào.

• Tế bào cho không cho toàn bộ NST

• Đều phải thực hiện quá trình chọn lọc dòng

• Đều chịu tác động trực tiếp vào yếu tố con người và các điều kiện chuyển gen

• Các loài sinh vật gần gũi, có nhiều lợi ích cho con người (gà, bò, dê, thuốc lá, ngô, bông…)