Kỹ thuật chuyển gen tế bào động vật

I KHÁI QUÁT CHUNG: KHÁI NIỆM: - Kỹ thuật chuyển gen kỹ thuật đưa hay nhiều gen lạ thiết kế dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ động vật làm cho gen lạ tồn dạng plasmix tái tổ hợp gắn vào gen tế bào chủ Trong tế bào chủ,các gen hoạt động tổng hợp nên protein đặc trưng dẫn tới việc xuất đặc tính thể chuyển gen - Đối với thể nhân chuẩn, việc chuyển gen xem thành công gen chuyển vào tổ hợp vào genome tế bào chủ, đặc tính gen chuyển nạp trì ổn định qua hệ cháu LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN MỤC ĐÍCH CHUYỂN GENE: - Chuyển gen vào dòng tế bào động vật nuôi để sản xuất protein tái tổ hợp - Tạo vật nuôi chuyển gen với đặc tính cải tiến sản phẩm sữa, thịt, lông… - Biến vật nuôi thành bioreacter sản xuất protein tái tổ hợp - Tạo vật nuôi chuyển gen “knock out” làm mô hình nguyên cứu y sinh học bệnh di truyền - Chuyển gen liệu pháp nhằm chữa trị bệnh di truyền (của người) ĐỐI TƯỢNG CHUYỂN GENE: - Hầu hết phương pháp chuyển gen phát triển mô hình chuột sau chúng ứng dụng gia súc, gia cầm - Việc chuyển gen thường thao tác trên: + Tế bào trứng thụ tinh + Tế bào tinh trùng + Mô phôi giai đoạn sớm + Tế bào gốc phôi II CÔNG NGHỆ TẠO ĐỘNG VẬT CHUYỂN GENE: Gồm bước sau: - Tách chiết, phân lập gene mong muốn - Tạo tổ hợp gene biểu tế bào động vật - Tạo sở vật liệu biến nạp gene - Biến nạp gene tạo phôi đông vật - Nuôi cấy phôi cấy truyền hợp tử ( ĐV bậc cao) - Phân tích đánh giá tính ổn định biểu gene lạ tạo dòng động vật chuyển gene gốc cách liên tục - Sản xuất động vật chuyển gene Bước 1: Tách chiết, phân lập gene mong muốn: - Gen ngoại lai trước chuyển vào genome tế bào vật chủ để tạo động vật chuyển gen phải phân lập tinh chế(tạo dòng) - Công cụ sử dụng để tạo dòng: + Enzyme cắt nối DNA (enzyme hạn chế ligase) + Các mẫu dò (probe) + Vector + Tế bào vật chủ( thường E.coli) QUY TRÌNH TÁCH CHIẾT, PHÂN LẬP : - Cắt DNA mẫu plasmid cắt enzyme hạn chế - Chèn gene mong muốn vào plasmid Tạo plasmid tái tổ hợp - Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào vật chủ - Tạo điều kiện thuận lợi cho vật chủ sinh trưởng phát triển Người ta phân lập gen mong muốn từ sản phẩm biểu mRNA protein + Từ mRNA tác động enzyme chép ngược tổng hợp DNA bổ sung mạch đơn (single strand complement DNA-ss cDNA), DNA bổ sung mạch kép (double strand complement DNA- ds cDNA DNA bổ sung (complement DNA- cDNA) khác với DNA gốc không chứa intron mà bao gồm exon (Hình 4.2) + Từ sản phẩm protein,có thể suy trình tự nucleotid gen cấu trúc sở trình tự axit amin phân tử protein.Sau thiết kế cặp mồi (primer) để dò tìm đoạn gen mong muốn Hình 4.2: So sánh hai dạng gen chuyển Dạng genome bao gồm tất đoạn exon intron xuất cách tự nhiên Các đoạn intron liên quan đến việc cắt ghép mRNA biểu gen Dạng cDNA trình tự bao gồm đoạn exon mã hoá protein gen Bước : Tạo tổ hợp gene biểu tế bào động vật: - Các vùng chức khác gen có nguồn gốc từ loài khác kết hợp lại với ống nghiệm cách sử dụng enzyme hạn chế ligase - Bổ sung trình tự polylinker chứa số vị trí nhận biết enzyme hạn chế khác - Gen chuyển kèm với trình tự không mã hoá có vai trò điều hoà biểu gen Các yếu tố điều hoà nằm đoạn intron Yếu tố điều hoà gần đầu 5’ gen promoter, có vai trò định việc điều hoà biểu gen - Phương pháp chuyển gene trực tiếp: Chuyển gene nhờ calcium phosphate Chuyển gene nhờ xung điện Chuyển gene nhờ vi tiêm Chuyển gene nhờ liposome,… - Phương pháp chuyển gene gián tiếp: Chuyển gene nhờ virus: + vector retrovirus ( RNA ) + vector adenovirus ( DNA sợi kép ) + vector adeno-associated virus ( DNA sợi đơn ) + vector herpes simplex virus ( DNA sợi kép ) + vector baculovirus ( DNA vòng kép ),… a Phương pháp vi tiêm: Nguyên tắc: - Tiêm trực tiếp DNA ngoại lai vào nhân tế bào động vật nhờ dụng cụ vi tiêm với kim tiêm mảnh - Phương pháp cho kết cao số lượng tế bào xử lý nhỏ phải thao tác tế bào - Thường dùng để đưa DNA vào hợp tử tế bào phôi sớm - Chuyển gene vào tinh trung trứng thụ tinh chưa kết hợp thành hợp tử lưỡng bội - Việc chuyển gene thành công gene chuyển vào di truyền cho hệ sau - Thiết kế cấu trúc gene chuyển, lựa chọn gene thích hợp tạo dòng - Thu nhận trứng thu tinh - Chuẩn bị dung dịch DNA cho vi tiêm, nồng độ từ 1-5 µm/ml - Chuẩn bị tế bào hợp tử - Vi tiêm DNA vào tiền nhân - Chuyển phôi vi tiêm vào thể nhận - Kiểm tra gene chuyển non Lai tạo để củng cố di truyền Qui trình: b Chuyển gene nhờ xung điện: Nguyên tắc: - Khi điện trường có mật độ tế bào cao tạo xung điện ( điện cao thời gian ngắn) lúc tế bào xuất lỗ nhỏ - Qua lỗ này, DNA sâu vào tế bào số tế bào chúng tương tác với genome tế bào  tế bào chuyển gene - Máy tạo xung điện có công suất ổn định,điện từ 500-1500 v/cm - Sau lần thực nghiệm có 20-50% tế bào sống - Các DNA duỗi thẳng cho hiệu chuyển gene cao hơn, khả dung hợp với genome tế bào đích - Tránh để tế bào dính vào nhau, nên thực dung dịch huyền phù đơn - Cần dùng nhiều DNA tế bào đơn - Các tế bào khác thông số sử dụng khác Chú ý: Chuyển gene nhờ vector retrovirus: Đặc điểm cấu tạo di truyền retrovirus: - Là loại virus RNA, có khả xâm nhiễm vào tế bào vật chủ gắn gene virus vào genome tế bào chủ - Cấu trúc gồm : + Có cấu tạo vỏ gồm: vỏ glycoprotein, vỏ lipide kép, vỏ capside + Phần lõi RNA gồm sợi đồng dạng enzyme + Enzyme phiên mã ngược ( reverse Transcriptase ), enzyme cài xen ( integrase ) giúp cho trình cài xen gene virus với genome tế bào vật chủ điểm tương đồng 2 Cơ chế hoạt động vector: - RNA virus loại bỏ gene gag, pol, env thay vào gene cần chuyển - Vector retrovirus đưa vào tế bào vật chủ nhiều phương pháp khác - Khi vào tế bào chất phần vỏ vector bị phân hủy, giải phóng RNA - Enzyme phiên mã ngược xúc tác RNA  cDNA  vào nhân tế bào  enzyme cài xen giúp gắn cDNA vào genome tế bào vật chủ  sản phẩm protein gene mục tiêu tế bào đích - Bước 5: nuôi cấy phôi ống nghiệm - Tế bào trứng tiền nhân  phôi dâu ( morula ) túi phôi ( blastocyst )  cấy chuyền vào nhận gây chữa giả Bước 6: Các phương pháp đánh giá động vật sau sinh từ phôi chuyển gene: - Southern blot - Northern blot - Western blot - PCR - RT-PCR - Miễn dịch Elisa - Bước 7: tạo nguồn động vật chuyển gene cách liên tục Phương pháp ELISA ( enzyme linked immunosorbent assay ) Nguyên tắc: - Thông qua kết hợp kháng thể kháng nguyên huyết - Kháng thể không gắn kháng nguyên bị rữa trôi - Nhận biết gắn chất đặc biệt làm thay đổi màu Ý nghĩa, thuận lợi khó khăn : 3.1.Ý nghĩa : a Trong nghiên cứu : - Tạo niềm tin vững cho khoa học sống - Ứng dụng công nghệ gene chọn tạo giống - Thay cho phương pháp cổ điển chọn gióng vật nuôi b.Trong sản xuất: - Tạo vật nuôi sinh trưởng nhanh, cho chất lượng sản phẩm tốt số lượng dồi - Đáp ứng nhu cầu ngày tăng người, số lượng chất lượng - Đêm lại nguồn thu nhập khổng lồ cho người nông dân từ chăn nuôi (sản lượng thịt, trứng, sữa… tăng, hàm lượng chất cần thiết tăng, thêm nhiều chất quý… ) 3.2.Thuận lợi: - Thế kỷ 21 kỷ công nghệ sinh học - Kiến thức kỹ thuật di truyền công nghệ gene ngày phong phú, đầy đủ, giao lưu khoa học quốc tế giúp nhà nghiên cứu tiết kiệm thời gian, công sức tiền bạc, đồng thời thu hiệu thành công cao 3.3.Khó khăn: Mỗi thể sinh vật có tính ổn định, việc chuyển gene mong muốn không đơn giản, nhà khoa học chưa lòng với có chủ yếu chúng nằm điều kiện phòng thí nghiệm, khó ứng dụng đuợc sản xuất SO SÁNH KỸ THUẬT CHUYỂN GENE Ở VI KHUẨN, ĐỘNG VẬT VÀ THỰC VẬT GiỐNG NHAU • Mục đích tạo sinh vật chuyển gene mang đặc tính vượt trội sinh vật trước đó, phụ thuộc vào mục đích người – Như tăng suất – Giảm thiểu ô nhiễm môi trường – Tạo sản phẩm sinh học ( sản lượng thịt, trứng…) • Đều dùng vector chuyển gene • Đều cần có tham gia enzyme • Khả tiếp nhận DNA (RNA) phụ thuộc vào tế bào nhận gene cần chuyển • Sau gene chuyển vào tế bào nhận có khả phân cắt enzyme nuclease • Đều phải tạo dòng gene từ tế bào cho phương pháp PCR vi khuẩn • Đều phụ thuộc vào hoạt động sinh lý tế bào • Tế bào cho không cho toàn NST • Đều phải thực trình chọn lọc dòng • Đều chịu tác động trực tiếp vào yếu tố người điều kiện chuyển gen • Các loài sinh vật gần gũi, có nhiều lợi ích cho người (gà, bò, dê, thuốc lá, ngô, bông…) ...- Sản xuất động vật chuyển gene Bước 1: Tách chiết, phân lập gene mong muốn: - Gen ngoại lai trước chuyển vào genome tế bào vật chủ để tạo động vật chuyển gen phải phân lập tinh chế(tạo... trường có mật độ tế bào cao tạo xung điện ( điện cao thời gian ngắn) lúc tế bào xuất lỗ nhỏ - Qua lỗ này, DNA sâu vào tế bào số tế bào chúng tương tác với genome tế bào  tế bào chuyển gene - Máy tạo... pháp chuyển gene trực tiếp: Chuyển gene nhờ calcium phosphate Chuyển gene nhờ xung điện Chuyển gene nhờ vi tiêm Chuyển gene nhờ liposome,… - Phương pháp chuyển gene gián tiếp: Chuyển gene