Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm tối ưu hóa quy trình nhuộm rửa và cố định mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm xếp loại miễn dịch bằng kỹ thuật phân tích tế bào (TB) dòng chảy. Phương pháp: thử nghiệm các quy trình xếp loại theo kiểu hình miễn dịch của các labo khác nhau, phát hiện các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình xử lý mẫu bệnh phẩm, cải tiến bước xử lý phù hợp. Sau đó hoàn thiện và thử nghiệm quy trình hoàn chỉnh.
TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƢỞNG CỦA QUY TRÌNH NHUỘM RỬA VÀ CỐ ĐỊNH MẪU BỆNH PHẨM ĐẾN VIỆC HOÀN THIỆN XÉT NGHIỆM XẾP LOẠI MIỄN DỊCH BẰNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÕNG CHẢY Lê Xuân Hải*; Nguyễn Triệu Vân* TÓM TẮT Mục tiêu: tối ưu hóa quy trình nhuộm rửa cố định mẫu bệnh phẩm làm xét nghiệm xếp loại miễn dịch kỹ thu t phân tích tế bào (TB) dòng chảy Phương pháp: thử nghiệm quy trình xếp loại theo kiểu hình miễn dịch labo khác nhau, phát yếu tố ảnh hưởng đến trình xử lý mẫu bệnh phẩm, cải tiến bước xử lý phù hợp Sau hồn thiện thử nghiệm quy trình hồn chỉnh Kết quả: tìm bước cần cải tiến quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm để cải thiện chất lượng xét nghiệm như: phá hồng cầu trước ủ kháng thể; rửa bỏ kháng thể thừa trước phân tích; sử d ng dung dịch cố định bảo quản TB Kết luận: để tăng cường chất lượng xét nghiệm xếp loại miễn dịch phương pháp TB dòng chảy cần áp d ng số thay đổi quy trình nhuộm rửa, cố định bảo quản mẫu * Từ khóa: Bệnh bạch cầu; Xếp loại kiểu hình miễn dịch; Đếm tế bào dòng chảy Study on Affecting Factors of Staining, Washing and Fixing of Blood Samples to Complete Immmunophenotyping by Flow Cytometry Technic Summary Objectives: To optimize the process of staining, washing and fixing of samples that are used in immunophenotyping by flow cytometry Methods: To perform the procedure of immunophenotyping in various samples to identify factors affecting the procedure of handling samples and the completed procedure is developed and tested afterward Results: some improvements in the procedure help enhance the test quality including lysing erythrocytes before incubating, washing off excess antibodies before testing, fixing and preserving procedure Conclusion: It is needed to apply some improvement in staining, washing, fixing and preserving sample procedure for ensuring a good sample quality of immunophenotyping * Key words: Leukemia; Immunophenotyping; Flow cytometry ĐẶT VẤN ĐỀ Bệnh bạch cầu cấp (BCC) (Lơ-xê-mi cấp) bệnh ung thư máu thường gặp chuyên khoa huyết học TB ung thư phát triển từ TB gốc tạo máu chưa biệt hóa TB biệt hóa thành dòng tủy dòng lympho * Viện Huyết học - Truyền máu Trung ương Người phản hồi (Corresponding): Lê Xuân Hai (hailexuan@yahoo.com) Ngày nhận bài: 20/12/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 16/03/2016 Ngày báo đăng: 23/03/2016 84 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 Việc xác định xác dòng TB, giai đoạn phát triển TB có giá trị chẩn đốn, theo dõi, tiên lượng, xếp loại lựa chọn phác đồ u trị phù hợp Trước năm 1976, việc chẩn đốn xếp loại bệnh BCC hồn tồn dựa vào hình thái học hóa học TB theo tiêu chuẩn FAB Cuối th p kỷ 1990, WHO công nh n dấu ấn miễn dịch TB tiêu chuẩn chẩn đoán bắt buộc, h trợ xếp loại xác bệnh lý tăng sinh ác tính có liên quan đến TB tạo máu Ngày nay, giới, việc nh n biết dấu ấn miễn dịch TB kỹ thu t TB dòng chảy trở thành xét nghiệm thường quy nhằm h trợ xác định xác dòng TB ác tính xếp loại nhóm bệnh, góp phần định hướng u trị tiên lượng bệnh trước u trị Việc áp d ng kỹ thu t Việt Nam tiến hành vài năm, nhiên kỹ thu t xét nghiệm có độ đặc hiệu đòi hỏi độ xác cao, dễ dẫn tới dương tính giả âm tính giả thao tác khơng phù hợp Vì v y, khía cạnh quan trọng kỹ thu t TB dòng chảy tìm quy trình xét nghiệm ổn định nhất, phù hợp u kiện c thể m i phòng xét nghiệm Chúng tơi thực nghiên cứu với m c tiêu: Phát số yếu tố ảnh hưởng quy tr nh nhuộm, r a cố định mẫu bệnh phẩm nhằm cải tiến hoàn thiện xét nghiệm xếp loại theo kiểu h nh miễn dịch BCC phương pháp phân tích TB dòng chảy ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣ ng nghiên cứu Các quy trình xử lý bệnh phẩm làm xét nghiệm xếp loại miễn dịch công bố giới Phƣơng pháp nghiên cứu * Thiết lập quy tr nh xếp loại miễn dịch sơ cho bệnh BCC: Dựa tài liệu nhóm nghiên cứu khác v xếp loại miễn dịch bệnh BCC dựa panel xếp loại BCC tham khảo từ Hội nghị Quốc tế, đồng nghiệp ngồi nước, chúng tơi tiến hành xây dựng quy trình xét nghiệm xếp loại miễn dịch sơ * Áp dụng sơ quy tr nh xếp loại miễn dịch xét nghiệm thực tế: Dựa quy trình xét nghiệm thiết l p, tiến hành áp d ng thực tế Tổng kết mặt ưu điểm hạn chế kết thu * Hoàn thiện quy tr nh xét nghiệm xếp loại miễn dịch: Dựa kết thu sau áp d ng, tiến hành số u chỉnh quy trình, có so sánh trước sau thay đổi để đưa nh n định: - So sánh ly giải hồng cầu trước ủ kháng thể với ly giải hồng cầu sau ủ kháng thể - Rửa mẫu so với không rửa mẫu sau ủ với kháng thể - So sánh sử d ng dung dịch cố định TB để bảo quản TB với không sử d ng dung dịch bảo quản TB * Thu thập kết quả, so sánh đánh giá kết thu được: - Thu th p kết có xếp loại miễn dịch theo quy trình ban đầu quy trình có sửa đổi 85 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 - Đánh giá, so sánh kết thực quy trình ban đầu với kết thực với quy trình có thay đổi bước định - Thống áp d ng số thay đổi có hiệu để có quy trình tối ưu * Vật liệu nghiên cứu: - Bệnh phẩm nghiên cứu: 10 mẫu máu ngoại vi chống đông EDTA 10 người khỏe mạnh (m i mẫu ml) - Hóa chất, sinh phẩm: dung dịch PBS, dung dịch phá hồng cầu NH4Cl, dung dịch formaldehyde 40%, sodium azide dạng bột, huyết bào thai bê, kháng thể gắn chất màu hu nh quang - Thực máy đếm TB dòng chảy Navious (Hãng Beckmann Coulter) KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Xây dựng quy trình sơ b cho xét nghiệm xếp loại miễn dịch BCC Qua tham khảo quy trình xử lý mẫu xét nghiệm xếp loại miễn dịch tài liệu khác giới [2, 3, 4, 5], nh n thấy số điểm chung sau: - Mẫu sử d ng xếp loại miễn dịch máu dịch hút tủy xương chống đông EDTA Với kiện trên, chúng tơi xây dựng quy trình sơ dùng cho xử lý mẫu xét nghiệm xếp loại kiểu hình miễn dịch sau: Bước 1: chuẩn bị bệnh phẩm (tủy xương máu toàn phần), kháng thể pha sẵn, dung dịch PBS 1X, dung dịch lysing, ống xét nghiệm, pipet, đầu côn, máy Vortex Bước 2: thêm 10 μl m i kháng thể tương ứng vào ống nghiệm Bước 3: hút 100 μl bệnh phẩm vào ống xét nghiệm, trộn đ u máy Vortex Bước 4: ủ h n hợp u kiện tối, 40C 30 phút Bước 5: thêm ml dung dịch ly giải hồng cầu vào ống nghiệm Bước 6: tiếp t c ủ 10 phút Bước 7: trộn đ u ống nghiệm máy Vortex, đưa ống nghiệm vào máy đọc kết Áp dụng thử nghiệm quy trình xét nghiệm xếp loại iểu hình miễn dịch Với quy trình xét nghiệm sơ trên, áp d ng hệ thống máy Navious-Beckman Coulter với 10 bệnh phẩm người bình thường, dấu ấn miễn dịch phối hợp sau: - Dung dịch phá hồng cầu NH4Cl HLA-DRFITC - CD34PE - CD45ECD - Dung dịch pha loãng bệnh phẩm PBS CD13FITC - CD33PE - CD45ECD - Bệnh phẩm cần ủ với kháng thể u kiện tối, nhiệt độ 40C 30 phút để đảm bảo gắn kết hoàn toàn 86 - Ly tâm tốc độ 500 g/5 phút để thu cặn loại bỏ dịch chứa kháng thể thừa CD3FITC - CD19PE - CD45ECD - CD2PC5 CD15FITC - CD117PE - CD45ECD CD20FITC - CD22PE - CD45ECD TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 Phân tích kết thu nhuộm dấu ấn với bệnh phẩm dựa quần thể TB khẳng định tính xác kháng ngun biểu hiện, quần thể dòng hạt dương tính mạnh với CD15, CD13, CD33; quần thể lympho dương tính với CD2, CD3, CD19, HLA-DR, CD20, CD22; quần thể mono dương tính với HLA-DR, CD33; dấu ấn đặc trưng m i dòng âm tính dòng lại (ví d : CD19 âm tính dòng hạt, CD15 âm tính dòng lympho) Kết bước đầu sau: Dương tính giả: 3/10 mẫu (30%); âm tính giả: mẫu (0%) Quy trình xét nghiệm đảm bảo khả gắn kháng thể lên b mặt TB với tỷ lệ âm tính giả 0% Tuy nhiên, tỷ lệ dương tính giả dấu ấn cao, tới 30%, kháng thể thừa bám không đặc hiệu b mặt TB Bên cạnh đó, số vấn đ liên quan đến xử lý mẫu tượng cặn xơ, hạt mỡ, hồng cầu tồn đọng gây tắc kim gây nhiễu q trình phân tích Hồn thiện quy trình xếp loại iểu hình miễn dịch * Ly giải hồng cầu: Qua áp d ng sơ quy trình ban đầu, chúng tơi nh n thấy việc ly giải hồng cầu cuối quy trình khơng đảm bảo chất lượng xét nghiệm Với cách ly giải hồng cầu này, ống mẫu tồn dư nhi u cặn xơ, hạt mỡ, cửa sổ phân tích lẫn nhi u quần thể rác hồng cầu chưa tan hoàn toàn lẫn vào TB có nhân, dễ dẫn đến sai lệch kết Một số phòng xét nghiệm giới áp d ng phương pháp ly giải hồng cầu, thu cặn bạch cầu trước ủ kháng thể Phương pháp giúp tránh ảnh hưởng hóa chất ly giải hồng cầu kháng thể sau ủ Chúng tơi cải tiến quy trình cách chuyển bước ly giải hồng cầu vào trước thu cặn bạch cầu để ủ với kháng thể So sánh hiệu quy trình với quy trình nêu trước đó, kết sau: Bảng 1: So sánh kết quy trình ly giải hồng cầu trước sau ủ Ly giải hồng cầu sau hi ủ (n = 10) Ly giải hồng cầu trƣớc hi ủ (n = 10) Hạt mỡ ống xét nghiệm 10/10 (100%) 0/10 (0%) Cặn, xơ ống xét nghiệm 8/10 (80%) 0/10 (0%) Nhi u Ít 1/10 (10%) 0/10 (0%) Quần thể mảnh vỡ hồng cầu, cặn bẩn phân tích máy Hiện tượng tắc kim chạy máy Việc phá hồng cầu trước ủ bệnh phẩm với kháng thể giúp loại bỏ cặn bẩn, hạt mỡ ống xét nghiệm Đi u cải thiện chất lượng bệnh phẩm phân tích máy, khơng bị lẫn mảnh hồng cầu tồn dư rác với TB có nhân Ngồi ra, việc phá hồng cầu trước ủ cải thiện tượng tắc kim chạy máy 87 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 * R a bệnh phẩm sau ủ kháng thể: Một nguyên nhân khác gây nên tượng dương tính giả phân tích TB dòng chảy thừa kháng thể trình ủ Khi lượng kháng thể thừa so với số TB đưa vào, chúng bám khơng đặc hiệu lên TB với lực thấp cho tín hiệu dương tính cảm biến máy đếm, gây sai lệch kết Để giải vấn đ này, bổ sung bước rửa bệnh phẩm sau ủ cách: thêm ml PBS vào h n hợp sau ủ, ly tâm 500 g/5 phút, hút dịch tái huy n dịch lại ml PBS Bảng 2: So sánh kết quy trình có rửa khơng rửa kháng thể Tỷ lệ dương tính giả Mức độ t p trung tín hiệu phân tích Kh ng rửa háng thể Có rửa háng thể 4/10 (40%*) 0/10 (0%) Phân tán T p trung (* Các dấu ấn thường có tượng dương tính giả gồm CD22, CD20, CD15) Việc rửa kháng thể thừa sau ủ với bệnh phẩm bước quan trọng, giúp tối ưu hóa kết phân tích máy đếm TB dòng chảy Qua bước cải tiến trên, chúng tơi đưa quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm xếp loại kiểu hình miễn dịch hồn thiện sau: - Kỹ thu t xử lý mẫu trước xếp loại kiểu hình miễn dịch: Bước 1: chuẩn bị bệnh phẩm (tủy xương máu toàn phần), kháng thể pha sẵn, dung dịch PBS 1X, dung dịch ly giải hồng cầu, ống xét nghiệm, pipet, đầu côn, máy Vortex 88 Bước 2: ủ bệnh phẩm với dung dịch ly giải theo tỷ lệ 1/15 10 phút Bước 3: ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn bạch cầu Bước 4: tái huy n dịch cặn ml dung dịch PBS 1X Bước 5: ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn bạch cầu - Kỹ thu t ủ kháng thể xếp loại kiểu hình miễn dịch: Bước 1: tái huy n dịch cặn dung dịch PBS 1X, pha loãng đảm bảo nồng độ 106 bạch cầu/μl dung dịch (theo số đếm bạch cầu) Bước 2: thêm 10 μl m i kháng thể tương ứng vào ống nghiệm Bước 3: hút 100 μl dung dịch bạch cầu chuẩn bị vào ống xét nghiệm, trộn đ u máy Vortex Bước 4: ủ h n hợp u kiện tối, 40C 30 phút Bước 5: thêm ml PBS vào h n hợp sau ủ, ly tâm 500 g/5 phút, bỏ dịch nổi, thu cặn bạch cầu gắn kháng thể Bước 6: thêm ml dung dịch PBS 1X vào ống nghiệm, trộn đ u máy Vortex, đọc kết sau chạy máy * Bảo quản bệnh phẩm dung dịch cố định TB: Một vấn đ khó khăn bệnh phẩm lưu giữ vòng 48 Sau thời gian này, TB có xu hướng thối hóa, vón t lại khơng đảm bảo tính xác phân tích Vì v y, áp d ng phương pháp bảo quản bệnh phẩm cách sử d ng dung dịch cố định TB dung dịch bảo quản TB pha chế theo công thức tham khảo từ nhi u tài liệu nghiên cứu TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 Dung dịch cố định TB: thành phần gồm có formaldehyde 1% pha dung dịch PBS Bước 3: thêm ml dung dịch bảo quản, ly tâm tốc độ 500 g/5 phút, hút dịch nổi, giữ lại cặn Dung dịch bảo quản TB: thành phần gồm có sodium azide 1%, huyết bào thai bê 10% pha dung dịch PBS Bước 4: thêm ml dung dịch cố định, ủ 15 - 30 phút, 4oC * Kỹ thuật cố định bảo quản bệnh phẩm: Bước 1: chuẩn bị ống nghiệm chứa 10 bạch cầu xử lý phá hồng cầu, dung dịch cố định, dung dịch bảo quản Bước 2: ly tâm ống có bệnh phẩm, tốc độ 500 g/5 phút, hút dịch nổi, giữ lại cặn Bước 5: ly tâm tốc độ 500 g/5 phút, hút dịch nổi, giữ lại cặn Bước 6: thêm ml dung dịch bảo quản, ly tâm tốc độ 500 g/5 phút, hút dịch nổi, giữ lại cặn Bước 7: tái huy n dịch ml dung dịch bảo quản, lưu nhiệt độ oC, u kiện tối Bảng 3: So sánh chất lượng mẫu xếp loại kiểu hình miễn dịch có bảo quản khơng bảo quản Kh ng xử lý bảo quản Có xử lý bảo quản 24 ngày Tình trạng TB ống chứa mẫu sau 48 Đơng vón (10/10) TB phân tán đ u huy n dịch (10/10) M t độ TB Nghèo TB (9/10) Giàu TB (10/10) Phân tách quần thể Không phân tách (4/10) Phân tách tốt (10/10) Tín hiệu dấu ấn Hầu hết âm tính (4/10) Kết âm tính dương tính xác (10/10) M t độ TB Nghèo TB Giàu TB Phân tách quần thể Không phân tách (10/10) Phân tách tổt Tín hiệu dấu ấn Âm tính (9/10) Kết âm tính dương tính xác (10/10) M t độ TB Nghèo TB (10/10) Giàu TB (9/10) Phân tách quần thể Không phân tách (10/10) Phân tách tốt (10/10) Tín hiệu dấu ấn Âm tính (10/10) Kết âm tính dương tính xác (10/10) Thời gian lưu giữ tối đa 48 Phân tích xếp loại kiểu hình miễn dịch 96 ngày Như v y, việc áp d ng quy trình bảo quản TB giúp lưu giữ bệnh phẩm thời gian dài mà đảm bảo chất lượng Đây yếu tố quan trọng nhi u trường hợp bệnh nhân cần lưu bệnh phẩm để phân tích vòng với dấu ấn đặc hiệu, quy trình bảo quản TB giúp giải tốt vấn đ 89 TẠP CHÍ Y - DƢỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 4-2016 * Quy tr nh xếp loại miễn dịch hoàn chỉnh: Qua bước hồn thiện trên, chúng tơi thiết l p quy trình phân loại miễn dịch hồn chỉnh bao gồm bước sau: - Các cải tiến then chốt quy trình gồm: ly giải hồng cầu trước ủ kháng thể, rửa bỏ kháng thể thừa trước phân tích máy TB dòng chảy, áp d ng dung dịch cố định bảo quản TB - Bước xử lý mẫu bệnh phẩm ly giải hồng cầu TÀI LIỆU THAM KHẢO - Bước ủ rửa kháng thể trước phân loại miễn dịch Polysciences, Inc Flow-Fix, 1% Flow Fix paraformaldehyde Fixative Kit Technical data Sheet 2011, 810, pp.1-4 - Bước cố định bảo quản bệnh phẩm KẾT LUẬN Thông qua thử nghiệm, hoàn thiện kết thu ứng d ng quy trình xếp loại kiểu hình miễn dịch, rút kết lu n: - Đã xây dựng thành cơng quy trình xử lý mẫu bệnh phẩm dùng cho xét nghiệm xếp loại kiểu hình miễn dịch 90 Santa Cruz Biotechnology, Inc Flow cytometry protocol 2012, pp.1-3 eBioscience Cell preparation for flow cytometry Flow Cytometry - Best protocols 2013, pp.1-3 eBioscience Staining cell surface antigen for flow cytometry Flow Cytometry - Best protocols 2013, pp.1-5 eBioscience RBC lysis Flow Cytometry Best protocols 2013, pp.1-4 ... cố định mẫu bệnh phẩm nhằm cải tiến hoàn thiện xét nghiệm xếp loại theo kiểu h nh miễn dịch BCC phương pháp phân tích TB dòng chảy ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣ ng nghiên cứu Các quy. .. trình xử lý bệnh phẩm làm xét nghiệm xếp loại miễn dịch công bố giới Phƣơng pháp nghiên cứu * Thiết lập quy tr nh xếp loại miễn dịch sơ cho bệnh BCC: Dựa tài liệu nhóm nghiên cứu khác v xếp loại. .. nh xếp loại miễn dịch xét nghiệm thực tế: Dựa quy trình xét nghiệm thiết l p, tiến hành áp d ng thực tế Tổng kết mặt ưu điểm hạn chế kết thu * Hoàn thiện quy tr nh xét nghiệm xếp loại miễn dịch: