FLOWCYTOMETRE Kỹ thuật phân tích tế bào dòng chảy (FC)

NGuyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy Thao tác nhuộm tế bào cho máy tế bào dòng chảy ứng dụng máy tế bào dòng chảy vào bệnh bạch cầu cấp Có đường link hướng dẫn dùng phần mềm FC Tài liệu chính thống, chọn lọc, có nguồn rõ ràng đáng tin cậy, thực hành thực tế.

MỤC LỤC

THUẬT NGỮ SỬ DỤNG Thuật ngữ chuyên ngành

Compensation : Chạy chuẩn máy, thiết lập bù trừ quang phổ tự động

CS&T (Cytometer Setup and Tracking) : Thiết lập điều kiện chuẩn máy.Blast cell: Tế bào non

Erythroblast: Các nguyên hồng cầu nói chung là những hồng cầu non có nhân chỉ ở trong tủy xương tạo máu, bình thường không ở máu ngoại vi

Megacaryoblast: Nguyên mẫu tiểu cầu.

Monoblast: Nguyên bạch cầu mono đơn nhân.

Lymphoblast: Nguyên bạch cầu lympho

CD (Cluster of differentiation: nhóm biệt hóa): kháng thể đặc hiệu

AL (Acute Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp

AML (Acute Myeloid Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp dòng tủy

ALL (Acute lymphoblastic Leukemia): Bệnh bạch cầu cấp dòng lympho

Các chữ viết tắt

RPM: Tốc độ ly tâm (vòng/phút)

FC: Flow Cytometry ( Phân tích tế bào dòng chảy)

BCC: Bạch cầu cấp

DAMDTB: Dấu ấn miễn dịch tế bào

FC: Máy đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry)

FITC: Fluorescein Isothiocyanante

PE: Phycoerythrin

PerCP: Peridin chlorophyll

PE-Cy7: Phycoerythrin-cyanine 7

APC: Allophycocyanin

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN VỀ ĐƠN VỊ THỰC TẬP

BỆNH VIỆN UNG BƯỚU ĐÀ NẴNG

1.Bệnh viện ung bướu Đà Nẵng – bệnh viện ung bướu lớn nhất nước mang dấu ấn ông Nguyễn Bá Thanh.

1.1. Giới thiệu chung

Bệnh viện ung bướu Đà Nẵng được đánh giá lớn nhất cả nước không chỉ quy môgiường bệnh, công tác khám và điều trị mà còn bởi quang cảnh sạch đẹp, hiện đại

Ngày 28/3/2009, Bệnh viện ung thư Đà Nẵng khởi công xây dựng trên diện

tích 15 ha tại phường Hoà Minh, quận Liên Chiểu (Đà Nẵng) Gần 4 năm sau, bệnh viện này chính thức tiếp nhận khám chữa cho bệnh nhân ung thư tại khu vực miền Trung Chính thức từ ngày 1/9/2015 bệnh viện ung thư Đà Nẵng đổi tên thành bệnh viện ung bướu Đà Nẵng và trực thuộc sở y tế thành phố Đà Nẵng.

Với tổng kinh phí 1.500 tỷ đồng từ các tổ chức, cá nhân có tấm lòng hảo tâm,cùng với nguồn từ xổ số kiến thiết của thành phố và hỗ trợ của Chính phủ, dự ánđược cho là có công lớn của Nguyên Bí thư Nguyễn Bá Thanh với lời kêu gọi ủng

hộ đầy tâm huyết của ông

Chức năng chính của bệnh viện là tiếp nhận khám và phát hiện sớm bệnhnhân ung thư, chẩn đoán chính xác điều trị có hiệu quả mọi bệnh lý ung thư, dựphòng bệnh ung thư cho nhân dân thành phố Đà Nẵng và khu vực miền Trung, triểnkhai các chương trình nghiên cứu khoa học công nghệ và tham gia đào tạo nhân lựcchuyên ngành

Bệnh viện được đánh giá là lớn nhất cả nước không chỉ quy mô giường bệnh,công tác khám và điều trị mà bởi quang cảnh sạch đẹp, hiện đại

Tổng diện tích sàn bệnh viện là 60.000 m2, đạt 120 m2 mỗi giường bệnh, thiết kếtheo mô hình bệnh viện khách sạn với cảnh quan hài hòa, tiện nghi và thân thiện,không gian xanh bao phủ khắp nơi Quy mô 500 giường bệnh điều trị và nội trú

Cụ Lê Thị Bốn 83 tuổi (ngụ tại huyện Đại Lộc, tỉnh Quảng Nam) điều trị ungthư gan tại Khoa chăm sóc điều trị và giảm nhẹ của bệnh viện hơn 3 tháng nay

Nguyễn Thị Á, cho biết tình trạng bệnh của mẹ chồng chị đã thuyên giảm, sức khoẻcũng đã tốt lên nhiều Bệnh nhân có bảo hiểm y tế và bệnh nhân khám chữa bệnhtheo yêu cầu đều được đón nhận khám chữa và điều trị như nhau.

Với các thiết bị chẩn đoán hình ảnh hiện đại nhất hiện nay tại Việt Nam nhưmáy MRI 3,0 Tesla (cả nước chỉ có 3 chiếc), CT-scan 128 lát , người bệnh đãkhông còn phải cất công chuyển ra Hà Nội hoặc TP HCM để kiểm tra như trước đó

Với 76 bác sĩ chuyên khoa, trong đó 82% bác sĩ có trình độ từ thạc sĩ yhọc/BS chuyên khoa 1 trở lên, trong đó có 2 giáo sư và phó giáo sư y học, 8 tiến sĩ

y học và BS chuyên khoa II, 9 BS nội trú, 43 thạc sĩ y học và BS chuyên khoa I,mọi bệnh nhân đều được đảm bảo điều trị và chăm sóc tốt nhất có thể

1.2. Các bộ phận hoạt động

1.2.1 Các phòng chức năng: 08 phòng

1 Phòng Hành chính quản trị;

2 Phòng Tổ chức cán bộ;

3 Phòng Kế hoạch tổng hợp;

4 Phòng Tài chính kế toán;

5 Phòng Công nghệ thông tin;

6 Phòng Điều dưỡng;

7 Phòng Chỉ đạo tuyến và quản lý chất lượng bệnh viện;

8 Phòng Vật tư, trang thiết bị y tế

6 Khoa Gây mê hồi sức;

7 Khoa Ngoại 1 (Tiêu hóa, tiết niệu, sinh dục nam, mô mềm);

8 Khoa Ngoại 2 (Thần kinh, đầu cổ, lồng ngực);

9 Khoa Ngoại 3 (Vú và phụ khoa);

14 Khoa Nội soi và thăm dò chức năng;

15 Khoa Kiểm soát nhiễm khuẩn;

16 Khoa Xét nghiệm - Truyền máu;

17 Khoa Giải phẫu bệnh;

2.1. Tên đơn vị, địa chỉ, điện thoại liên hệ:

Khoa Xét nghiệm - Truyền máu được thành lập từ ngày 28/08/2015 theo quyếtđịnh thành lập bệnh viện Ung bướu Đà Nẵng của UBND TP.Đà Nẵng Trên cơ sởsáp nhập nguyên trạng giữa Khoa xét nghiệm, Khu truyền máu và Trung tâm nghiêncứu ung thư thuộc Bệnh viện Ung thư Đà Nẵng

- Địa chỉ: Tầng 2 – Khu nhà D – Bệnh Viện Ung bướu Đà Nẵng – Tổ 14 PhườngHòa Minh, Quận Liên Chiểu,TP Đà Nẵng

- Điện thoại: 05113.717361 (Hành chính)

05113.717 362 (BS Lê Văn Hùng – Trưởng khoa)

05113.717 364 (Labo Hóa sinh – Huyết học)

05113.717 366 (Labo Vi sinh)

2.2. Chức năng nhiệm vụ

a Các xét nghiệm về Huyết học, Đông máu và Tế bào:

- Đánh giá các chức năng đông máu Nội sinh và Ngoại sinh

- Tổng phân tích tế bào máu bằng máy đếm Laser

- Các xét nghiệm chuyên sâu về Huyết đồ, Tủy đồ, D-Dimer, Tế bào dịch

b Các xét nghiệm về Hóa sinh- Miễn dịch:

- Các xét nghiệm hóa sinh cơ bản đánh giá chức năng gan, thận, chuyển hóa,biland lipid, calci, phospho, HbA1c, A.Uric, LDH…

- Các xét nghiệm hóa sinh cao cấp như định lượng các kháng thể IgG, IgM,IgA, IgE, β2- Microglobulin, Pre-albumin, CK-MB…

- Các xét nghiệm Hormon T3, FT3, T4, FT4, TSH, Estrogen, Testosteron,Cortisol, ADH…

- Đặc biệt là các xét nghiệm dấu hiệu sinh học bướu nhằm giúp tầm soát vàchẩn đoán sớm các bệnh ung thư gan, phổi, đường tiêu hóa, thận,vú, buồngtrứng, cổ tử cung, tụy như: CEA, CA125, CA15-3, CA19-9, Cyfra 21-1, AFP,Pepsinogen I & II, Pro-GRP, PSA, SCC, HE 4, NSE …

c Các xét nghiệm nuôi cấy, định danh vi khuẩn, nấm và thực hiện kháng sinh đồ,xác định nồng độ ức chế tối thiểu … được thực hiện thường quy

2.3. Cơ cấu tổ chức:

Cơ cấu tổ chức của khoa như sau:

TRƯỞNG KHOA

2.4. Cơ sở vật chất, trang thiết bị:

Khoa XNTH được trang bị một hệ thống phân tích mẫu hoàn toàn tự động củacác hãng lừng danh trên thế giới như Abbott, Roche, Siemens, Becton, Dickinson

- Đối với các xét nghiệm Hóa sinh – Miễn dịch khoa được trang bị hệ thốngkết nối hiện đại của hãng Abbott, Hoa Kỳ (Module Ci16200) và máy xét nghiệmmiễn dịch i1000 cũng của hãng Abbott sử dụng kỹ thuật miễn dịch hóa phát quang(CMIA) tiên tiến nhất hiện nay với độ nhạy và độ đặc hiệu rất cao

Hệ thống phân tích khí máu động mạch và ion đồ hiện đại gồm 2 máy: máycobas b121 của hãng Roche và máy Rapid point 400 của hãng Siemens (Germany)

Hệ thống phân tích nước tiểu hoàn toàn tự động 18 thông số Combi scan 500 củahãng Siemens (Germany)

- Đối với các xét nghiệm Huyết học khoa được trang bị hệ thống hiện đại,hoàn toàn tự động bao gồm máy xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu 33 thông sốbằng máy đếm laser Cell Dyn Ruby của hãng Abbott (Hoa Kỳ) và máy XS 800 củahãng Sysmex (Nhật Bản)

Các xét nghiệm đông máu được thực hiện hoàn toàn tự động trên máy CA

1500 của hãng Sysmex (Nhật Bản) và máy STA Compact CT của hãng Stago(Pháp)

Xét nghiệm máu lắng tự động hoàn toàn được thực hiện bằng máy Human Sed

25 mix của hãng Human (Germany)

- Đối với các xét nghiệm vi sinh, bao gồm các xét nghiệm định danh vi khuẩn,nấm và thực hiện kháng sinh đồ, xác định nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn gâybệnh được thực hiện hoàn toàn tự động trên máy BD Phoenix của hãng BectonDickinson lừng danh (Hoa Kỳ)

TỔ

CTM –

ĐÔNG MÁU

TỔ TẾ BÀO (HUYẾT- TUỶ ĐỒ-TB DỊCH)

TỔ HÓA SINH – MIỄN DỊCH

TỔ VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

TỔ LẤY MẪU-NHẬN

VÀ XỬ LÝ MẪU

Hệ thống nuôi cấy vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí hiện đại cũng đã được trang

bị, xét nghiệm cấy máu được thực hiện bằng máy Bactec 9250 cũng của hãngBecton Dickinson lừng danh (Hoa Kỳ)

Hệ thống kính hiển vi – xét nghiệm tế bào:

- Kính hiển vi đối pha Nikon Eclipse Ci H550s – Nhật Bản

- Hệ thống kính hiển vi quang học Nikon Eclipse E100 – Nhật Bản

3 Đơn vị Di truyền và sinh học phân tử thuộc khoa Xét nghiệm-Truyền máu 3.1 Nhiệm vụ đơn vị:

Đơn vị Di truyền và sinh học phân tử chuyên xét nghiệm về các mảng miễndịch ung thư, di truyền và SHPT ung thư

MIỄN DỊCH UNG THƯ

KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM DI TRUYỀN, SHPT UNG THƯ

1 Xét nghiệm dấu ấn tế bào Bạch cầu

cấp (20CD) Xét nghiệm phát hiện gen

2 Đếm tế bào gốc CD34+ bằng

Flowcytometry

Xét nghiệm gen bệnh máu ác tính

3 Đếm số lượng tế bào Lympho T

CD4/CD8-CD3 Xét nghiệm công thức NST(Karyotype)

4 Phân tích CD Xét nghiệm sắc thể: kỹ thuật

DNA với Protein

5 Đánh giá tồn lưu tế bào ác tính

7 Xét nghiệm định type HLA (bằng

kỹ thuật sinh học phân tử)

10 Xét nghiệm Đường – Ham Xác định DNA trong viêm gan B

11 Chuẩn đoán bệnh tiểu huyết sắc tố

về đêm (PNH)(5CD) (HBV) cho các bệnh viêm gan CĐịnh lượng virus viêm gan B

mãn tính

12 Xét nghiệm CD64, CD11b trong Định lượng virus viêm gan C

Hình 8: Tủ lạnh 40C Hình 7: Tủ hút khí độc

SEPSIS (HCV) cho các bệnh viêm gan C

mãn tính

Cobas TaqMan48

Bảng 1: Các kỹ thuật xét nghiệm 3.2 Trang thiết bị tại đơn vị Di truyền và sinh học phân tử.

H1: Máy Flowcytometry H2: Tủ ấm có trao đổi khí H3: Tủ ATSH cấp 2

H4: Máy ly tâm ống nghiệm H5: Máy ly tâm Eppemdorf H6: Máy Realtime PCR

Hình 9: Tủ lạnh -200C

Hình 14: Máy đọc gel Hình 13: Máy đo nồng độ Acid nucleid

CHƯƠNG II: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TẾ BÀO DÒNG

CHẢY TRONG XÉT NGHIỆM BỆNH BẠCH CẦU CẤP

Đến năm 1990, Becton Dickinson (BD) tung ra thị trường máy FACSCountchuyên dụng cho máy đếm T-CD4, tại thời điểm đó máy chưa được cấp giấychứng nhận bởi FDA nhưng hiện nay đã được công nhận

Năm 1996, BD tiếp tục đưa ra hệ thống FACSCalibur và sau đó là các dòngmáy FACS Canto, FACS Aria hiện đại và đa nhiệm.Về sau các máy FACS ngàycàng được nâng cấp và tính đa nhiệm ngày càng cao

I.2. Sự kết hợp kháng nguyên – kháng thể - chất phát huỳnh

quang

Hình 1: Sơ đồ hóa mối liên kết kháng nguyên – kháng thể

- chất huỳnh quang (Nguồn: tác giả Nguyễn Phương Liên)

Kỹ thuật tế bào dòng chảy nhận diện DAMDTB, là các kháng nguyên của

tế bào, gián tiếp thông qua mật độ các chất huỳnh quang gắn với các kháng thể đặctrưng tương ứng với từng loại kháng nguyên kháng nguyên cần khảo sát có thể làmột Protein, immunoglobulin, cytokine…nằm trên màng tế bào, trong bào tươnghoặc thậm chí trong nhân tế bào

Từ năm 1992, các chuyên gia Việt Nam đã biết đến kỹ thuật tế bào dòngchảy, nhưng chỉ được tiếp cận thông qua kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang bằngkính hiển vi để phân biệt BCC dòng lympho B và T, kế đến là xác định dòng tủytại Viện Truyền máu Huyết học Trung ương, bệnh viện nhi Trung Ương…Năm

1995, bệnh viện truyền máu huyết học là bệnh viện đầu tiên được trang bị máyFASC Calibur (3 màu) để phân biệt các dòng tế bào tạo máu khác nhau trong bệnh

lý BCC và thực hiện đếm tế bào CD4 cho bệnh nhân HIV Trong những năm sau

đó, nhiều trung tâm nghiên cứu trong cả nước đã quan tâm đầu tư máy móc thiết bị

mở rộng các lĩnh vực nghiên cứu Các bệnh viện truyền nhiễm trung ương và việnpasteur TP.HCM (2000) là những đơn vị kế tiếp sử dụng máy tế bào dòng chảy 3-

4 màu trong lĩnh vực nghiên cứu về CD3/CD4/CD8 ở bệnh HIV Nhu cầu đếmCD4 lan rộng trên cả nước và thế giới nên có những dòng máy đơn giản rẻ tiềnhơn thay thế Những năm 2005 trở lại đây, kỹ thuật tế bào dòng chảy đã đóng mộtvai trò quan trọng trong các nghiên cứu về tế bào gốc máu cuống rốn, đặc biệt là tếbào trung mô Cùng với sự phát triển của kỹ thuật, công nghệ này càng được đổimới tiến bộ hơn với những dòng máy từ 4,6 hoặc 8 màu đã ra đời và được các đơn

vị nghiên cứu quan tâm đầu tư để tăng thêm độ chính xác, giúp nghiên cứu nhữngquần thể tế bào rất nhỏ ( bệnh viện TMHH TP.HCM năm 2009 đã có thêm máy 6màu, Viện Hải dương học Nha Trang )

Ứng dụng kỹ thuật tế bào dòng chảy xác định DAMDTB trong chẩn đoán,phân loại bệnh BCC, từ đó chọn lựa các phương pháp và kiểu hình DAMDTB phùhợp để đánh giá TLTBAT bằng dàn kháng thể đơn dòng hiện có

I.3. Nguyên lý hoạt động của máy tế bào dòng chảy [5]

Nguyên lý cơ bản của máy đếm tế bào theo dòng chảy (flow cytometry FC) là nguyên lý biến đổi điện trở của dòng hạt đi qua cửa sổ có tế bào quang điện

-và một điện trường Nguyên lý này giúp phân tích sự khác biệt về kích thước cácloại tế bào khác nhau, nhưng không nhận diện chính xác từng loại tế bào

Các máy đếm tế bào hiện đang được sử dụng có thể chia làm hai loại:

- Máy đếm tế bào nguyên lý tổng trở: phân biệt từng loại tế bào dựa vàokích thước tế bào

- Các máy thế hệ sau: ứng dụng laser và xung điện đa chiều nên có tốc độcao và phân loại tế bào chính xác hơn Với những máy sản xuất trước

1996 khả năng phân loại chính xác các thành phần bạch cầu nói chungkhông quá 90% Các máy model gần đây, với việc áp dụng tổng hợp các

cơ chế tổng trở, xung điện đa chiều, laser và scatter nên khả năng nhậndiện tế bào được nâng đến 95% Một số serie máy có thể phân biệt đượccác loại bạch cầu ưa a xít, ưa baso, hồng cầu lưới bằng việc kết hợp vớicác phương pháp nhuộm men peroxydase, nhuộm RNA/DNA, nhuộmhuỳnh quang, phân tích huyết sắc tố (CellDyn 4000 của hãng ABBOTT,SE-Advance của hãng Sysmex…)

I.4. Các bộ phận chính và nguyên lý cơ bản của máy flow

cytometry [4]

I.4.1. Hệ thống tạo dòng chất lỏng (fluidics system)

Hệ thống tạo dòng chất lỏng là bộ phận căn bản nhất của một máy đếm tếbào dòng chảy

Hệ thống tạo dòng chất lỏng gồm có 2 vùng chất lỏng có áp lực khác nhau.Dòng dịch lỏng bên ngoài (sheath fluid) còn được gọi là dung dịch tạo dòng bao: cótác dụng “nắn chỉnh” dòng dịch lỏng chứa mẫu bên trong (core fluid) còn gọi là

Hình 2: Hệ thống Flow Cytormetry

dòng lõi thành một dòng hẹp tới mức các tế bào/hạt vật chất trong mẫu chỉ có thể điqua khe hẹp đó từng cái một từ đó giúp tập trung tế bào/vật thể nhỏ có trong mẫuthành dòng tế bào đơn và vận chuyển dòng tế bào đơn này đi qua hệ thống quanghọc với tốc độ rất cao, khoảng 1000 tế bào/giây Điều chỉnh mức độ chênh lệnh áplực giữa dòng bao và dòng lõi có thể mở rộng hoặc thu hẹp tiết diện dòng lõi, phùhợp với yêu cầu phân tích (ví dụ phân tích tế bào máu thì cần dòng lõi lớn, phântích ADN thì cần dòng lõi hẹp) Nhờ cơ chế này hệ thống mới có thể phân tích đồngthời nhiều đặc tính trên từng tế bào một cách chính xác, giảm được yếu tố nhiễu

Dịch dùng tạo dòng sheath thường phải đáp ứng 2 yêu cầu:

(1) không gây ảnh hưởng tới tế bào (không làm tan tế bào)

(2) không làm ảnh hưởng đến độ chiết quang và độ huỳnh quang của hệthống Ở một số dòng máy người ta sử dụng ống vi mao thay thế cho dòng bao

I.4.2. Hệ thống quang học

Hình 3: Hệ thống dòng chất lỏng trong buồng mẫu (flow cell)

Bản thân một tế bào không được nhuộm với kháng thể có gắn huỳnh quang cũng có thể phát ra những tia phản xạ, được các bộ phận nhận sóng ghi nhận, từ đó

phản ánh hai thông số : FSC và SSC, còn được gọi là hai yếu tố nội tại của tế bào

FSC (Forward Scatter Chanel): nguồn sáng laser

sẽ đón nhận những tia sáng thẳng tới từ tế bàogốc, phản ánh kích thước tế bào

SSC (Side Scatter Chanel): những tia sáng

được các gương phản xạ ở những vị trí khácđón nhận, phản ánh tính chất phức tạp của tếbào như: sự nhấp nhô của màng tế bào, bảnchất không hạt, ít hạt hay nhiều hạt của bào

tương…

Hệ thống quang học bao gồm nguồn phát tia sáng (thường là các đèn laserhoặc đèn hồ quang), hệ thống kính lọc và các kênh thu tín hiệu quang học và tínhhiệu huỳnh quang (FSC dùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc thẳng; SSCdùng thu nhận tín hiệu ánh sáng tán xạ góc bên, các FL (Fluoressen Light), dùng thunhận tín hiệu ánh sáng huỳnh quang từ kênh màu huỳnh quang và số kênh màuhuỳnh quang có thể dao động từ 2 đến 18 FL tùy dòng máy; PMT – PhotoMultiplier Tube, các ống nhân quang tương ứng với các kênh màu huỳnh quang cóvai trò khuếch đại tín hiệu ánh sáng huỳnh quang)

Ánh sáng từ nguồn laser tương tác với tế bào nhuộm kháng thể gắn huỳnh quang sẽ sinh ra các ánh sáng sau: FSC liên quan tới kích cỡ tế bào, SSC liên quan đến độ phức tạp nhân

và bào tương tế bào, các ánh sáng huỳnh quang như FITC, PE, PC5 đặc trưng cho các kháng nguyên tương ứng có trên bề mặt tế bào.

Hình 4: Yếu tố nội tại của tế bào

Hình 5: Hệ thống quang học

Khi một tế bào hay một vật thể đi qua nguồn sáng, ánh sáng của nguồn sáng

sẽ tương tác với vật thể sẽ tạo ra các ánh sáng tán xạ (tán xạ góc thẳng và tán xạ gócbên) và nếu tế bào/vật thể đó được nhuộm màu huỳnh quang, dưới kích thích củanguồn sáng, chất màu huỳnh quang đó sẽ phát ra ánh sáng huỳnh quang Sau đó cáctia sáng này sẽ đi qua hệ thống kính lọc (đó là các thấu kính chỉ cho phép các tiasáng có bước sóng nhất định đi xuyên qua) Với hệ thống kính lọc này các tia sángtán xạ và ánh sáng huỳnh quang sẽ được phân chia và đi đến hệ thống thu nhận tínhiệu một cách chính xác

Nếu tế bào có kích thước càng lớn, chỉ số FSC thu được càng lớn Tế bàocàng nhiều hạt hoặc khoang trong bào tương, nhân càng quận, chia múi thì chỉ sốSSC càng cao Như vậy, trong các thành phần bạch cầu có thể thấy chỉ số SSC củaquần thể tế bào lympho là thấp nhất, của quần thể mono cao hơn quần thể lympho,

và SSC của quần thể bạch cầu hạt đa nhân sẽ lớn nhất

Các tín hiệu màu huỳnh quang (FL-Fluoressent Light) từ phức hợp kháng thểkháng nguyên trên bề mặt tế bào đích cũng được thu nhận theo các kênh màu huỳnhquang và được khuếch đại trong các ống nhân quang PMTs (photomultipliers tube)

Khi tia laser chiếu vào các chất phát huỳnh quang này sẽ tạo ra các ánh sánghuỳnh quang và sau đó các tín hiệu sáng này sẽ được thu nhận, chuyển đổi thành tínhiệu điện tử và biểu thị dưới dạng biểu đồ gồm các quần thể dương tính và âm tínhvới các huỳnh quang tương ứng với các kháng nguyên cần khảo sát

Hình 6: Đồ thị 2 chiều SSC và FSC của mẫu máu toàn phần đã ly giải hồng cầu cho thấy các quần thế tế bào bạch cầu được phân tách thành 3 quần thể

rõ rệt theo kích thước và mức độ phức tạp của cấu trúc bên trong tế bào.

Hình 7: Hiển thị tín hiệu huỳnh quang trên máy tính phân tích

Trong một số trường hợp, tín hiệu huỳnh quang có thể được thu nhận mộtcách không đặc hiệu do các kháng thể gắn huỳnh quang có thể gắn không đặc hiệuvới màng tế bào đích, hoặc các tế bào đích có khả năng tự phát huỳnh quang.

Thông thường các hãng khác nhau có đôi chút khác biệt trong việc bố trí đènhuỳnh quang và các hệ thống kính lọc, do vậy các kênh màu huỳnh quang cũng cóđôi chút khác biệt Điều này cần chú ý vì sẽ liên quan đến việc lựa chọn phối hợpmàu huỳnh quang trong các phân tích đa màu

Tổng hợp các tín hiệu về ánh sáng tán xạ góc bên và các tín hiệu về ánh sánghuỳnh quang tương ứng của một tế bào sẽ giúp chúng ta phân biệt tế bào này vớicác nhóm tế bào khác trong quần thể Ngoài ra, việc khoanh vùng (gating) quần thểmong muốn còn giúp thực hiện thống kê hoặc tiếp tục phân tích sâu hơn

I.4.3 Hệ thống điện tử (electronics system)

Hệ thống điện tử về bản chất là một hệ thống có trong máy, các tín hiệu củaánh sáng tán xạ và tín hiệu huỳnh quang sau khi được khuếch đại ở PMT sẽ được hệthống điện tử chuyển thành tín hiệu số đo đếm được và được biểu hiện dưới dạngbiểu đồ cột, biểu đồ mật độ hay biểu đồ điểm trên máy tính thông qua các phầnmềm chuyển đổi chuyên dụng theo máy

Chuyển tín hiệu ánh sáng huỳnh quang thành tín hiệu điện tử và biểu diễn dưới dạng đồ thị (Ví

dụ trong hình vẽ, tín hiệu huỳnh quang được chuyển thành tín hiệu điện từ và được thể hiện trên màn hình máy tính dưới dạng các điểm đồ thị Dot Plot

Sử dụng kháng thể đơn dòng gắn chấthuỳnh quang kháng dấu ấn bề mặt để phân biệt các giai đoạn phát triển của tế bào

Sự thay đổi về số lượng tương đối, số lượng tuyệt đối hay tỉ lệ các loại tếbào có thể cung cấp các thông tin giá trị về trạng thái miễn dịch của người hay loàivật

Cho phép quan sát các tiểu quần thể tế bào và phụ nhóm của 1 mẫu máu

Kỹ thuật tán huyết không rửa (lyse-no-wash methodology) cho số đếmtuyệt đối các nhóm tế bào limpho nhanh và chính xác

Đếm hồng cầu lưới

Hình 8: Hiển thị tín hiệu huỳnh quang

bằng đồ thị điểm trên máy tính

Định lượng DNA ở tế bào bướu.

Với FACSCalibur, phân loại tế bào trở nên thông thường Chỉ cần đặt giớihạn (gate) của quần thể tế bào cần quan tâm và ấn ACOUIRE FACSCalibur làmtiếp chu trình phân loại tế bào Chu trình này khép kín, không tạo khí dung, tạo antoàn khi xử lý các mẫu phẩm Chu trình này thanh lọc các tiểu quần thể, loại bỏcác chất có thể gây nhiễm cho các xét nghiệm nhạy, tăng số lượng tế bào cần quantâm trong mẫu phẩm hay khẳng định các phát hiện của flow cytometry

Phân loại tế bào rất lý tưởng cho việc kiểm tra hình thể tế bào và thực hiệncác kỹ thuật phân tử như FISII hay PCR hay xét nghiệm chức năng Sự liên hệchéo giữa thông tin từ flow cytometry và kết quả các xét nghiệm hậu phân loại tạothuận lợi cho phân tích tế bào

Ngoài ra còn những ứng dụng thành công trong các lĩnh vực nghiên cứusinh học và y học như phân tích tiểu cầu, nghiên cứu tế bào gốc, phân tích DNA ,xét nghiệm động học [7]

Immunophenotyping (HIV) cho thấy sự hiện diện của các quần thể bấtthường hoặc chưa trưởng thành của bạch cầu

Đếm tuyệt đối kháng nguyên CD4 để đánh gía mức độ suy giảm miễn dịch(suy giảm miễn dịch nặng khi CD4<200/mm3, hoặc số lượng tế bào lymphô ởmáu ngoại biên < 1.200/mm3)

Thực hiện thủ tục immunophenotyping sau đó dùng kỹ thuật FC để xétnghiệm chẩn đoán bệnh bạch cầu và ung thư hạch bạch huyết

Phân tích chu kỳ tế bào và mức bội thể của khối u

Phản ứng chéo tương hợp mô (ghép tạng) [6]

- Biểu hiện của các thụ thể trên bề mặt tế bào: đếm số lượng tế bào lymphoT-CD4, xác định các dòng tế bào gây ung thư, đếm tế bào gốc, đếm tế bào hồng cầulưới, định danh vi khuẩn, nghiên cứu sự biệt hóa tế bào động, thực vật

- Phân tách tế bào: thu nhận các quần thể tế bào lai cho việc sản xuất khángthể đơn dòng, các quần thể tế bào miễn dịch cho nuôi cấy tương tác invitro, thunhận tế bào gốc, thu nhận tinh trùng X hoặc Y

- ADN/ tế bào: xác định các giai đoạn của chu trình phân bào, khảo sát sự bấtthường trong bộ nhiễm sắc thể, xác định tổn thương ADN, nghiên cứu tác dụng củathuốc kháng ung thư lên trên tế bào đích

- Phát hiện cytokine: định lượng nồng độ cytokine trong dung dịch bằng kỹthuật dùng hạt bi có gắn kháng thể đơn dòng đặc hiệu với phổ cytokines Xác định

tế bào đích sản xuất các cytokine và bán định lượng thông qua kỹ thuật đo cytokinenội bào

- Ngoài ra, kỹ thuật đếm tế bào dòng chảy còn được ứng dụng trong nghiêncứu biến dưỡng tế bào, hoạt động cá kênh ion, các cơ quan nội bào, pH nội bào, ảnhhưởng của thuốc lên trên sinh lý tế bào

đi khắp nơi trong cơ thể Do đó, khi số lượng tế bào còn non gia tăng, thì số lượnghồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu giảm bớt

Bốn dạng bệnh bạch cầu thông thường là:

• Bệnh Bạch Cầu Nguyên Bào Cấp Tính (Acute Lymphoblastic Leukaemia - ALL)

• Bệnh Bạch Cầu Bạch Huyết Bào Mạn tính (Chronic Lymphocytic Leukaemia - CLL)

• Bệnh Bạch Cầu Tủy Bào Cấp Tính (Acute Myeloid Leukaemia - AML)

• Bệnh Bạch Cầu Tủy Bào Mạn tính (Chronic Myeloid Leukaemia- CML) [8]

Bệnh Bạch cầu cấp (Acute Leukaemia) là bệnh tăng sinh ác tính các tế bàomáu chưa biệt hóa hay đã biệt hóa một phần thành các tế bào đầu dòng của tế bào

bạch cầu xảy ra khi các tế bào trong thời kỳ phát triển ban đầu bị ảnh hưởng Do

đó, các tế bào này còn không trưởng thành được và hoàn toàn vô dụng Do vậybệnh nhân bị bệnh bạch cầu dạng cấp tính dễ bị viêm nhiễm, chảy máu, và thiếumáu, và hầu như phải được trị liệu ngay Bạch cầu cấp, còn gọi là bệnh lơ xê micấp, là bệnh ung thư phổ biến nhất ở trẻ em trên thế giới, bệnh chiếm khoảng mộtphần tư các bệnh ung thư ở trẻ em dưới 15 tuổi Bạch cầu cấp thể lympho chiếm75% các bệnh bạch cầu cấp [3]

2.1.2. Nguyên nhân [1]

Cho đến nay, y học đang tìm kiếm nguyên nhân cụ thể gây nên bệnh bạch cầu cấp Tuy nhiên, các nhà nghiên cứu ghi nhận các yếu tố liên quan đến bệnh lý này như sau:

- Hóa chất : các chất nhóm Alkyl, nhóm benzen (những hóa chất có cấu trúc hóa học nhân vòng).

- Tia xạ hay tia ion hóa: tỷ lệ bệnh bạch cầu cấp gặp nhiều ở những người tiếp xúc với tia xạ lâu ngày hay ở trong vùng nhiễm xạ nặng.

- Virus: nhiều nghiên cứu ghi nhận một số virus gây bệnh trên người một thời gian dài cũng gây ung thư Ví dụ: EBV gây ung thư vòm, HTLV1,2 gây bệnh bạch cầu cấp dòng lympho T….

- Bất thường nhiễm sắc thể: đây là nguyên nhân thường gặp trên bệnh nhân bạch cầu cấp.

- Yếu tố di truyền: có một số bệnh bẩm sinh di truyền như Hội chứng Down, hội chứng thiếu hụt miễn dịch bẩm sinh, hội chứng Poland… gây người bệnh

dễ mắc thêm bệnh bạch cầu cấp.

- Yếu tố môi trường: môi trường bị nhiễm độc do hóa chất, thuốc trừ sâu, tia xạ…gây nên tình trạng nhiễm độc nguồn nước, thức ăn…và các chất độc này gây đột biến nhiễm sắc thể, gây ung thư máu.

2.1.3. Tiêu chuẩn chẩn đoán bệnh bạch cầu cấp [2]