Cố định penicillin G vào trong hạt chitosan sử dụng tế bào Escherichia coli được thẩm thấu

Cố định penicillin G vào hạt chitosan sử dụng tế bào Escherichia coli thẩm thấu GVHD: TS Huỳnh Ngọc Oanh Học viên: Vũ Hoàng Ý (123106764) Ngô Thị Diệu Liên (12310736) NỘI DUNG • Giới thiệu • Vật liệu phương pháp • Kết • Bàn luận • Kết luận • Tài liệu tham khảo GIỚI THIỆU • • Ngày nay, Enzyme sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Tuy nhiên, khó khăn việc thu nhận tinh sạch, tính nhạy cảm enzyme với điều kiện sản xuất ,thời gian bán huỷ ngắn, trình hồi tính khó khăn sản phẩm dễ tạp nhiễm với enzyme tự nhiên vấn đề cần giải ngành công nghiệp sử dụng enzyme nguyên chất Do đó, enzyme thường sử dụng dạng cố định Các thuộc tính enzyme cố định phụ thuộc vào enzyme chất mang Chitin chitosan chất mang thường lựa chọn cố định enzyme tế bào(tính lực protein, nhóm chức phản ứng với enzym, ổn định học, dễ xử lý, kinh tế ) GIỚI THIỆU • Ứng dụng penicillin G acylase (PGA) sản xuất 6-aminopenicillanic acid (6-APA) 7aminodeacetoxy cephalosporanic acid (7-ADCA), chất trung gian sản xuất kháng sinh β-lactam bán tổng hợp • Quá trình cố định qua bước: - Các tế bào E.coli (ATCC 11105) thẩm thấu N-cetyl-N,N,N-trimethyl ammonium bromide (CTAB) (0.1%, 45 phút, 45rpm) - Cố định tế bào glutaraldehyde 5% dung dịch chitosan 3% GIỚI THIỆU • • • Các tế bào cố định giúp trình chuyển hoá tăng 9% Hoạt tính 90% sau 20 lần tái sử dụng Mục tiêu nghiên cứu: cố định PGA tế bào E.coli thẩm thấu nhờ liên kết chéo với glutaraldehyde nhằm tối ưu hoá trình cố định VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu: • • • • • • • Tế bào E Cloli (ATTC 11105) Penicillin G potasium Chitosan Glutaraldehyde N-cetyl-N,N,N-trimethyl Bromide (CTAB), p-dimethyl amino benzaldehyde (p-DBA) Các hoá chất khác VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Nuôi cấy tế bào E.coli (ATCC 11105) • • • • • • o Tế bào E.coli đông khô (được hồi sinh môi trường lỏng Muller-Hinton (24 giờ, 37 C) o Thu hoạch (ly tâm 10000rpm, C, phút) rửa kỹ đệm phosphate (0.1M, pH 7) Tái hoà tan đệm phosphat Dịch tế bào tiêm môi trường trung tính tối ưu hoá cho việc sản xuất PGA o Tế bào phát triển bình lắc 220 rpm, 24 C, 44 o Thu hoạch tế bào (ly tâm 10000rpm, C, phút) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thành phần môi trường trung tính • • • • • • Phenylacetic acid (PAA) 0.2% MgSO4.7H2O 0.02% Cao men 0.5% NH4Cl 0.1% K2HPO4 0.1% pH VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Xử lý tế bào với N-cetyl-N,N,N-trimethyl ammonium bromide • 10g tế bào ướt từ giai đoạn trước cho vào dung dịch CTAB với nồng độ từ 0.05-0,25% chuẩn bị đệm phosphate • • Hỗn hợp khuấy nhẹ nhàng nhiệt độ phòng 45phút o Thu hoạch (ly tâm 8000rpm, C, 10 phút) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Tạo hạt chitosan • • 10g tế bào thẩm thấu, 10ml dd chitosan 3% cho vào dd acid acetic 3% Dùng bơm tiêm tạo hạt dung dịch khác nhau: - Dung dịch NaOH (1M):MeOH - Dung dịch glutaraldehyde (1-9%) • Thu hạt bảo quản đệm phosphate sau 1giờ VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đặc điểm hình thái hạt • • Quan sát kính hiển vi điện tử quét (SEM) Các hạt đông khô phủ lớp vàng bề mặt Hạt cố định NaOH:MeOH Hạt cố định glutaraldehyde VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Tính ổn định hoạt động • Tính ổn định hoạt động enzyme cố định tế bào xử lý với CTAB phân tích cách đo lường hoạt động mẻ điều kiện lên men khác KẾT QUẢ Ảnh hưởng nồng độ CTAB lên thẩm thấu tế bào Biểu đồ 1: ảnh hưởng CTAB lên hoạt tính tế bào E.coli KẾT QUẢ Ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde lên cố định tế bào Biểu đồ 2: ảnh hưởng nồng độ glutaraldehyde lên tế bào cố định KẾT QUẢ Kích thước hình thái hạt A hạt màu be (cố định NaOH-MeOH) B hat màu nâu ( cố định glutaraldehyde 5%) KẾT QUẢ Kích thước hình thái hạt A hạt màu be (cố định NaOH-MeOH) B hat màu nâu ( cố định glutaraldehyde 5%) KẾT QUẢ Hạt màu be - cố định NaOH-MeOH Hạt màu nâu - cố định Glutaraldehyde - Đk trung bình hạt: 1.7mm - 2.32mm - Kích thước lỗ hạt Lớn hơn, không đồng • - Đồng trải bề mặt Kích thước lỗ đồng giúp gia tăng trình vận chuyển chất sản phẩm Kết hoạt động thủy phân penicillin xảy nhanh hơn, trình chuyển đổi tốt KẾT QUẢ Hoạt động thuỷ phân dạng tế bào khác A Tế bào tự B Tế bào xử lý với CTAB C Tb cố định NaOH:MeOH D Tb cố định glutaldehyde KẾT QUẢ Khả tái sử dụng Tế bào cố định Tế bào thẩm thấu không cố định BÀN LUẬN • Nồng độ tối ưu CTAB để thẩm thấu tế bào 0.1% Ở nồng độ này, hoạt tính tối ưu: 134U/g tế bào Cao 32g so với tế tự Điều hạn chế khuếch tán giảm gây nên thành tế bào Kết phù hợp với kết nghiên cứu trước •Glutaraldedyde ảnh hưởng đến tối ưu hoá cố định Nồng độ glutaraldehyde tối ưu cho cố định PGA lên chitosan 5%, hoạt tính 56U/g, giảm 90g/u so với tế bào tự Sự giảm phản ứng không đặc hiệu glutaraldehyde với nhóm chức enzyme, làm thay đổi hình thái vị trí kết nối enzyme BÀN LUẬN • Trọng lượng phân tử chất đóng vai trò quan trọng hoạt tính enzyme Hợp chất có trọng lượng phân tử thấp (300Da) thoát khỏi hạt dễ • Giới hạn việc vận chuyển sinh khối cho thấy vai trò quan trọng hạt xốp có kích thước đồng tạo nên glutaraldehyde • Sự cố định dẫn đến giảm phần hoạt tính thay đổi môi trường enzyme, đặc tính hoá lý mạng lưới xung quanh enzyme tế bào, tương tác bề mặt suy giảm hoạt động suốt trình cố định BÀN LUẬN • Tế bào thẩm thấu với CTAB làm tăng chuyển hoá 9% so với tế tự Điều hạn chế khuếch tán giảm thành tế bào Độ xốp hạt, trọng lượng phân tử chất ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme • Hoạt động tối ưu chất xúc tác không cố định cố định với glutaraldehyde tương ứng 14 U/g 44 U/g Có thể cho thấy ảnh hưởng glutaraldehyde trình cố định BÀN LUẬN • Xu hướng dòng chuyển hoá: hoạt tính tế bào cố định glutaraldehyde tuyến tính so với tế bào khác Điều giúp ta dự đoán thời điểm kết thúc phản ứng xác • Hoat tính tế bào cố định xử lý với CTAB bên hạt polyacrylamide cao khoảng 30% so với tế bào không xử lý Có thể tế bào thẩm thấu có hạn chế khuếch tán thấp KẾT LUẬN • • • Các tác giả thành công trình thẩm thấu tế bào E coli CTAB, cố định chitosan tác nhân liên kết glutaraldehyde, tối ưu hoá nồng độ CTAB glutaraldehyde, tối ưu hoá dạng quy trình xử lý hạt Kết cho ta thấy phương pháp có tiềm ứng dụng công nghiệp Ngoài ra, việc áp dụng phương pháp lên men liên tục loại bỏ ức chế sản phẩm, làm tăng hoạt tính chất xúc tác sinh học tỉ lệ phản ứng XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN [...]... là hoạt động thủy phân penicillin xảy ra nhanh hơn, quá trình chuyển đổi tốt hơn KẾT QUẢ Hoạt động thuỷ phân của những dạng tế bào khác nhau A Tế bào tự do B Tế bào được xử lý với CTAB C Tb cố định bằng NaOH:MeOH D Tb cố định bằng glutaldehyde KẾT QUẢ Khả năng tái sử dụng Tế bào được cố định Tế bào thẩm thấu không cố định BÀN LUẬN • Nồng độ tối ưu của CTAB để thẩm thấu tế bào là 0.1% Ở nồng độ này,... tích bằng cách đo lường hoạt động trong những mẻ và những điều kiện lên men khác nhau KẾT QUẢ Ảnh hưởng của nồng độ CTAB lên thẩm thấu tế bào Biểu đồ 1: ảnh hưởng của CTAB lên hoạt tính tế bào E .coli KẾT QUẢ Ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde lên cố định tế bào Biểu đồ 2: ảnh hưởng của nồng độ glutaraldehyde lên tế bào cố định KẾT QUẢ Kích thước và hình thái hạt A hạt màu be (cố định bằng NaOH-MeOH)... khoảng 30% so với tế bào không được xử lý Có thể các tế bào thẩm thấu có hạn chế khuếch tán thấp hơn KẾT LUẬN • • • Các tác giả đã thành công quá trình thẩm thấu tế bào E coli bằng CTAB, cố định trong chitosan bằng tác nhân liên kết glutaraldehyde, tối ưu hoá nồng độ của CTAB và glutaraldehyde, tối ưu hoá các dạng quy trình xử lý hạt Kết quả cho ta thấy phương pháp này có tiềm năng được ứng dụng trong. .. 6-APA trong 1 phút khi bổ sung dung dịch pennicillin G 2%, pH 7.8 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Đặc điểm hình thái hạt • • Quan sát bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) Các hạt đông được khô và phủ một lớp vàng trên bề mặt Hạt cố định bằng NaOH:MeOH Hạt cố định bằng glutaraldehyde VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Tính ổn định hoạt động • Tính ổn định hoạt động của enzyme cố định và các tế bào được xử lý với CTAB được. .. nâu ( cố định bằng glutaraldehyde 5%) KẾT QUẢ Kích thước và hình thái hạt A hạt màu be (cố định bằng NaOH-MeOH) B hat màu nâu ( cố định bằng glutaraldehyde 5%) KẾT QUẢ Hạt màu be - cố định bằng NaOH-MeOH Hạt màu nâu - cố định bằng Glutaraldehyde - Đk trung bình hạt: 1.7mm - 2.32mm - Kích thước lỗ trên hạt Lớn hơn, không đồng đều • - Đồng đều và trải đều bề mặt Kích thước lỗ đồng đều giúp gia tăng quá... xung quanh enzyme hoặc tế bào, tương tác bề mặt và suy giảm hoạt động trong suốt quá trình cố định BÀN LUẬN • Tế bào thẩm thấu với CTAB làm tăng chuyển hoá hơn 9% so với tế tự do Điều này có thể do sự hạn chế khuếch tán giảm bởi thành tế bào Độ xốp của hạt, trọng lượng phân tử của cơ chất cũng có thể ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme • Hoạt động tối ưu của chất xúc tác không cố định và cố định với glutaraldehyde... glutaraldehyde tương ứng là 14 U /g và 44 U /g Có thể cho thấy ảnh hưởng của glutaraldehyde trong quá trình cố định BÀN LUẬN • Xu hướng của dòng chuyển hoá: hoạt tính của tế bào cố định bằng glutaraldehyde tuyến tính hơn so với những tế bào khác Điều này giúp ta có thể dự đoán thời điểm kết thúc của phản ứng chính xác hơn • Hoat tính của tế bào cố định được xử lý với CTAB bên trong các hạt polyacrylamide... VÀ PHƯƠNG PHÁP Hạt chitosan Hạt chitosan chứa tế bào E .coli 11105 thẩm thấu • • A hạt màu be (cố định bằng NaOH:MeOH ) B hat màu nâu (cố định bằng glutaraldehyde 5%) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Khảo nghiệm hoạt động thuỷ phân • • • 6-APA được tạo ta từ phản ứng thuỷ phân penicillin G sẽ phản ứng với p-DBA tạo hỗn hợp sinh màu Đo màu bằng phương pháp đo quang 1 đơn vị hoạt động thuỷ phân (U) là lượng enzyme... ưu: 134U /g tế bào Cao hơn 3 2g so với tế tự do Điều này có thể do sự hạn chế khuếch tán giảm g y nên do thành tế bào Kết quả này phù hợp với kết quả của những nghiên cứu trước đó •Glutaraldedyde ảnh hưởng đến sự tối ưu hoá cố định Nồng độ glutaraldehyde tối ưu cho cố định PGA lên chitosan là 5%, hoạt tính là 56U /g, giảm 9 0g/ u so với tế bào tự do Sự giảm có thể do phản ứng không đặc hiệu của glutaraldehyde... Trọng lượng phân tử của cơ chất đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính enzyme Hợp chất có trọng lượng phân tử thấp (300Da) có thể thoát ra khỏi hạt dễ hơn • Giới hạn trong việc vận chuyển sinh khối cho thấy vai trò quan trọng của các hạt xốp có kích thước đồng đều tạo nên bởi glutaraldehyde • Sự cố định dẫn đến giảm một phần hoạt tính là do thay đổi trong môi trường enzyme, đặc tính hoá lý của mạng ... phân dạng tế bào khác A Tế bào tự B Tế bào xử lý với CTAB C Tb cố định NaOH:MeOH D Tb cố định glutaldehyde KẾT QUẢ Khả tái sử dụng Tế bào cố định Tế bào thẩm thấu không cố định BÀN LUẬN • Nồng độ... THIỆU • • • Các tế bào cố định giúp trình chuyển hoá tăng 9% Hoạt tính 90% sau 20 lần tái sử dụng Mục tiêu nghiên cứu: cố định PGA tế bào E .coli thẩm thấu nhờ liên kết chéo với glutaraldehyde... vàng bề mặt Hạt cố định NaOH:MeOH Hạt cố định glutaraldehyde VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Tính ổn định hoạt động • Tính ổn định hoạt động enzyme cố định tế bào xử lý với CTAB phân tích cách đo lường