Tiểu luận tìm hiểu về lysine trong các thương phẩm

Lấy thí nghiệm trước làm tiền đề cho thí nghiệm sau Trong quá trình nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng được thay đổi nhưng các điều kiện khác vẫn tuân theo những yêu cấu về kỹ thuật.. chuẩn

LỜI MỞ ĐẦU

Lysine là một trong chín loại amino acid mà cơ thể người và động vật không thể tự tổng hợp được, là một trong 12 axit amin thiết yếu cần có trong bữa ăn hàng ngày

Lysine là thành phần của nhiều loại protein, là yếu tố quan trọng trong việc duy trì hệ miễn dịch, nó giúp tăng cường hấp thụ và duy trì canxi, phát triển men tiêu hóa Tuy nhiên, cơ thể chỉ tổng hợp được Lysine qua con đường thực phẩm như lòng đỏ trứng gà, thịt, cá, các loại đậu và sữa tươi hoặc dưới dạng thuốc Nhưng việc cung cấp Lysine qua con đường thực phẩm rất dễ bị phá hủy trong quá trình đun nấu vì vậy, cách cung cấp Lysine hiệu quả nhất là sử dụng các loại thực phẩm chế biến sẵn, có bổ sung Lysine với liều lượng thích hợp, vừa đủ cho nhu cầu của cơ thể

Lysine được tổng hợp từ công nghệ hóa học, tiếp đó là công nghệ tách chiết và phổ biến hiện nay là công nghệ lên men vi sinh vật về công nghệ sản xuất lysine trên thế giới, lysine đã được sản xuất ở quy mô công nghiệp ở các nước như Mỹ, Nhật Bản, Đông Âu Công nghệ lên men Lysine ngày càng mở rộng với hiệu suất quá trình lên men tương đối cao

Tại Việt Nam, hàng năm lysine được nhập khẩu vào với số lượng tương đối lớn Tuy nhiên chỉ duy nhất công ty VeDan là đã đưa vào sản xuất với quy mô công nghiệp, ngoài ra các nghiên cứu ở Việt Nam mới chỉ dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm, giống vi sinh vật chưa đạt chuẩn

Đề tài thực tế tại phòng nuôi cấy vi sinh vật công ty CPHH VeDan VietNam, nhằm giới thiệu

về quy trình công nghệ sản xuất Lysine bằng phương pháp lên men quy mô phòng thí nghiệm Thí nghiệm trước sẽ làm tiền đề cho thí nghiệm sau, từ đó giúp chúng ta tìm ra phương pháp và điều kiện nuôi cấy tối ưu để áp dụng vào sản xuất ở quy mô công nghiệp, nhằm mang lại giá trị kinh tế cao nhất

TỔNG QUAN PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY LYSINE

2.1 Khái niệm Lysine

diminohexanoic acid Công thức hóa học : C6H14N2O2

g/mol

Công thức cấu tạo : NH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH 2 -CH-COOH

NH 2

Lysine là một a-amino acid Là acid amin thuộc họ aspartat, có chứa 2 nhóm (-NH2) và một nhóm (-COOH) Lysine tổng hợp qua con đường trao đổi chất phân nhánh, qua con đường này còn có metionin, treonin, izoloxin cũng được tạo thành

2.2 Các phương pháp tổng hợp Lysine

Phương pháp thủy phân

Phương pháp tổng hợp hóa học

Phương pháp kết hợp

Phương pháp tổng hợp axit amin bằng công nghệ vi sinh vật :

Thu nhận axit amin dạng L Năng xuất cao

Giá thành sản phẩm thấp Nguyên liệu sản xuất rẻ, dễ kiếm

2.3 Tổng quan về phương pháp nuôi cấy Lysine

2.3.1 Giống vi sinh vật

Trong nuôi cấy Lysine Người ta thường sử dụng chủng Corynebacterium glutacium vì:

Có khả năng tổng hợp Lysine với mức độ cao nhất, ở đây người ta sử dụng vi khuẩn Corynebacterium glutamicum đột biến

Sống được trên môi trường chứa hàm lượng methionine cao và threonine thấp

Tương đối dể nuôi và áp dụng vào công nghệ lên men ở quy mô công nghiệp

Đặc điểm của giống:

Hình thái khuẩn lạc: tròn, trơn, bóng Màu sắc: vàng chanh

2.3.2 nguyên liệu và môi trường nuôi cấy

Rỉ đường ( mía hoặc củ cải đường), dung dịch đường thu được sau quá trình thủy phân tinh bột sắn, bột ngô có hàm lượng đường khoảng 10-20%

Đường của rì đường bao gồm: 25-40% sacaroza, 15-25% đường khử( glucoza và fructoza), 3-5% đường không lên men được các giống vi khuẩn tham gia tổng hợp Lysine đều

có khả năng đồng hóa glucose, fructose, maltose, pentose, rafinose

Nguồn nitơ: Dùng các loại muối chứa NH4+ như: NH4CL, NH4OH, (NH4)2SO4,

NH4HPO4 hay khí NH3 hoặc urue làm nguồn cung cấp Nitơ Trong nuôi cấy công nghiệp thường sử dụng NH3 dưới dạnh lỏng hoặc khí Có thể sử dụng urue, khi sử dụng urue cần quan tâm tới nồng độ ban đầu vì khả năng chịu đựng của mỗi loại sinh vật khác nhau

Muối khoáng: Muối khoáng được sử dụng nhiều nhất là các dạng muối photpho Nồng độ thích hợp là 0.008-0.02mg/l, trong sản xuất người ta phải bổ xung thêm

MgSO4.7H2O với hàm lượng 0.03-0.5%

Vitamin: Biotin, Nicotinic, pantothenic acid, thiamine HCL…

2.4 Cơ chế tổng hợp Lysine

2.4.a ta nhận thấy, muốn vi khuẩn tạo ra nhiều L-Lysine thì sự tiến hóa phải theo nhánh α Ở đây sử dụng chủng đột biến mất Enzylme homoserin dehydrogenase, do đó sẽ không tạo thành tronin và methionin Kết quả L-Lysine được tổng hợp

THỰC NGHIỆM NUÔI CẤY LYSINE CÔNG TY CPHH VEDAN VIETNAM

3.1 Mục đích thí nghiệm nuôi cấy

Dextrose … Piruvat

β-Aspartat-photphat Oxalatetat

Lysine

Aspactat-β-sinial dehyd

Homogerium

Treonin Methionin

Thí nghiệm được thực hiện trên môt loại vi sinh vật đã đột biến, nhằm kiểm tra những điều kiện nuôi cấy tối ưu nhất để áp dụng vào quy mô nuôi cấy công nghiệp hiệu quả hơn Lấy thí nghiệm trước làm tiền đề cho thí nghiệm sau

Trong quá trình nuôi cấy, môi trường dinh dưỡng được thay đổi nhưng các điều kiện khác vẫn tuân theo những yêu cấu về kỹ thuật Vì vậy chúng ta có thể so sánh được môi trường nuôi cấy phát triển tối ưu cho vi sinh vật và mang lại giá trị kinh tế cao hơn Từ đó xây dựng được biểu đồ sinh trưỡng ở những điều kiện khác nhau

3.2 nguyên liệu sử dụng

Dextrose tỉ lệ

2.5%Sucrose

Rỉ đường : mol thai, mol viet nam, Indo… bao gồm 25 – 40% sacaroza, 15-25% đường khử ( glucoza và fructoza), 3-5% đường không lên men được

Nguồn nitơ: NH3, (NH4)2SO4.

Muối khoáng: các dạng muối photpho, MgSO4.7H2O

Vitamin: biotin, nicotinic, pantothenic acid, thiamine HCL, Ca pantothenate

Nước siêu thuần

3.3 dụng cụ và hóa chất

a Dụng cụ

Bồn nuôi cấy 5l Máy đo OD Nồi autoclave Nồi gia nhiệt Bếp

Bình tam giác Máy đo ph Máy khuấy từ

Pipet Cân điện tử Máy lắc Máy ly tâm…

b Hóa chất sử dụng

Na 2 HPO 4

KH 2 PO 4

Acid Citric MgSO 4 7H 2 O FeSO 4 7H 2 O CuSO 4 7H 2 O H3PO4 ZnSO 4 7H 2 O (NH) 2 SO 4

HCL 1N

H 2 SO 4 30%

Dịch A: CUSO 4 , KIO 3 , C 4 H 4 KNaO 6 , Na 3 PO 4 Dịch B: KI, K 2 C 2 O 4

Dịch C: H 2 SO 4 97%

Dịch D: Na 2 S 2 O 3

Chất phá bọt: dầu phộng 3.4 Sơ đồ khối quy trình sản xuất và thuyết minh quy trình

3.4.1 Sơ đồ khối quy trình sản xuất L- Lysine ( hình 3.4.a)

3.4.2 Thuyết minh quy trình

3.4.2.1 chuẩn bị bồn không

Cấu tạo chung và chức năng của bồn không:

• Thân bồn

• Ống dẫn OL: ống dẫn chất phá bọt

• Ống dẫn đường FD: dẫn môi trường dinh dưỡng để bổ xung trong qua trình nuôi cấy

• Vách khuấy ( vách cản dòng): có tác dụng đánh rối môi trường nuôi cấy

• Ống gió: gồm van một chiều và thiết bị lọc gió, tại đây không khí được thổi vào cùng NH3 Trong quá trình nuôi cấy nhằm cung cấp oxi và nitơ cho quá trình lên men hiếu khí, đồng thời giúp ổn định PH cho môi trường nuôi cấy Khí cung cấp vào phải sạch về

vi sinh vật và các tạp chất khác

Hình 3.4.a – sơ đồ cấu tạo bồn nuôi cấy L-Lysine

1 Máy làm mát

2 Máy sấy gió

3 Bình NH3 gas

4 Van tổng

5 Đồng hồ đo áp suất

6 van dẫn khí NH3 vào thiết bị điều khiển

7 máy điều khiển

8 hệ thống phân tích CO2

9 van điều chỉnh lưu lượng khí

10 đồng hồ đo áp suất

11 van thải

12 Ống dẫn khí thải

13 Thiết bị ngưng tụ

14 Motor

15 Ống tiếp môi trường

16 Đường ống dẫn nước vào

17 Đường ống dẫn nước ra

18 Đường ống dẫn khí vào bồn lên men

19 Lọc

20 Van một chiều

21 Ống lấy mẫu

22 Trục khuấy

23 Cánh khuấy

24 Điện cực PH

25 Nhiệt kế

26 Tấm chắn

27 Ống chứa nước tiêu độc

28 Ống dẫn nước vào

29 Bồn lên men

30 Thiết bị làm mát

31 Ống dẫn nước ra

32 Đường ống FD

33 PUMP

34 Đường ống tiếp giống

• Ống tiếp giống

• Ống lấy mẫu kiểm tra

• Ống cắm thanh điện cực: giúp nhận biết PH

• Ông đo nhiệt độ trong bồn nuôi cấy

• Cánh khuấy: Thực hiện quá trình khuấy đảo nhằm:

 Làm tăng khả năng tiếp xúc giữa chất dinh dưỡng và tế bào vi sinh vật, từ đó làm tăng khả năng trao đổi chất khả năng tiếp xúc càng nhiều thì trao đổi chất càng mạnh

 Trong khi tiến hành trao đổi chất, các chất sau đồng hóa và dị hóa sẽ tạo ra một lớp quanh tế bào Khi cánh khuấy hoạt động, lớp bao quanh này bị phá bỏ vì vậy mức độ xâm nhập cùa chất dinh dưỡng vào tế bào mạnh hơn

 Lên men trong điều kiện hiếu khí, cánh khuấy làm tăng khả năng hòa tan của oxy, các khí sẽ ở lại lâu hơn do dòng chuyển động của môi trường như vậy, khả năng hòa tan của oxy từ bọt khí sẽ cao hơn

 Cánh khuấy làm tăng khả năng tách các khí CO2, H2S, NH3… sinh ra từ quá trình trao đổi chất, làm giảm ảnh hưởng xấu của các laọi khí này đến vi sinh vật

 Cánh khuấy làm tăng nhanh quá trình sản xuất của con giống, do tác động cơ học mà các tế bào dễ dàng tách ra và sống độc lập

• Ống dẫn khí CO2: giúp kiểm soát được sự tạo thành CO2 trong quá trình nuôi cấy lượng vi sinh vật càng cao thì CO2 thải ra càng nhiều

• Ống dẫn

• Màn hình máy tính: hiển thị các thong số kỹ thuật của bồn lên men, giúp kiểm soát được môi trường nuôi cấy theo đúng yêu cầu kỹ thuật

3.4.2.2 Sát trùng bồn không

• Bồn không được lắp ráp với các ống dẫn silicon sát trùng ở 1210C +/-20C, 1kg/cm2

thời gian sát trùng từ 30-60 phút Tùy theo yêu cầu thực nghiệm

• Trong quá trình sát trùng, tất cả các van khóa ống dẫn silicon và thiết bị phải được mở

để hơi nóng có thể di chuyển trong toàn bộ thiết bị và tiệt trùng triệt để

3.4.2.3 Điều chế môi trường

Môi trường nuôi cấy gồm các cơ chất dinh dưỡng được pha chế nhân tạo nhằm đáp ứng cho nhu cầu sinh trưởng, phát triển của sinh vật Gồm hai loại môi trường: Môi trường nuôi dưỡng và môi trường đường FD bổ xung nuôi cấy.Cân và hòa tan nguyên liệu trong môi trường:

Môi trường nuôi dưỡng sản xuất lysine có các thành phần:

Dextrose 2.5%, (NH4)2SO4, NH3, KH2PO4, MgSO4.7H2O, FeSO4.7H2O, CuSO4.7H2O, ZnSO4.7H2O, Na2HPO4.12H2O, biotin, bổ sung thêm khoáng chất , duy trì PH = 7.0 bởi

NH3 khí

Môi trường được điều chế và thay thế nguyên liệu theo yêu cầu thực nghiệm hiệu chỉnh PH từ 6.8 – 7.2 theo đặc tính của từng loại giống

Môi trường FD:

 NH4)2SO4 hòa tan

 Đường hòa tan

 Các loại vitamin.

 SA (NH4)2SO4 được hòa tan và sát trùng ờ 121+/-20C, 1kg/cm2, thời gian là 25 phút( tùy thuộc vào yêu cầu thực nghiệm)

 Vitamin đuợc bơm trực tiếp vào môi trường nuôi dưỡng, hoặc bình SA đã được làm nguội Ở đây, vitamin được bơm vào bình SA qua thiết bị lọc

 Biotin: có vai trò rất quan trọng trong quá trình nuôi cấy biotin có tác dụng kích thích sinh trưởng và tích lũy L-Lysine Khi đủ biotin, sinh vật sinh trưỡng vừa phải, diễn biến lên men đều và L-Lysine tạo ra nhiều khi thừa biotin, vi khuẩn sinh trưỡng mạnh mẽ, tiêu hao đường và sinh rất ít L-Lysine Lượng biotin bổ sung vào để thích hợp cho sự tạo thành Lysine tùy thuộc vào từng chủng giống

ở đây ứng với 1000ml là: 0.023grs

3.4.2.4 sát trùng môi trường

Môi trường nuôi dưỡng sau khi điều chế, tiến hành hiệu chỉnh PH đạt 6,8 – 7,2 Sát trùng ở 121+/-20C, 1kg/cm2, 25 phút Tùy theo yêu cầu thực nghiệm

Trong quá trình sát trùng môi trường, các van và khóa bồn phải được đóng, không được

để môi trường trào ra khỏi bình lên men, vì dễ gây tạp nhiễm

Hình 3.4.b – Quy trình nuôi cấy L-Lysine

CHUẨN BỊ BỒN KHÔNG

SÁT TRÙNG BỒN KHÔNG

SÁT TRÙNG MÔI TRƯỜNG ĐIỀU CHẾ MÔI TRƯỜNG

LÊN MEN

ĐƯỜNG FD

CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG FD

GIỐNG

B.O

3.4.2.5 Giống và tiếp giống

Giống được phân lập, chọn lọc và được nhân giống cấp 1 trong ống nghiệm, nhân giống cấp 2 trong bình tam giác chứa dịch nuôi cấy

Lắc giống cấp 2 trong bình tam giác từ 13-16h ( tùy từng loai giống)

Tiếp giống:

Tất cả các thông số kỹ thuật trong bồn nuôi cấy phải đạt yêu cầu: gió, áp suất, nhiệt độ, PH…

Giống được tiếp từ bình tam giác vào bồn nuôi cấy bằng bơm lưu lượng

Tiến hành cấy tạp khuẩn từ giống cấp 1, cấp 2 trước ( trước khi tiếp giống) và dịch lên men sau khi tiếp giống

Nếu trên môi trường dinh dưỡng nuôi cấy tạp khuẩn, dịch được cấy vào có phát hiện khuẩn lac Chứng tỏ giống nhiễm tạp khuẩn

3.4.2.6 Lên men

3.4.2.6.1 Điều kiện lên men

Nhiệt độ trong quá trình lên men duy trì từ 32-340C

PH : 6.8 – 7.2 Quá trình lên men được thực hiện trong thiết bị có cánh khuấy, và thổi khí liên tục vì vi sinh vật được nuôi cấy trong môi trường dịch thể, chúng phát triển theo chiều đứng của cột môi trường vì vậy, phải thực hiện yêu cầu về khuấy đảo và sục khí

Sau khi giống được tiếp vào, tiến hành nuôi cấy từ 68-72 giờ

Quá trình lên men, dưới sự khuấy đảo liên tục trong bồn lên men sẽ có hiện tượng xâm thực( sự va đập của dịch lên men vào thiết bị kim loại), và quá trình sinh khí của vi sinh vật xuất hiện nhiều bọt khí có khuynh hướng trào ra khỏi bồn lẹn men, dễ gây tạp nhiễm vì vậy, cần kiểm soát lượng bọt và tìm cách phá hủy chúng Ngoài ra, bọt khí cũng cản trở sự tiếp xúc của tế bào với môi trường dinh dưỡng

L-Lysine được cấu thành từ các phân tử C, H,O,N vì vậy, môi trừng nuôi cấy phải đáp ứng đủ các yếu tố cần thiết để hình thành cấu trúc vi sinh vật

 Phân tích và kiểm tra:

Trong quá trình lên men, môi trừờng nuôi cấy sẽ có sự thay đổi do những phản ứng xảy ra làm thay đổi môi trường vì vậy, phải kiểm tra theo định kì về các thông số như: T/S, OD, MV, PH… từ 1- 4 giờ/ 1 lần

PH: mỗi loại vi sinh vật thích nghi với một môi trường nuôi cấy trong quá trình lên men, vi sinh vật tạo ra những sản phẩm trao đổi chất có tính acid hay kiềm, khiến PH của môi trường không còn thích hợp với môi trường sống của mình Vì vậy, cần phải thường xuyên theo dõi và điều chỉnh PH trong suốt quá trình nuôi cấy

Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum sinh trưởng tối ưu ở PH từ 6.8 – 7.2 Vì vậy trong quá trình nuôi cấy, môi trường có ảnh hưởng nhiều tới năng suất Lysine Thực

nghiệm được trình bày theo biểu đồ sau: Lượng lysine(g/l)

6,5 7,2 8,0 pH

Hình 3.4.c - ảnh hưởng của pH môi trường lên men đến

năng suất lysine Lưu ý: việc kiểm tra PH phải được tiến hành ngay sau khi lấy mẫu, vì nếu kéo dài thời gian thì kết quả kiểm tra sẽ không chính xác

Nhiệt độ: nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới sự phát triển của vi sinh vật

và hiệu quả của quá trình lên men Mỗi loại vi sinh vật thích ứng với một nhiệt độ khác nhau ( ở đây nhiệt độ từ 32 – 340C) Trong quá trình lên men luôn có sự tỏa nhiệt rất mạnh, nên nhiệt độ trong các thiết bị lên men thường có xu hướng gia tăng vượt ngưỡng nhiệt độ thích hợp đối với hoạt động sống của vi sinh vật đó Vì vậy, phải thường xuyên theo dõi và điều chỉnh nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men ( 32 –

340C)

Để đạt được nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men Bồn lên men được trang bị hệ thống làm nóng và làm nguội bằng nước chảy quanh đáy bồn dưới dạng ống ruột gà làm nguội

Qua khảo sát thực tế ở các mức nhiệt độ, kết quả được xây dựng theo biểu đồ sau:

Lượng Lysine (g/l)

20 25 30 35 40 t(oC)

Hình 3.4.d - ảnh hưởng nhiệt độ môi trường lên men đến

năng suất Lysine

Từ nghiên cứu lý thuyết đến thực nghiệm ta thấy, nhiệt độ môi trường từ 30 –

400C lượng lysine sinh ra cao hơn, đặc biệt ở nhiệt độ từ 32 – 340C Vì vậy trong sản xuất và thí nghiệm chúng ta chọn nhiệt độ này ( 32 – 340C)

Phân tích T/S:

Mục đích: kiểm tra hàm lượng đường và điều chỉnh phù hợp

Hóa chất sử dụng: dịch A, dịch B, dịch C,dịch D

Tiến hành: lấy mẫu từ bồn nuôi cấy

Hút 10ml dịch mẫu cần phân tích

Hút 1ml hoặc 2ml H2SO4 30% ( tùy thuộc vào độ tuổi của mẫu):

Mẫu thử đạt 20 – 40 tuổi dùng 1ml H2SO4 30%

Mẫu thử đạt 40 – 72 tuổi dùng 2ml H2SO4 30%

Cho vào ống nghiệm và định mức bằng PH=1 tới 30ml

Tiến hành gia nhiệt trong 30 phut để thủy phân hoàn toàn hàm lượng đường trong dịch mẫu sau khi gia nhiệt, tiến hành làm nguội và điều chỉnh PH của mẫu đạt từ 6,5 – 7,3 Định mức tới 100 ml bằng nước siêu thuần

Cho vào bình tam giác (250 ml ) 20 ml dịch A Hút 2ml hoặc 5ml dịch mẫu ( nếu T/S lần kiểm tra trước từ 3.00 trở lên thì hút 2ml, nếu dưới 3.00 thì hút 5ml), cho vào dịch A, đun sôi trên bếp 3 phút và làm nguội Thêm vào 10ml dịch B, 10ml dịch C Tiến hành chuẩn độ bằng dịch D tới khi đổi màu, thêm 3 giọt chỉ thị vào và tiếp tục chuẩn tới khi đổi màu hoàn toàn Dựa vào thể tích dịch D, xác định T/S theo công thức:

%TS = ( Vo – V1)xFx1.449 x 0.2

Hoặc %TS = ( Vo – V1)xFx1.449 x 0.5

Vo: số ml chuẩn mẫu trắng V1: số ml chuẩn mẫu thử