Thiết kế thí nghiệm tinh sạch và đánh giá tính chất, hoạt phổ một chất kháng sinh từ nấm Penicillium

Thiết kế thí nghiệm tinh sạch và đánh giá tính chất, hoạt phổ một chất kháng sinh từ nấm Penicillium

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay không ai có thể phủ nhận được tầm quan trọng của công nghệsinh học đối với nền kinh tế quốc dân nước ta nói riêng và thế giới nói chung.Thế kỷ 21 được coi là thế kỷ của ngành công nghệ sinh học, được coi làthời điểm lịch sử mà con tầu vũ trụ mang tên ‘ công nghệ sinh học’ đã rờikhỏi bệ phóng để bay đến tầm cao mới Việt Nam là nước nhiệt đới có khíhậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật (VSV) và đâyđược coi là một kho tàng vô giá về nguồn gen trong tự nhiên và nguồnnguyên liệu để phát triển ngành công nghệ sinh học nước nhà

Kể từ khi Penicillin được Alexander Fleming phát hiện (1929), và đượcchứng minh có tác dụng chữa bệnh (1941), trong hơn nữa thế kỷ qua, khángsinh đã trở thành một dược phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnhvực thuốc men thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ, với nhu cầungày càng tăng và với lượng sản xuất ngày càng lớn Hơn thế nữa, cạnh bênchất Penicillin đầu đàn, có thêm nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từnấm, và những loại kháng sinh tổng hợp với danh mục ngày càng dài làm chokho tàng kháng sinh thêm phong phú

Hiện nay trên thế giới người ta đã phát hiện trên 8000 chất kháng sinh vàmỗi năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh mới được phát hiện Trongtương lai chắc chắn còn có nhiều chất kháng sinh khác nữa cũng sẽ được tìm

ra vì đa số các vi sinh vật có khả năng tạo thành chất kháng sinh đã được

nghiên cứu cho tới nay đều chỉ thuộc về các chi Streptomyces và Bacillus

Các chất kháng sinh mà chúng ta biết, để được đưa vào sử dụng nó đãphải trải qua rất nhiều các nghiên cứu khác nhau để đảm bảo kháng sinh có độtinh sạch cao, tính chất và hoạt phổ rõ ràng để đảm bảo an toàn cho ngườidùng Với những lý do trên, việc nghiên cứu kháng sinh luôn được đẩy mạnh

và trở thành một trong những ngành khoa học quan trọng hàng đầu trong sinh

học, Y học Việc tìm hiểu về kháng sinh nói chung cũng như độ tinh sạch,tính chất và hoạt phổ của khán sinh nói riêng luôn được chú trọng đào tạocủng cố trong các trường đại học có chuyên ngành công nghệ sinh học Xuất phát từ những thực tế trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm hiểu

“Thiết kế thí nghiệm tinh sạch và đánh giá tính chất, hoạt phổ một chất kháng

sinh từ nấm Penicillium” Và đối tượng chúng tôi chọn để tìm hiểu là

Penicilin

Chương I : TỔNG QUAN VỀ CHẤT KHÁNG SINH

PELICILLIN & NẤM PENICILLIUM.

I Đại cương về chất kháng sinh.

Sự phát triển về vi sinh vật học nói chung, và vi sinh vật công nghiệp nóiriêng, với bước ngoặc lịch sử là phát minh vĩ đại về chất kháng sinh củaAlexander Fleming (1982) đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học: khai sinh rangành công nghệ sản xuất chất kháng sinh và ứng dụng thuốc kháng sinh vàođiều trị cho con người

Thuật ngữ" chất kháng sinh" lần đầu tiên được Pasteur và Joubert (1877)

sử dụng để mô tả hiện tượng kìm hãm khả năng gây bệnh của vi khuẩn

Bacillus anthracis trên động vật nhiễm bệnh nếu tiêm vào các động vật này

một số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác Babes (1885) đã nêu ra địnhnghĩa hoạt tính kháng khuẩn của một chủng là đặc tính tổng hợp được các hợpchất hoá học có hoạt tính kìm hãm các chủng đối kháng

Nicolle (1907) là người đầu tiên phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn của

Bacillus subtilis có liên quan đến quá trình hình thành bào tử của loại trực

khuẩn này Gratia và đồng nghiệp (1925) đã tách được từ nấm mốc một chếphẩm có thể sử dụng để điều trị hiệu quả các bệnh truyền nhiễm trên da docầu khuẩn

Mặc dù vậy, trong thực tế mãi tới năm 1929 thuật ngữ " Chất kháng

sinh" mới được Alexander Fleming mô tả một cách đầy đủ và chính thức

trong báo cáo chi tiết về penicillin

Thập kỷ 40 và 50 của thế kỷ XX đã ghi nhận những bước tiến vượt bậccủa ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ, với hàng loạt sự kiện như :

 Khám phá ra hàng loạt Chất kháng sinh, thí dụ như Griseofulvin (1939),gramicidin S (1942) , Streptomycin (1943), bacitracin (1945), cloramphenicol vàpolymicin (1947), clotetracyclin và Cephalosporin (1948), neomycin (1949),oxytetracyclin và nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954),

amphotericin B và Vancomycin (1956), metronidazol, kanamycin và rifamycin(1957)

 Áp dụng phối hợp các kỹ thuật tuyển chọn và tạo giống tiên tiến (đặcbiệt là các kỹ thuật gây đột biến, kỹ thuật dung hợp tế bào, kỹ thuật tái tổ hợpgen ) đã tạo ra những biến chủng công nghiệp có năng lực "siêu tổng hợp"các chất kháng sinh cao gấp hàng ngàn vạn lần các chủng ban đầu

 Triển khai thành công công nghệ lên men chìm quy mô sản xuất công

nghiệp để sản xuất Penicillin G (1942) và việc hoàn thiện công nghệ lên men

1.2 Cơ chế tác dụng [1]

Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay các đối tượng gây bệnhkhác - gọi tắt là mầm bệnh) của mỗi chất kháng sinh thường mang đặc điểmriêng, tùy thuộc vào bản chất của kháng sinh đó; trong đó, những kiểu tácđộng thường gặp là làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức năng điềutiết quá trình vận chuyển vật chất của màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềmtoả quá trình sinh tổng hợp protein, rối loạn quá trình tái bản ADN, hoặctương tác đặc hiệu với những giai đoạn nhất định trong các chuyển hóa traođổi chất (hình 1.1)

Hình 1.1 Vị trí tác dụng chính của một số chất kháng sinh

1.3 Đơn vị kháng sinh [1]

Năng lực tích tụ kháng sinh của chủng hay nồng độ chất kháng sinhthường được biểu thị bằng một trong các đơn vị là : mg/ml, g/ml, hay đơn vị

kháng sinh UI/ml (hay UI/g, International Unit

Đơn vị của mỗi kháng sinh được định nghĩa là lượng kháng sinh tối thiểupha trong một thể tích quy ước dung dịch có khả năng ức chế hoàn toàn sựphát triển của chủng vi sinh vật kiểm định đã chọn, thí dụ, với penicillin là sốmiligam penicillin pha vào trong 50 ml môi trường canh thang và sử dụng

Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểm định; với Streptomicin là số

miligam pha trong 1 ml môi trường canh thang và kiểm định bằng vi khuẩn

Escherichia coli).

1.4 Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu [1]

Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu là đặc tính cho thấy năng lực kìm hãm haytiêu diệt một cách chọn lọc các chủng vi sinh gây bệnh, trong khi không gây

ra các hiệu ứng phụ quá ngưỡng cho phép trên người bệnh được điều trị Đặctính này được biểu thị qua hai giá trị là:

Nồng độ kìm hãm tối thiểu (Minimun Inhibitory Concentration - Viết tắt là MIC) và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimun Bactericidal

Concentration - Viết tắt là MBC), xác định trên các đối tượng vi sinh vật gây

bệnh kiểm định lựa chọn tương ứng cho mỗi chất kháng sinh

1.5 Phổ kháng khuẩn của kháng sinh [1]

Phổ kháng khuẩn của chất kháng sinh biểu thị số lượng các chủng gâybệnh bị tiêu diệt bởi kháng sinh này Theo đó, chất kháng sinh có thể tiêu diệtđược nhiều loại mầm bệnh khác nhau được gọi là chất kháng sinh phổ rộng,chất kháng sinh chỉ tiêu diệt được ít mầm bệnh là chất kháng sinh phổ hẹp

II Chất kháng sinh penicillin.

11 Lịch sử phát hiện và sản xuất

penicillin [1]

Phát hiện tình cờ vào năm 1928 do

Alexander Fleming, khi nhận thấy một

hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm

nấm mốc Penicillium notatum có xuất

hiện hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan

xung quanh khuẩn lạc nấm

Ông đã sử dụng ngay tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng

sinh này (1929)

Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên

men bề mặt (1931) Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nỗ lựcnhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệđược hoạt tính kháng sinh của chế phẩm tinh chế và do đó vấn đề penicillintạm thời bị lãng quên

Năm 1938 ở Oxford, khi tìm lại các tài liệu khoa học đã công bố, ErnstBoris Chain quan tâm đến phát minh của Fleming và ông đã đề nghị HowaraWalter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu này Ngày 25/05/1940penicillin đã được thử nghiệm rất thành công trên chuột

1942: đã tuyển chọn được chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum

NRRL 1951 (1943) và sau đó đã được biến chủng P chrysogenum Wis Q

-176 (chủng này được xem là chủng gốc của hầu hết các chủng công nghiệp

đang sử dụng hiện nay trên toàn thế giới ); đã thành công trong việc điềuchỉnh đường hướng quá trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng

xuất hiện các trường hợp kháng thuốc và hiện tượng này ngày càng phổ biếnhơn.

Vì vậy 1959, Batchelor và đồng nghiệp đã tách ra được axit aminopenicillanic Đây là nguyên liệu để sản xuất ra hàng loạt chế phẩmpenicillin bán tổng hợp khác nhau Ngày nay trên thế giới đã sản xuất ra đượctrên 500 chế phẩm penicillin ( trong đó chỉ lên men trực tiếp hai sản phẩm làpenicillin V và penicillin G) và tiếp tục triển khai để sản xuất các chế phẩmpenicillin bán tổng hợp khác

6-Hình 2.2: Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum

III Nấm Penicilillium sản sinh penicillin và đặc điểm dinh dưỡng của chúng [6]

Những vi sinh vật sinh penicillin thuộc các giống nấm mốc penicillium

và Aspergillus Nhưng các chúng thuộc nhóm Penicillium notatum,Penicillium chrysogenum có hoạt lực cao và được dùng trong công nghiệpkháng sinh Những chủng đầu tiên được nuôi cấy bằng phương pháp bề mặttrên cơ sở chất tự nhiên tạo thành 10-15đv/ml kháng sinh

Penicilillium chrysogenum trên môi trường Raistrik tạo thành hai kiểukhuẩn lạc:

Kiểu 1: khuẩn lạc tròn trặn, các nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc

tốt và có màu xanh, theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm của những

khuẩn ty bạc trắng không có bào tử, các khuẩn ty cơ chất màu nâu, chất màukhông hòa vào môi trường.

Kiểu 2: Khuẩn lạc có những khuẩn ty màu trắng phát triển yếu, khuẩn ty

cơ chất cũng có màu nâu Khuẩn lạc kiểu 1 cho hoạt lực cao, kiểu 2 thườngxuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp Vì vậy cần phải tách những khuẩn lạckiểu 1 trên môi trường này và thường xuyên kiểm tra để chọn những khuẩnlạc có hoạt lực cao, giữ được đặc tính của giống

Các chủng penicillium nuôi cấy trên đĩa petri.

Những chủng Penicillium thường cóhoạt lực cao lại kém ổn định Đặc tính nàyđặt cho các nhà vi sinh vật một nhiệm vụkhó khăn: tạo được khả năng sinh khángsinh cao nhất, giữ được ổn định trong quátrình nghiên cứu và sản xuất Nhiệm vụnày có một ý nghĩa rất lớn trong côngnghiệp, các giống được bảo vẹ ở kệ, ởtrạng thái đông khô có thể tới 3 năm, ở đất vô trùng là 2 năm Ngày nay nhờ

di truyền học đã tạo ra được những giống ổn định, ít nhất sau 6 thế hệ khônglàm giảm hoạt tính kháng sinh

Penicillin thường biến đổi về hình thái và giảm khả năng sinh khángsinh Khi xảy ra biến đổi thì sẽ sinh ra hàng loạt những chủng mới từ giống cơbản và nhiệm vụ của các nhà vi sinh vật lúcnày là phải chọn lại những khuẩnlạc khỏe có nhiều ưu điểm, tiếp theo cần phải tiến hành những biện pháp bảoquản thích hợp.

Trong quá trình nuôi cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải quasáu giai đoạn phát triển:

1 Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ, tếbào chất chưa phân hóa Thỉnh thoảng không bào có những hạt nhỏ bắt màu

đỏ trung tính

2 Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, những hạt nhỏ trongkhông bào dần dần biến mất Ở cuối giai đọan này xuất hiện những giọt chấtbéo nhỏ

3 Giai đoạn III: Tạo thành những giọt chất béo to, không còn không bào, tếbào chất rất ưa kiềm

4 Giai đoạn IV: Xuất hiện không bào với những hạt dễ bắt màu đỏ trung tính,những hạt chất béo nhỏ hơn ở giai đọan III, tính ưa kiềm giảm

5 Giai đoạn V: Khuẩn ty có hình trống và có chứa những không bào, ở giữa

có một hoặc một vài hạt lớn Các hạt chất béo biến mất Tính ưa kiềm tiếp tụcgiảm

6 Giai đoạn VI: Khuẩn ty vẫn giữ được hình dạng hình trống nhưng khôngcòn những hạt bắt màu trung tính, các không bào bắt màu da cam hoặcmàuhồng đồng đều Các hạt chất béo không còn Xuất hiện những tế bào riêngbiệt bắt đầu tự phân

Quá trình lên men penicillin cũng thuộc vào loại lên men hai pha: phasinh trưởng (ứng với giai đoạn I, II, III) và pha sinh penicillin ( các giai đoạn

IV, V, VI )

Nguồn carbon trong lên men penicillin bằng nấm penicilliumchrysogenum có thể là glucuza, sacaroza, lactoza, tinh bột, dextrin, các axit

hữu cơ (lactic, axetic, formic), các axit amin…đường lactoza cho hiệu xuấtpenicillin cao nhất và thường được dùng trong công nghiệp nấm thường sửdụng lactoza chậm vì vậy, trong thực tế lactoza được dùng phối hợp cùngđường khác (glucoza, sacaroza…) trong môi trường dinh dưỡng.

Trong pha lên men thứ nhất giống phát triển mạnh, sử dụng glucoza vàaxit lactic của cao ngô Sau đó lactoza mới đựoc sử dụng ( chủ yếu trong phatạo penicillin) Khi trong môi trường cạn lactoza và không bổ sung các chấtdinh dưỡng, hệ sợi nấm bắt đầu tự phân, nếu tiếp tục lên men nồng độpecicillin sẽ giảm, trong thực tế cần kết thúc trước thời điểm này

Nguồn nitơ: có thể là những hợp chất hữu cơ (axit amin, pepton, protein)

và vô cơ (amoniac, các muối amon và nitrat) Amoniac được nấm penicilliumchrysogenum đồng hóa nhanh hơn cả trong quá trình nuối cấy N-NH3 đượctạo thành từ cao ngô do phản ứng khử amin các hợp chất nitơ Nấm mốc sửdụng NNH3 trước tiên và nồng độ của chất này trong thời gian đầu tăng lên,

vì tốc độ sinh trưởng, phát triển của nấm mốc và tiếp tục giảm cho đến khi hệsợi của mốc tự phân Tốc độ sử dụng amoniac phụ thuộc nguồn carbon trongmôi trường Trong trường hợp nguồn carbon là glucoza, sacaroza hoặc nguồncarbon dễ tiêu hóa khác, amoniac sử dụng nhanh hơn khi môi trường coalactoza Nitrat được nấm mốc đồng hóa khi trong môi trường không co nguồnnitơ hữu cơ

Lưu hùynh có ý nghĩa đặc biêt quan trọng trong quá trình sinh trưởng vàsinh tổng hợp của nấm mốc nguồn lưu huỳnh thường dùng là muối sunfat củakali, natri và amon Các chất này tham gia vào tổng hợp metionin, sixtin,biotin, tiamin… hoặc trạng thái liên kết yếu là tốt hơn cả Nhiều công trìnhnghiên cứu cho biết, khi trong môi trường có mặt đồng thời L-sixtin và sufatthì lưu huỳnh của axit amin này dễ đi vào phân từ penicillin hơn lưu hùynhcủa các gốc sufat Song, dùng axit amin trong sản xuất không kinh tế cho nênngười ta thường dùng thiosufat natri (Na2S2O3) Lưu huỳnh của chất này rất

dễ di động Trong môi trường dinh dưỡng có thiosufat cùng với cao ngô hiễu

suất penicillin có thể tăng hai lần pH môi trường thích hợp cho penicilliumchrysogenum phát triển nằm trong khỏang 6-6.5 môi trường kiềm họac axithơn đều làm cho mốc phát triển chậm trong quá trình lên men pH môi trườngthay đổi tùy thuộc vào tốc độ sừ dụng các hợp chất cacbon và N-NH3.

CHƯƠNG 2: THIẾT KẾ THÍ NGHIỆM TINH SẠCH, XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT, HOẠT PHỔ CỦA PENICILLIN.

I Sơ lược quá trình sản xuất thu dịch lên men để sản xuất penicillin [6]

Công nghệ lên men sản xuất penicillin mang nét đặc thù riêng của từng

cơ sở sản xuất và các thông tin này rất hạn chế cung cấp công khai, ngay mỗibằng sáng chế thường cũng chỉ giới hạn ở những công đoạn nhất định; vì vậyrất khó đưa ra được công nghệ tổng quát chung Theo công nghệ lên men củahãng Gist-Brocades (Hà Lan), toàn bộ dây chuyển sản xuất thuốc kháng sinhpenicillin có thể phân chia làm bốn công đoạn chính như sau:

Lên men sản xuất penicillin tự nhiên (thường thu penicillin V hoặcpenicillin G)

Xử lý dịch lên men tinh chế thu bán thành phẩm penicillin tự nhiên.Sản xuất các penicillin bán tổng hợp (từ nguyên liệu penicillin tự nhiên).Pha chế các loại thuốc kháng sinh penicillin thương mại

Sơ đồ sản xuất penicillin (theo Gist-Brocades Copr (Hà Lan)).

* Phân lập và tuyển chọn chủng giống.

P.chrysogenum được bảo quản lâu dài ở dạng đông khô, bảo quản siêu

lạnh hoặc bảo quản trong nitơ lỏng Giống từ môi trường bảo quản được cấychuyền ra trên môi trường thạch hộp để hoạt hoá và nuôi thu bào tử Dịchhuyền phù bào tử thu từ hộp petri được cấy chuyển tiếp sang môi trường bìnhtam giác, rồi sang thiết bị phân giống nhỏ, qua thiết bị nhân giống trunggian và cuối cùng là trên thiết bị nhân giống sản xuất Yêu cầu quan trọngcủa của công đoạn nhân giống là phải đảm bảo cung cấp đủ lượng giống cầnthiết, với hoạt lực cao, chất lượng đảm bảo đúng thời điểm cho các công đoạn

nhân giống kế tiếp và cuối cùng là cung cấp đủ lượng giống đạt các yêu cầu

kỹ thuật cho lên men sản xuất

Trong thực tiễn, để đảm bảo cho quá trình lên men thuận lợi người tathường tính toán lượng giống cấp sao cho mật độ giống trong dịch lên menban đầu khoảng 1 - 5.109 bào tử / m3

* Nuôi cấy – lên men thu dịch.

- Chuẩn bị môi trường lên men và thiết bị:

• Chuẩn bị môi trường lên men:

Cân đong, pha chế riêng rẽ các thành phần môi trường lên men trong cácthùng chứa phù hợp Thanh trùng gián đoạn ở 1210C ( hay thanh trùng liêntục ở khoảng 140- 1460C) hoặc lọc qua các vật liệu siêu lọc rồi mới bơm vàothùng lên men

Nếu đặc tính công nghệ của thiết bị lên men cho phép, có thể pha chế rồithanh trùng đồng thời dịch lên men trong cùng một thiết bị Tất cả các cấu tử

bổ sung vào môi trường lên men đều phải được xử lý khử khuẩn trước và sau

đó bổ sung theo chế độ vận hành vô khuẩn

• Thiết bị lên men: Phải được vô khuẩn trước khi đưa vào sử dụng.Thường thanh trùng bằng hơi quá nhiệt 2,5 – 3,0 at trong thời gian 3 giờ.Đông thời khử khuẩn nghiêm ngặt tất cả các hệ thống ống dẫn, khớp nối, van,phin lọc và tất cả các thiết bị phụ trợ khác….Trong quá trình lên men luuôn

cố gắng duy trì áp suất dư trong thiết bị nhằm hạn chế rũi ro do nhiễm tạp.Không khí thường được khử khuẩn sơ bộ bằng nén đoạn nhiệt, sau đó quamàng lọc vô khuẩn hay màng siêu lọc

- Chuẩn bị môi trường nhân giống

• Chuẩn bị môi trường nhân giống: Để làm môi trường nhân giống người tacũng chuẩn bị như môi trường lên men nhưng chúng không chứa lactose (nếu

có chỉ chứa một lượng rất nhỏ), một số khoáng chất và tiền khoáng chất Mặtkhác thành phần môi trường nhân giống cần được tính toán để đảm bảo cung