Thiết kế thí nghiệm tinh sạch và đánh giá tính chất, hoạt phổ một chất kháng sinh từ nấm Penicillium

Thiết kế thí nghiệm tinh sạch và đánh giá tính chất, hoạt phổ một chất kháng sinh từ nấm Penicillium

Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày khơng phủ nhận tầm quan trọng công nghệ sinh học kinh tế quốc dân nước ta nói riêng giới nói chung Thế kỷ 21 coi kỷ ngành công nghệ sinh học, coi thời điểm lịch sử mà tầu vũ trụ mang tên ‘ công nghệ sinh học’ rời khỏi bệ phóng để bay đến tầm cao Việt Nam nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, thuận lợi cho phát triển vi sinh vật (VSV) coi kho tàng vô giá nguồn gen tự nhiên nguồn nguyên liệu để phát triển ngành công nghệ sinh học nước nhà Kể từ Penicillin Alexander Fleming phát (1929), chứng minh có tác dụng chữa bệnh (1941), kỷ qua, kháng sinh trở thành dược phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu lĩnh vực thuốc men giới, với kết ngày lạ, với nhu cầu ngày tăng với lượng sản xuất ngày lớn Hơn nữa, cạnh bên chất Penicillin đầu đàn, có thêm nhiều loại kháng sinh chiết xuất từ nấm, loại kháng sinh tổng hợp với danh mục ngày dài làm cho kho tàng kháng sinh thêm phong phú Hiện giới người ta phát 8000 chất kháng sinh năm có khoảng vài trăm chất kháng sinh phát Trong tương lai chắn cịn có nhiều chất kháng sinh khác tìm đa số vi sinh vật có khả tạo thành chất kháng sinh nghiên cứu thuộc chi Streptomyces Bacillus Các chất kháng sinh mà biết, để đưa vào sử dụng phải trải qua nhiều nghiên cứu khác để đảm bảo kháng sinh có độ tinh cao, tính chất hoạt phổ rõ ràng để đảm bảo an toàn cho người dùng Với lý trên, việc nghiên cứu kháng sinh đẩy mạnh trở thành ngành khoa học quan trọng hàng đầu sinh S/v: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Công nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá học, Y học Việc tìm hiểu kháng sinh nói chung độ tinh sạch, tính chất hoạt phổ khán sinh nói riêng ln trọng đào tạo củng cố trường đại học có chun ngành cơng nghệ sinh học Xuất phát từ thực tế trên, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tìm hiểu “Thiết kế thí nghiệm tinh đánh giá tính chất, hoạt phổ chất kháng sinh từ nấm Penicillium” Và đối tượng chúng tơi chọn để tìm hiểu Penicilin S/v: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá Chương I : TỔNG QUAN VỀ CHẤT KHÁNG SINH PELICILLIN & NẤM PENICILLIUM I Đại cương chất kháng sinh Sự phát triển vi sinh vật học nói chung, vi sinh vật cơng nghiệp nói riêng, với bước ngoặc lịch sử phát minh vĩ đại chất kháng sinh Alexander Fleming (1982) mở kỷ nguyên y học: khai sinh ngành công nghệ sản xuất chất kháng sinh ứng dụng thuốc kháng sinh vào điều trị cho người Thuật ngữ" chất kháng sinh" lần Pasteur Joubert (1877) sử dụng để mô tả tượng kìm hãm khả gây bệnh vi khuẩn Bacillus anthracis động vật nhiễm bệnh tiêm vào động vật số loại vi khuẩn hiếu khí lành tính khác Babes (1885) nêu định nghĩa hoạt tính kháng khuẩn chủng đặc tính tổng hợp hợp chất hố học có hoạt tính kìm hãm chủng đối kháng Nicolle (1907) người phát hoạt tính kháng khuẩn Bacillus subtilis có liên quan đến q trình hình thành bào tử loại trực khuẩn Gratia đồng nghiệp (1925) tách từ nấm mốc chế phẩm sử dụng để điều trị hiệu bệnh truyền nhiễm da cầu khuẩn Mặc dù vậy, thực tế tới năm 1929 thuật ngữ " Chất kháng sinh" Alexander Fleming mơ tả cách đầy đủ thức báo cáo chi tiết penicillin Thập kỷ 40 50 kỷ XX ghi nhận bước tiến vượt bậc ngành công nghệ sản xuất kháng sinh non trẻ, với hàng loạt kiện :  Khám phá hàng loạt Chất kháng sinh, thí dụ Griseofulvin (1939), gramicidin S (1942) , Streptomycin (1943), bacitracin (1945), cloramphenicol polymicin (1947), clotetracyclin Cephalosporin (1948), neomycin (1949), oxytetracyclin nystatin (1950), erythromycin (1952), cycloserin (1954), S/v: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá amphotericin B Vancomycin (1956), metronidazol, kanamycin rifamycin (1957)  Áp dụng phối hợp kỹ thuật tuyển chọn tạo giống tiên tiến (đặc biệt kỹ thuật gây đột biến, kỹ thuật dung hợp tế bào, kỹ thuật tái tổ hợp gen ) tạo biến chủng cơng nghiệp có lực "siêu tổng hợp" chất kháng sinh cao gấp hàng ngàn vạn lần chủng ban đầu  Triển khai thành cơng cơng nghệ lên men chìm quy mơ sản xuất công nghiệp để sản xuất Penicillin G (1942) việc hồn thiện cơng nghệ lên men sản phẩm khác  Việc phát hiện, tinh chế sử dụng axit - aminopenicillanic (6-APA, 1959) làm nguyên liệu để sản xuất chất kháng sinh penicilin bán tổng hợp cho phép tạo hàng loạt dẫn xuất penicilin số kháng sinh β lactam bán tổng hợp khác [1] 1.1 Định nghĩa kháng sinh.[1] Chất kháng sinh hiểu chất hoá học xác định, khơng có chất enzym, có nguồn gốc sinh học (trong phổ biến từ vi sinh vật), với đặc tính nồng độ thấp (hoặc thấp) có khả ức chế mạnh mẽ tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh mà đảm bảo an toàn cho người hay động vật điều trị 1.2 Cơ chế tác dụng.[1] Cơ chế tác dụng lên vi sinh vật gây bệnh ( hay đối tượng gây bệnh khác - gọi tắt mầm bệnh) chất kháng sinh thường mang đặc điểm riêng, tùy thuộc vào chất kháng sinh đó; đó, kiểu tác động thường gặp làm rối loạn cấu trúc thành tế bào, rối loạn chức điều tiết trình vận chuyển vật chất màng tế bào chất, làm rối loạn hay kiềm toả trình sinh tổng hợp protein, rối loạn trình tái ADN, tương tác đặc hiệu với giai đoạn định chuyển hóa trao đổi chất (hình 1.1) S/v: Vũ Xn Tạo K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá Hình 1.1 Vị trí tác dụng số chất kháng sinh 1.3 Đơn vị kháng sinh.[1] Năng lực tích tụ kháng sinh chủng hay nồng độ chất kháng sinh thường biểu thị đơn vị : mg/ml, µg/ml, hay đơn vị kháng sinh UI/ml (hay UI/g, International Unit Đơn vị kháng sinh định nghĩa lượng kháng sinh tối thiểu pha thể tích quy ước dung dịch có khả ức chế hồn tồn phát triển chủng vi sinh vật kiểm định chọn, thí dụ, với penicillin số miligam penicillin pha vào 50 ml môi trường canh thang sử dụng Staphylococcus aureus 209P làm chủng kiểm định; với Streptomicin số miligam pha ml môi trường canh thang kiểm định vi khuẩn Escherichia coli) 1.4 Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu.[1] Hoạt tính kháng sinh đặc hiệu đặc tính cho thấy lực kìm hãm hay tiêu diệt cách chọn lọc chủng vi sinh gây bệnh, không gây S/v: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Công nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá hiệu ứng phụ ngưỡng cho phép người bệnh điều trị Đặc tính biểu thị qua hai giá trị là: Nồng độ kìm hãm tối thiểu (Minimun Inhibitory Concentration - Viết tắt MIC) nồng độ diệt khuẩn tối thiểu (Minimun Bactericidal Concentration - Viết tắt MBC), xác định đối tượng vi sinh vật gây bệnh kiểm định lựa chọn tương ứng cho chất kháng sinh 1.5 Phổ kháng khuẩn kháng sinh.[1] Phổ kháng khuẩn chất kháng sinh biểu thị số lượng chủng gây bệnh bị tiêu diệt kháng sinh Theo đó, chất kháng sinh tiêu diệt nhiều loại mầm bệnh khác gọi chất kháng sinh phổ rộng, chất kháng sinh tiêu diệt mầm bệnh chất kháng sinh phổ hẹp II Chất kháng sinh penicillin 11 Lịch sử phát sản xuất penicillin.[1] Phát tình cờ vào năm 1928 Alexander Fleming, nhận thấy hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum có xuất hiện tượng vịng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm Ông sử dụng tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh (1929) Mỹ triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931) Tuy nhiên, khoảng thời gian nỗ lực nhằm tách tinh chế penicillin từ dịch lên men thất bại không bảo vệ hoạt tính kháng sinh chế phẩm tinh chế vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên S/v: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá Năm 1938 Oxford, tìm lại tài liệu khoa học công bố, Ernst Boris Chain quan tâm đến phát minh Fleming ông đề nghị Howara Walter Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu Ngày 25/05/1940 penicillin thử nghiệm thành công chuột 1942: tuyển chọn chủng công nghiệp Penicillium chrysogenum NRRL 1951 (1943) sau biến chủng P chrysogenum Wis Q - 176 (chủng xem chủng gốc hầu hết chủng công nghiệp sử dụng tồn giới ); thành cơng việc điều chỉnh đường hướng trình lên men để lên men sản xuất penicillin G (bằng sử dụng tiền chất Phenylacetic, 1944) Hình 2.1 Các tác giả giải thưởng Nobel y học năm 1945 cơng trình penicillin Penicillin xem loại kháng sinh phổ rộng, ứng dụng rộng rãi điều trị sản xuất với lượng lớn số chất kháng sinh biết Chúng tác dụng lên hầu hết vi khuẩn Gram dương thường định điều trị trường hợp viêm nhiễm liên cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn, thí dụ viêm màng não, viêm tai - mũi họng, viêm phế quản, viêm phổi, lậu cầu, nhiễm trùng máu Thời gian đầu penicillin ứng dụng điều trị hiệu Tuy nhiên, vài năm sau S/v: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá xuất trường hợp kháng thuốc tượng ngày phổ biến Vì 1959, Batchelor đồng nghiệp tách axit 6aminopenicillanic Đây nguyên liệu để sản xuất hàng loạt chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Ngày giới sản xuất 500 chế phẩm penicillin ( lên men trực tiếp hai sản phẩm penicillin V penicillin G) tiếp tục triển khai để sản xuất chế phẩm penicillin bán tổng hợp khác Hình 2.2: Sản phẩm penicillin lên men tự nhiên nhờ P.chrysogenum III Nấm Penicilillium sản sinh penicillin đặc điểm dinh dưỡng chúng.[6] Những vi sinh vật sinh penicillin thuộc giống nấm mốc penicillium Aspergillus Nhưng chúng thuộc nhóm Penicillium notatum, Penicillium chrysogenum có hoạt lực cao dùng cơng nghiệp kháng sinh Những chủng nuôi cấy phương pháp bề mặt sở chất tự nhiên tạo thành 10-15đv/ml kháng sinh Penicilillium chrysogenum môi trường Raistrik tạo thành hai kiểu khuẩn lạc: Kiểu 1: khuẩn lạc tròn trặn, nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt có màu xanh, theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm S/v: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá khuẩn ty bạc trắng khơng có bào tử, khuẩn ty chất màu nâu, chất màu khơng hịa vào mơi trường Kiểu 2: Khuẩn lạc có khuẩn ty màu trắng phát triển yếu, khuẩn ty chất có màu nâu Khuẩn lạc kiểu cho hoạt lực cao, kiểu thường xuyên cho hoạt tính kháng sinh thấp Vì cần phải tách khuẩn lạc kiểu môi trường thường xuyên kiểm tra để chọn khuẩn lạc có hoạt lực cao, giữ đặc tính giống Các chủng penicillium nuôi cấy đĩa petri Những chủng Penicillium thường có hoạt lực cao lại ổn định Đặc tính đặt cho nhà vi sinh vật nhiệm vụ khó khăn: tạo khả sinh kháng sinh cao nhất, giữ ổn định trình nghiên cứu sản xuất Nhiệm vụ có ý nghĩa lớn công nghiệp, giống bảo vẹ kệ, trạng thái đơng khơ tới năm, đất vô trùng năm Ngày nhờ di truyền học tạo giống ổn định, sau hệ khơng làm giảm hoạt tính kháng sinh S/v: Vũ Xn Tạo K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá Penicillin thường biến đổi hình thái giảm khả sinh kháng sinh Khi xảy biến đổi sinh hàng loạt chủng từ giống nhiệm vụ nhà vi sinh vật lúcnày phải chọn lại khuẩn lạc khỏe có nhiều ưu điểm, cần phải tiến hành biện pháp bảo quản thích hợp Trong q trình ni cấy chìm nấm Penicillium chrysogenum trải qua sáu giai đoạn phát triển: Giai đoạn I: Các bào tử nấm mốc nảy mầm, phát triển thành chồi nhỏ, tế bào chất chưa phân hóa Thỉnh thoảng khơng bào có hạt nhỏ bắt màu đỏ trung tính Giai đoạn II: Khuẩn ty phát triển, tế bào chất ưa kiềm, hạt nhỏ không bào biến Ở cuối giai đọan xuất giọt chất béo nhỏ Giai đoạn III: Tạo thành giọt chất béo to, khơng cịn khơng bào, tế bào chất ưa kiềm Giai đoạn IV: Xuất không bào với hạt dễ bắt màu đỏ trung tính, hạt chất béo nhỏ giai đọan III, tính ưa kiềm giảm Giai đoạn V: Khuẩn ty có hình trống có chứa khơng bào, có một vài hạt lớn Các hạt chất béo biến Tính ưa kiềm tiếp tục giảm Giai đoạn VI: Khuẩn ty giữ hình dạng hình trống khơng cịn hạt bắt màu trung tính, khơng bào bắt màu da cam hoặcmàu hồng đồng Các hạt chất béo khơng cịn Xuất tế bào riêng biệt bắt đầu tự phân Quá trình lên men penicillin thuộc vào loại lên men hai pha: pha sinh trưởng (ứng với giai đoạn I, II, III) pha sinh penicillin ( giai đoạn IV, V, VI ) Nguồn carbon lên men penicillin nấm penicillium chrysogenum glucuza, sacaroza, lactoza, tinh bột, dextrin, axit S/v: Vũ Xuân Tạo 10 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá cấp đủ nguồn thức ăn C, N, chất khoáng thành phần khác, đảm bảo cho hình thành phát triển thuận lợi pellet Sau làm ẩm môi trường đến độ ẩm định, người ta phân phối vào chúng vào dụng cụ thủy tinh (chai thủy tinh hay bình tam giác) với khối lượng 1/5 hay 1/6 dung tích dụng cụ, đậy nút đem trùng 121oC (0,5 at) 30 phút Kỹ thuật lên men: Kỹ thuật lên men bề mặt: Áp dụng từ lâu, khơng cịn triển khai sản xuất lớn Gồm phương pháp: * Lên men ngun liệu rắn (cám mì, cám ngơ có bổ sung đường lactose) * Lên men bề mặt môi trường lỏng tĩnh (phổ biến sử dụng môi trường lactose - nước chiết ngơ) • Q trình nhân giống Q trình nhân giống giống có ống nghiệm Trong nhà máy, lần cấy truyền giống, người ta thường cấy làm ống Một ống dùng kiểm tra trước sản xuất, ống dùng để sản xuất ống dùng để bảo quản Song song đó, người ta chuẩn bị bình tam giác dung tích 200 – 250 ml chuẩn bị 50 g mơi trường phần trình bày Môi trường trùng làm nguội đến 30oC Đổ 10ml trùng làm nguội vào ống giống, dùng que thủy tinh đánh cho bào tử hịa trộn với nước Bằng biện pháp vơ trùng (thực tủ nuôi cấy vô trùng) chuyển tồn vào bình tam giác lắc cho thật chuyển chúng sang tủ ấm 30 – 37oC Nuôi điều kiện chi đến bào tử nấm xuất phát triển khắp môi trường Ta gọi trình thực trình nhân giống cấp Cứ thực tiếp ta có giống cấp 2, cấp 3…cho đến đủ – 10% giống cho sản xuất S/v: Vũ Xuân Tạo 16 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá Mỗi cấp độ nhân giống từ cấp sang cấp khác, khối lượng môi trường tăng từ 10 – 15 lần trường hợp ký người ta nuôi khay Trong công nghiệp sản xuất kháng sinh nay, thuờng dùng chủng biến đổi gen Công nghệ biến đổi gen tạo hcủng siêu tổng hợp kháng sinh Theo Talaro (0993), từ chủng penicillin chrysogenum đẩu tiên có khả tồng hợp 6mg/ml, người ta có chủng biến đổi gen từ chủng gốc có khả sinh tồng hợp 85000mg/ml penicillin • Q trình lên men Đối với phương pháp lên men nguyên liệu rắn (cám mì, cám ngơ có bổ sung đường lactose), mơi trường khử trùng làm nguội đến 30oC, tiến hành trộn giống vào với tỷ lệ từ – 10% Các khay xếp chồng lên giá đỡ có khoảng cách định để thống khí thống nhiệt Q trình lên men kéo dài – ngày nhiệt độ 24 – 28oC Nấm penicillinum qúa trình phát triển thường tạo nhiệt nấm Aspergillus Tuy nhiên, để tăng cường khả phát triển sinh tổng hợp, người ta thường thổi khí quạt gió có lắp hệ thống làm Ưu điểm phương pháp đường lactose nấm mốc đồng hóa chậm nên khơng xảy tượng dư thừa đường tế bào, dịch nước chiết ngô cung cấp cho nấm mốc nguồn thức ăn nitơ, chất khoáng chất sinh trưởng, phenylalanin bị thủy phân tạo thành phenylacetic cung cấp tiền chất tạo mạch nhánh cho phân tử penicillin Khi lên men môi trường lỏng, áp dụng công nghệ bổ sung liên tục phenylacetic vào môi trường lên men, hàm lượng bổ sung phụ thuộc pH môi trường thường 0,2-0,8 kg phenylacetic/m3 dịch lên men Dung dịch lên men sau khử trùng phân phối vào khay có kích thước giống khay nuôi cấy bề mặt với môi trường bán rắn Ở đáy khay không đục lỗ phải chứa mơi trường lỏng Chiều cao dung dịch S/v: Vũ Xuân Tạo 17 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá mơi trường khay – cm Người ta tiến hành lên men khoảng thời gian – ngày nhiệt độ lên men 24 – 28oC Tiến hành lên men điều kiện môi trường lỏng này, lượng penicillin G tổng hợp tăng rõ rệt hàm lượng penicillin khác giảm Để hạn chế trình oxy hóa tiền chất, thường phải bổ sung vào môi trường lượng nhỏ axit axetic Trong kỹ thuật lên men lỏng gián đoạn không điều chỉnh pH môi trường thường tăng nhẹ, sau tương đối ổn định vào cuối trình lên men thường khoảng pH = 6,8 – 7.4 Khi sử dụng chất lactose, người ta xác định penicillin tổng hợp tích tụ mạnh mẽ môi trường nấm mốc sử dụng đường lactose có dấu hiệu cạn kiệt sợi nấm bắt đầu tự phân Vì người ta thường kết thúc trình lên men vào thời điểm hết đường lactose Kỹ thuật lên men chìm: Kỹ thuật len men chìm kỹ thuật áp dụng hầu hết cở sản xuất penicillin công nghiệp thay dần kỹ thuật lên men docó ưu đểm thường vận hành theo phương pháp lên men bán liên tục, gồm phương án lên men gián đoạn theo mẻ có bổ sung liên tục (hay bán liên tục) hay vài cấu tử kết hợp với phương án tuần hoàn lại phần hệ sợi mẻ lên men trước (hoặc khơng) Trong phương pháp lên men chìm mơi trường sử dụng môi trường lỏng, người ta dùng cao ngô, glucose, hydrol,lactose, muối amon, thiosufat, photphat kali Natri, muối sufat magie, natri, đồng… • Quá trình nhân giống Trong trình lên men chìm người ta nhân giống mơi trường lỏng Mục đích trình nhân giống thu nhận số lượng tế bào cao (thường tính tổng lượng tế bào/ml) Quá trình nhân giống bắt đầu việc chuyển giống từ ống nghiệm sang bình tam giác chứa sẵn môi trường nhân giống Người ta thường nhân giống vào bình lên men dung tích từ lít hàng S/v: Vũ Xuân Tạo 18 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá ngàn lít Nhiệt độ trình nhân giống trì khoảng 26 ± 1oC thời gian nhân giống cấp độ khoảng 72 • Q trình lên men Q trình lên men môi trường lỏng phương pháp lên men chìm để sản xuất penicillin vận hành theo phương pháp lên men hai pha: - Pha thứ nuôi thu sinh khối khoảng – ngày Trong pha hệ sợi phát triển mạnh chất dinh dưỡng dễ đồng hóa tế bào hấp thụ mạnh, tốc độ sinh sản nấm xảy nhanh, tạo thành penicillin bắt đầu - Pha thứ hai lên men thu sản phẩm Ở pha hệ sợi phát triển chậm lại, pH tăng dần đạt đến giá trị khoảng – 7,5 Trong pha penicillin tạo thành với mức độ cực đại Giống nấm mốc penicillium chrysogenum loại hiếu khí bắt buộc, nhiên q trình tổng hợp penicillin xảy điều kiện hiếu khí mạnh nên suốt trình lên men việc thổi khí điều cần thiết Trong hầu hết trường hợp, lên men, người ta thay phần lớn (hoặc hoàn toàn) đường lactose đường glucose Lượng glucose bổ sung liên tục hay bán liên tục phải giám sát chặt chẽ nồng độ glucose suốt trình vận hành pha để trì nồng độ glucose ln mức thích hợp nhằm vừa giữ khối lượng hệ sợi ổn định, vừa đảm bảo sinh tổng hợp nhiều penicillin Trong thực tiễn, để tránh xảy thiếu hụt thời glucose , người ta kết hợp bổ sung lượng nhỏ đường lactose (khi đó, chưa bổ sung kịp glucose nấm mốc tự điều chỉnh để sử dụng đường lactose nên không xảy tượng tự phân hệ sợi) Ngồi nguồn nitơ nước chiết ngơ, người ta thường sử dụng phối hợp (NH4)2SO4 để vừa cung cấp thức ăn N S, vừa sử dụng để điều chỉnh pH trình lên men (pH dịch len men ban đầu thường điều chỉnh khoảng pH = 6,5 – 6,8 dung dịch NaOH H3PO4); nồng độ NH4 + thường khống chế khoảng 0,3 – S/v: Vũ Xuân Tạo 19 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá 0,4 kg/m3 dịch lên men Chất phá bọt thường sử dụng loại dầu béo như: mỡ lợn, dầu đậu tương, dầu vừng, dầu cám…Tiền chất tạo nhánh phenylacetic lên men sản xuất penicillin G (hoặc phenooxyacetic lên men sản xuất penicillin V) bổ sung liên tục (hoặc bổ sung gián đoạn làm nhiều lần) suốt thời gian pha lên men penicillin, để trì nồng độ khoảng 0,1 – 1,0 kg/m3 dịch (nếu nấm mốc tổng hợp đồng thời nhiều penicillin khác, nhiều gây độc cho nấm tăng cường thúc đẩy trình hydroxyl hóa sản phẩm penicillin) Nhiệt độ lên men pha đầu khống chế 30oC, sau sang pha sau giữ 22 – 25oC Tốc độ sục khí khuấy trộn điều chỉnh để trì nồng độ oxy hòa tan dịch khoảng 30% Trong điều kiện thời gian lên men mẻ thường kéo dài khoảng 144 – 180 Kết thúc trình lên men người ta cố gắng lọc sớm dịch lên men, làm lạnh chuyển sang cơng đoạn trích ly tinh chế thu penicillin Đặc điểm thiết bị lên men chìm: Quá trình lên men sản xuất penicillin ngày chủ yếu tiến hành thiết bị lên men chìm chế tạo nhóm thép chịu ăn mòn CT2 với khuấy trộn kiểu tuốc-bin (gồm nhiều tầng cánh khuấy), kết hợp bố trí hệ vách dẫn dịng thùng) Cơng suất khuấy trộn tiêu hao thiết kế khoảng 3kW/m3/h Khơng khí nén vơ khuẩn cấp vào qua hệ ống phân phối kiểu vòng xoáy hay kiểu rẻ quạt đục lỗ lắp đặt sát đáy (hay phía cánh tuốc-bin) Bên thiết bị lắp đặt nhiều tầng ống trao đổi nhiệt kiểu vòng xoắn kết hợp đồng thời với trao đổi nhiệt qua thành thiết bị hai lớp vỏ, đảm bảo điều nhiệt hiệu suốt trình lên men Dung tích thiết bị phổ biến khoảng 150 – 300m3, hệ số đổ đầy thường chọn khoảng 80%V (phụ thuộc vào kỹ thuật thiết bị phá bọt) Thiết bị nhân sản xuất giống có dung tích khoảng 10%V thiết bị len men, thiết kế tương tự thường ghép cứng với thiết bị lên men Toàn thiết bị lên men sản xuất, thiết bị nhân giống lớn hệ thống trang thiết bị phụ trợ thiết kế S/v: Vũ Xuân Tạo 20 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá lắp đặt đảm bảo vệ sinh thao tác vận hành theo chế độ vơ khuẩn cao (tốt nên bố trí cho áp dụng chế độ trùng đồng thời cho toàn hệ thiết bị này) Các thơng số kiểm tra q trình lên men bao gồm: pH mơi trường, nồng độ oxy hịa tan, nhiệt độ, hàm lượng sinh khối tốc độ biến thiên lượng sinh khối, số lượng, kích thước cấu trúc pellet, nồng độ cấu tử chất, nồng độ penicillin, thành phần khí thải tiêu kiểm tra vi sinh vật Việc giám sát điều chỉnh trình lên men xây dựng sở khai thác hai kiểu tương tác trực tuyến (online control) tương tác không phản hồi theo quy luật (offline control), phụ thuộc vào khả đáp ứng hệ thiết bị có Đồng thời xu hướng máy tính hóa kiểm tra giám sát q trình lên men dần chiếm ưu sản xuất cơng nghiệp Hiệu kinh tế chung q trình lên men chìm: Năng lực sinh tổng hợp tích tụ penicillin dịch lên men kết mối tương tác đồng thời hàng loạt yếu tố cơng nghệ như: hoạt tính sinh tổng hợp chúng, công nghệ lên men áp dụng, chất lượng nguyên liệu, đặc tính thiết bị lực đáp ứng yêu cầu công nghệ thiết bị, chế độ giám sát điều chỉnh thông số công nghệ, lực kỹ vận hành công nhân Với nguồn chất glucoza lên men theo phương pháp chìm, hệ số phân bổ nguyên liệu dự tính khoảng 25% glucoza nấm mốc sử dụng để tổng hợp hệ sợi, 65% đường sử dụng để trì sống sót hệ sợi, cịn lại khoảng 10% nấm mốc sử dụng để tổng hợp penicillin Hệ số sử dụng thức ăn nitơ lưu huỳnh để tổng hợp penicillin tương ứng 20% 80% Nồng độ penicillin G dịch lên men năm 80 - 90 kỷ XX đạt khoảng 80.000 UI/ml (tương ứng suất khoảng 40 - 50 kg penicillin G/ m3 dịch lên men ) Trên quy trình để thu dịch lên men sane xuất Penicillin cơng nghiệp, quy mơ phịng thí nghiệm thực tương tự với quy mô nhỏ S/v: Vũ Xuân Tạo 21 K5 Cơng nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá II Thí nghiệm tinh thu kháng sinh penicillin Sau trình phân lập P.chrysogenum, ni cấy, lên men để thu dịch phịng thí nghiệm Dich ni cấy thu trước tinh cần trải qua khâu lọc dịch Mục đích: Penicillin sản phẩm lên men ngoại bào Vì vậy, sau kết thúc trình lên men người ta thường tiến hành lọc để giảm tổn hao phân huỷ penicillin giảm bớt khó khăn tinh chế, tạp chất tạo hệ sợi nấm tự phân Thiết bị lọc: phổ biến thiết bị lọc hút kiểu băng tải kiểu thùng quay Thông thường, người ta cần lọc lần làm lạnh dịch để chuyển sang công đoạn Chỉ trường hợp đặc biệt cần phải xử lý kết tủa phần protein lọc lại dịch lần thứ hai Hiện tượng tự phân hệ sợi nấm thường kéo theo hậu làm cho dịch khó lọc Thu hồi sinh khối nấm: Phần sinh khối nấm rửa sạch, sấy khô sử dụng để chế biến thức ăn gia súc Thí nghiệm 1: Tinh dịch lên men thu Penicillin cách sử dụng dung mơi hữu cơ.[6][8] Dụng cụ Hóa chất - Máy ly tâm – Butyl acetat, izopropanol - Thiết bị sấy chân không – Acid H3PO4, dd KOH, BuOH - Thiết bị lọc sinh học – Than hoạt tính - Thiết bị lọc than hoạt tính – Một số hóa chất khác - Nhiệt kế, máy đo pH Bước 1: Sau trình lên men sản xuất Penicillin, ta tiến hành thu dịch sau lên men giử nhiệt độ lạnh – 5oC Bước 2: Tiến hành lọc thiết bị lọc chân không thu dịch, loại bỏ sợi nấm Penicillium chrysogenum chất rắn khác Bước 3: Dịch sau lọc bổ sung thêm axit H3PO4 loãng + Chất chống tạo nhũ S/v: Vũ Xuân Tạo 22 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá Bước 4: Dịch chiết suất cách bổ sung dung môi hữu butyl acetat vào theo tỉ lệ – 10V dịch lọc/ 1V dung mơi Đem li tâm thu dịch sau trích ly lần Bước 5: Đem dịch sau trích ly lần trích ly lần dung dịch đệm pH = 7,2 – 7,5 dung dich KOH loãng Li tâm thu dịch sau trích ly lần Bước 6: Sử dụng dịch thu từ bước đem tẩy mầu loại bỏ số tạp chất khác cách dùng than hoạt tính Sau than hoạt tính tách rửa lại sử dụng thiết bị lọc hút băng tải thiết bị lọc hút kiểu thùng quay Phần than sau lọc đưa chưng thu hồi dung mơi xử lý hồn ngun, phục vụ cho thí nghiệm sau Bước 7: Dịch thu sau tẩy màu trích ly sang dung dịch KOH lỗng => chân khơng nhiệt độ thấp => bổ sung BuOH để penicillin kết tinh Bước 8: sau kết tinh tinh thể penicillin lọc tách rửa, làm khô dung môi kỵ nước izopropanol => sấy khơng khí nóng đến dạng sản phẩm bột muối penicillin Ở giai đoạn penicillin đạt độ tinh khiết 99,5 % III Thí nghiệm xác định hoạt tính kháng sinh từ dịch lên men.[2][3][4] Sử dụng chủng VSV kiểm định là: Staphylococcus aureus ATCC 25923 (Gram +) Pseudomonas aeruginosa ATCC 10145 (Gram -) Thí nghiệm 1: Xác định hoạt tính kháng sinh phương pháp khối thạch Bước 1: P.chrysogenum nuôi cấy môi trường Raistrik đĩa petri sau 5-7 ngày.Quan sát thấy có khuẩn lạc trịn trặn, nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt có màu xanh, theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm khuẩn ty bạc trắng khơng có bào tử, khuẩn ty chất màu nâu, chất màu khơng hịa vào mơi trường Bước 2: Dùng khoan nút chai khoan thỏi thạch đặt vào đĩa petri cấy sẵn VSV kiểm định S/v: Vũ Xuân Tạo 23 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Công nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá o Bước 3: Đặt vào tủ lạnh C – 5h để chất kháng sinh khuếch tán chuyển sang nuôi tủ ấm 28 – 30oC Bước 4: Đọc kết sau 24h vi khuẩn kiểm định ngày nấm kiểm định Hoạt tính kháng sinh xác đinh theo kích thước vịng vơ khuẩn: D-d (mm) D đường kính vịng vơ khuẩn, d đường kính thỏ thạch Vi khuẩn kiểm định cấy mơi trường MPA Thí nghiệm 2: Xác đinh hoạt tính kháng sinh phương pháp đục lỗ Bước 1: P.chrysogenum nuôi cấy môi trường Raistrik đĩa petri sau 5-7 ngày.Quan sát thấy có khuẩn lạc tròn trặn, nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt có màu xanh, theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm khuẩn ty bạc trắng khơng có bào tử, khuẩn ty chất màu nâu, chất màu khơng hịa vào mơi trường Bước 2: Chọn khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang môi trường dịch thể A 4H 28-30oC Bước 3: Sau 120 h nuôi đem ly tâm thu dich lên men Bước 4: Cấy VSV kiểm đinh lên đĩa petri có mơi trường MPA Bước 5: Đục lỗ đĩa petri cấy VSV kiểm định nhỏ vào lỗ 0,1 ml dich lên men Bước 6: Đặt vào tủ lạnh 4oC – 5h để chất kháng sinh khuếch tán chuyển sang nuôi tủ ấm 28 – 30oC Bước 7: Đọc kết sau 24h vi khuẩn kiểm định ngày nấm kiểm định Hoạt tính kháng sinh xác đinh theo kích thước vịng vơ khuẩn: D-d (mm) D đường kính vịng vơ khuẩn, d đường kính lỗ thạch Thí nghiệm 3: Xác đinh hoạt tính kháng sinh phương pháp khoanh giấy lọc S/v: Vũ Xuân Tạo 24 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá Bước 1: P.chrysogenum ni cấy mơi trường Raistrik đĩa petri sau 5-7 ngày.Quan sát thấy có khuẩn lạc trịn trặn, nếp nhăn rõ nét Khuẩn ty khí sinh mọc tốt có màu xanh, theo rìa khuẩn lạc có đường viền rộng 2-5 mm khuẩn ty bạc trắng khơng có bào tử, khuẩn ty chất màu nâu, chất màu không hịa vào mơi trường Bước 2: Chọn khuẩn lạc điển hình cấy chuyển sang mơi trường dịch thể A 4H 28-30oC Bước 3: Sau 120 h nuôi đem ly tâm thu dich lên men Bước 4: Khoanh giấy lọc F8 có đường kính 6mm tẩm lượng dịch lên men (1ml/10 khoanh giấy lọc) Sau sấy khơ 400C, đặt khoanh giấy lọc tẩm dịch lên men vào đĩa petri cấy VSV kiểm định Các bước cịn lại tương tự thí nghiệm IV Thí nghiệm đánh giá tính chất chất kháng sinh penicillin Thí nghiệm 1: Xác định khả bền với pH chất kháng sinh.[7][5] Bước 1: Tiến hành nuôi cấy, cấy chuyền, li tâm thu dich lên men, tinh sach thí nghiệm Bước 2: Chia dich thu sang ống nghiệm Tiến hành điều chỉnh pH dịch theo dải từ – Để nhiệt độ phòng 10 phút Bước 3: Điều chỉnh pH =7 để phù hợp với pH VSV kiểm định Bước 4: Tiến hành xác định hoạt tính phương pháp đục lỗ thí nghiệm Bước 5: Từ kết xác đinh vịng vơ khuẩn đánh giá khả bền pH penicillin S/v: Vũ Xuân Tạo 25 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá pH Hoạt tính khán sinh (D-d)(mm) Thí nghiệm 2: Xác định khả bền nhiệt chất kháng sinh penicillin.[7][5] Bước 1: Tiến hành nuôi cấy, cấy chuyền, li tâm thu dich lên men, tinh sach thí nghiệm Bước 2: Chia dịch thu sang 12 ống nghiệm - ống nghiệm đun 40 0C, 700C, 800C, 1000C 20 phút - ống nghiệm đun 400C, 700C, 800C, 1000C 40 phút - ống nghiệm đun 400C, 700C, 800C, 1000C 60 phút Bước 3: Để nguội tiến hành xác định hoạt tính phương pháp đục lỗ Thời gian Hoạt tính khán sinh (D-d) (mm) 700C 800C 40 C Đối chứng (phút) 20 40 60 Thí nghiệm 3: Định tính penicillin phương pháp sắc ký mỏng.[9] [10] Bước 1: Chuẩn bị mẫu phân tích: Chiết kháng sinh từu dịch lên men dung môi butyl acetat Bảo quản lạnh Bước 2: Chuẩn bị hệ dung môi: butyl acetat : Methanol: Axit xitric (4:1:2) KH2PO4 7% S/v: Vũ Xuân Tạo 26 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá Bước 3: Chấm mẫu phân tích: Dùng bút chì đánh dấu điểm mỏng, vị trí đánh dấu cách bờ dưới, bờ mỏng 2cm Ở bở ( vị trí xuất phát), chấm điểm cách từ 1-1.5cm, có đường kính 0.2-0.6 cm Sau lần chấm để khô chấm tiếp Bước 4: Chạy sắc ký: Đặt mỏng chấm mẫu phân tích vào bình chứa dung mơi chuẩn bị sẵn, cho dung môi không ngập vết chấm Khi dung mơi chạy đến vị trí đánh dấu nhấc mỏng khỏi bình làm khơ Bước 5: Hiện hình chất: - dùng dung dịch H2SO4 10% nhúng mỏng làm khô vào dung dịch, sau đốt mỏng bếp điện Các chất phân tích cháy vết - dùng phương pháp hình sinh hoc: dùng lớp thạch mỏng lót đáy đĩa petri, đặt mỏng làm khô lên, sau tiếp tục đổ lớp mơi trường MPA nên mặt đĩa để nuôi VSV kiểm định Để khuếch tán điều kiện 4oC, sau cho vào tủ ấm đọc kết sau 24h Bước 6: Xác đinh Rf: Rf=a/b a: Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm vết mẫu thử b Khoảng cách từ điểm xuất phát tới mức dung môi đo đường vết V Thí nghiệm đánh giá hoạt phổ penicillin từ dịch lên men phịng thí nghiệm Sử dụng phương pháp kháng sinh đồ Các chủng vi khuẩn chuẩn quốc tế: - Hemophilus influenzae NCTC 8468 ( Gram -) - Staphylococcus aureus ATCC 25923 ( Gram +) - Escherichia coli ATCC 25922 (Gram -) - Streptococcus faecalis ATCC 29212 (Gram +) - Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (Gram -) S/v: Vũ Xuân Tạo 27 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá Bước 1: Ni cấy chủng VSV kiểm định trên môi trường dinh dưỡng đặc biệt (thường môi trường thạch máu) Bước 2: Gắn đĩa kháng sinh vào đĩa thạch (đĩa kháng sinh mảnh giấy trịn có tẩm kháng sinh tẩm dịch lên men thu sau li tâm) Bước 3: Ủ tủ ấm nhiệt độ 28 - 30oC Bước 4: Đọc kết quả: sau 24 - 48 giờ, bề mặt đĩa thạch xuất vịng trịn khơng có vi khuẩn phát triển (vịng vơ khuẩn) đĩa kháng sinh Đo đường kính vịng vơ trùng để xác định tính nhậy cảm vi khuẩn với kháng sinh đó, nếu: - Đường kính ≤ 11 mm: kháng - Đường kính 12-15 mm: trung bình - Đường kính ≥ 16 mm: nhậy Các chủng VSV chuẩn QT Đường kính vịng vơ khuẩn Hemophilus influenzae NCTC 8468 ( Gram -) Staphylococcus aureus ATCC 25923 ( Gram +) Escherichia coli ATCC 25922 (Gram -) Streptococcus faecalis ATCC 29212 (Gram +) Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (Gram -) Từ bảng kết ta xác định dịch khán sinh có tác dụng với VK gram – ,hay gram + từ xác định phổ kháng sinh rộng hay hẹp Kết luận Các kỹ thuật sinh học ngày ứng dụng nhiều sản xuất kháng sinh mang lại lợi ích thiết thực để phục vụ cho sống người Hiện nay, việc tìm kháng sinh nâng cao chất lượng kháng sinh cũ mang lại hi vọng cho S/v: Vũ Xuân Tạo 28 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá cản thiện nâng cao sức khỏe người Nhờ đó, chất lượng sống người ngày tăng cao Đồng thời, việc nghiên cứu kháng mở triển vọng tương lai việc sản xuất loại thuốc có khả chữa trị nhiều bệnh nguy hiểm mà y học đại phải bó tay Bên cạnh lợi ích thiết thực mà nghiên cứu kháng sinh đem lại Trên giới lo ngại việc nhiều lồi vi khuẩn có khả kháng kháng sinh Với thời gian có hạn hiểu biết hạn hẹp sinh viên năm thứ ngành công nghệ sinh học, em trình bày phần khía cạnh kỹ thuật sản xuất kháng sinh penicillin Mong có góp ý thầy bạn Một lần em xin chân thành cảm ơn thầy giáo Ths.Trịnh Đình Khá hướng dẫn em hoàn thành tiểu luận Tài liệu tham khảo Nguyễn Văn Cách, Công nghệ lên men chất kháng sinh, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 2005 Nguyễn Lân Dũng (dịch), Thực tập vi sinh vật học, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 1983 S/v: Vũ Xuân Tạo 29 K5 Công nghệ sinh học Tiểu luận: Cơng nghệ hóa sinh GVHD: ThS Trịnh Đình Khá Nguyễn Lân Dũng, Đào Xuân Mượu, Nguyễn Phùng Tiến, Đặng Đức Trạch, Phạm Văn Ty, Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 1, NXB Khoa học kỹ thuật, Hà Nội 1972 Nguyễn Thành Đạt, K.A Vinogradova, V.A.Poltorac, Tính biến dị màng bào tử xạ khuẩn sinh chromomycin Act Aburaviensis, Microbiologia, TXL III, N05, NXB Academia cccp, 1974 Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học , Hà Nội 2006 Ts Trương Thị Minh Hạnh, Công nghệ dược phẩm, Đà Nẵng 2007 Lê Gia Hy, Luận án phó tiến sĩ sinh học, Hà nội 1994 http://www.boddunan.com/education/20-Medicine%20/1932-penicillinand-its-production.html?Surgery= Bộ y tế, Dược điển Việt Nam III, NXB Y học, 2002 10 Ministry of Helth, The Bristish Pharmacopoeia, Medical Publisher, 2009 S/v: Vũ Xuân Tạo 30 K5 Công nghệ sinh học ... ngành cơng nghệ sinh học Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành nghiên cứu tìm hiểu ? ?Thiết kế thí nghiệm tinh đánh giá tính chất, hoạt phổ chất kháng sinh từ nấm Penicillium? ?? Và đối tượng chọn... kháng sinh Theo đó, chất kháng sinh tiêu diệt nhiều loại mầm bệnh khác gọi chất kháng sinh phổ rộng, chất kháng sinh tiêu diệt mầm bệnh chất kháng sinh phổ hẹp II Chất kháng sinh penicillin 11... lên men vào đĩa petri cấy VSV kiểm định Các bước cịn lại tương tự thí nghiệm IV Thí nghiệm đánh giá tính chất chất kháng sinh penicillin Thí nghiệm 1: Xác định khả bền với pH chất kháng sinh. [7][5]