Thí nghiệm 1: Xác định khả năng bền với pH của chất kháng sinh.[7][5]
Bước 1: Tiến hành nuôi cấy, cấy
chuyền, li tâm thu dich lên men, tinh sach... như các thí nghiệm trên.
Bước 2: Chia dich thu được sang 7
ống nghiệm. Tiến hành điều chỉnh pH của dịch theo dải từ 3 – 9. Để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút.
Bước 3: Điều chỉnh pH =7 để phù
hợp với pH của VSV kiểm định.
Bước 4: Tiến hành xác định hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ như thí
nghiệm trên.
Bước 5: Từ kết quả xác đinh vòng vô khuẩn đánh giá khả năng bền pH của
penicillin.
S/v: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. 25
pH Hoạt tính khán sinh (D-d)(mm) 3 4 ... 8 9 Thí nghiệm 2: Xác định khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh penicillin.[7][5]
Bước 1: Tiến hành nuôi cấy, cấy
chuyền, li tâm thu dich lên men, tinh sach... như các thí nghiệm trên.
Bước 2: Chia dịch thu được sang 12
ống nghiệm.
- 4 ống nghiệm được đun ở 400C, 700C, 800C, 1000C trong 20 phút.
- 4 ống nghiệm được đun ở 400C, 700C, 800C, 1000C trong 40 phút - 4 ống nghiệm được đun ở 400C, 700C, 800C, 1000C trong 60 phút
Bước 3: Để nguội và tiến hành xác định hoạt tính bằng phương pháp đục lỗ.
Thời gian (phút) Hoạt tính khán sinh (D-d) (mm) 400C 700C 800C Đối chứng 20 40 60
Thí nghiệm 3: Định tính penicillin bằng phương pháp sắc ký bản mỏng.[9] [10]
Bước 1: Chuẩn bị mẫu phân tích: Chiết kháng sinh từu dịch lên men bằng
dung môi butyl acetat. Bảo quản lạnh.
Bước 2: Chuẩn bị hệ dung môi: butyl acetat : Methanol: Axit xitric (4:1:2) và
KH2PO4 7%.
S/v: Vũ Xuân Tạo K5 Công nghệ sinh học. 26
Bước 3: Chấm mẫu phân tích: Dùng bút chì đánh dấu các điểm trên bản
mỏng, vị trí đánh dấu cách bờ dưới, bờ trên bản mỏng 2cm. Ở bở dưới ( vị trí xuất phát), chấm các điểm cách đều nhau từ 1-1.5cm, có đường kính 0.2-0.6 cm. Sau mỗi lần chấm để khô mới chấm tiếp.
Bước 4: Chạy sắc ký: Đặt bản mỏng đã chấm mẫu phân tích vào bình chứa
dung môi đã chuẩn bị sẵn, sao cho dung môi không ngập quá vết chấm. Khi dung môi chạy đến vị trí đánh dấu nhấc bản mỏng ra khỏi bình và làm khô. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bước 5: Hiện hình các chất:
- dùng dung dịch H2SO4 10% nhúng bản mỏng đã làm khô vào dung dịch, sau đó đốt bản mỏng trên bếp điện. Các chất phân tích sẽ cháy và hiện vết.
- dùng phương pháp hiện hình sinh hoc: dùng một lớp thạch mỏng lót ở đáy đĩa petri, đặt bản mỏng đã làm khô lên, sau đó tiếp tục đổ 1 lớp môi trường MPA nên mặt đĩa để nuôi VSV kiểm định. Để khuếch tán trong điều kiện 4oC, sau đó cho vào tủ ấm đọc kết quả sau 24h.
Bước 6: Xác đinh Rf: Rf=a/b
a: Khoảng cách từ điểm xuất phát tới tâm của vết mẫu thử.
b. Khoảng cách từ điểm xuất phát tới mức dung môi đo trên cùng đường đi của vết.