Báo cáo thực hành hóa phân tích 2

Tiến hành thí nghiệm - Quy trình chung của sắc ký bản mỏng - Chuẩn bị mẫu chạy sắc ký Mẫu lá chứa chất diệp lục GVHD SVTHHuỳnh Thị Hồng Hoa 8 Nhóm 2 Chấm mẫu lên vạch xuất phát Xử lý

Trang 1

BÁO CÁO THỰC HÀNH HÓA PHÂN TÍCH 2

Người hướng dẫn:

Huỳnh Thị Hồng Hoa Sinh viên thực hiện: Nhóm 2

Lư Thị Thanh Hằng

Nguyễn Trọng Hữu

Nguyễn Văn Khang

Nguyễn Thảo Linh

Trà Vinh

Trang 2

NHẬN XÉT

Trà Vinh, ngày tháng năm Người hướng dẫn

Huỳnh Thị Hồng Hoa

GVHD SVTH Huỳnh Thị Hồng Hoa 2 Nhóm 2

Trang 3

Mục Lục Bài 1:

XÁC ĐỊNH TỈ LỆ HỆ DUNG MÔI CHẠY SẮC KÝ BẰNG TLC 4

I Cơ sở lý thuyết 4

II Tiến hành thí nghiệm 8

III Kết quả thí nghiệm 11

IV Tính toán 11

Bài 2: PHÂN TÁCH SẮC TỐ CAROTEN VÀ LICOPEN BẰNG SẮC KÍ BẢN MỎNG 14

I Cơ sở lý thuyết 14

II Tiến hành thí nghiệm 17

III Kết quả thí nghiệm 20

IV Tiến hành thí nghiệm 20

Bài 3: 22

GIỚI THIỆU HỆ THỐNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 22

Bài 4: XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN C TRONG MẪU THUỐC 38

I Các bước tiến hành 38

II Quy trình vận hành máy HPLC 40

III Quy trình đo mẫu 43

IV Kết quả và thảo luận 44

V Câu hỏi củng cố 44

Bài 5: GIỚI THIỆU VỀ HỆ THỐNG SẮC KÍ KHÍ - GC 45

GVHD SVTH Huỳnh Thị Hồng Hoa 3 Nhóm 2

Trang 4

GVHD SVTHHuỳnh Thị Hồng Hoa 4 Nhóm 2

Trang 5

 Bình sắc ký: Một chậu, hủ, lọ bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy

(silicagel, alumin, ) được tráng thành lớp mỏng, đều, phủ lên tấm kiếng, tấmnhôm, hay tấm plastic Chất hấp thu trên nhờ giá đỡ sulphat canxi khan, tinh bộthay một lọai polymer hữu cơ

nhau Sử dụng khoảng 1l dung dịch mẫu với nồng độ pha loãng 2-5%, nhờ một

vi quản để chấm thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phải cao hơn mộtchút so với mặt thoáng của chất lỏng chứa trong bình

tấm lớp mỏng, và lôi kéo mẫu chất đi theo nó Dung môi di chuyển càng caonhờ tính mao quản Mỗi thành phần chất sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, điphía sau mực của dung môi Vận tốc di chuyển này phụ thuộc vào các lực tươngtác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh và tùy thuộcvào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi

Trang 6

 Ưu điểm:

phân tích

mỏng

Trang 7

 Ðại lượng đặc trưng cho mức độ di chuyển của chất phân tích là hệ số di

khoảng dịch chuyển của dung môi:

Rf =

Trong đó : a là khoảng cách từ điểm xuất phát đến tâm của vết mẫu thử, tính bằng cm.

b là khoảng cách từ điểm xuất phát đến mức dung môi đo trên cùng đường đicủa vết, tính bằng cm

Trang 8

Các bước tiến hành trong sắc ký lớp mỏng

II Tiến hành thí nghiệm

- Quy trình chung của sắc ký bản mỏng

- Chuẩn bị mẫu chạy sắc ký

Mẫu lá chứa chất

diệp lục

Chấm mẫu lên vạch xuất phát

Xử lý kết quả

Trang 9

Quà trình lọc chất diệp lục để chạy sắc kí bản mỏng

Trang 10

Quá trình tách diệp lục để chạy sắc kí

 Ta thấy dung dịch được tách ra thành 3 lớp nhưng ta chỉ lấy lớp màu xanh đi chạy sắc kí.

- Chuẩn bị hệ dung môi:

hỏa

Cho vào cốc 100ml cóchuẩn bị sẵn giấy lọc

Đậy kín bằnggiấy paraphin

Trang 11

III Kết quả thí nghiệm

Ảnh sắc kí bản mỏng

Trang 12

V Trả lời câu hỏi

1 Nêu nguyên tắc chọn lựa dung môi trong sắc ký lớp mỏng

Dung môi thích hợp dùng trong sắc kí lớp mỏng sẽ là một dung môi có tính phân cựckhác với pha tĩnh Nếu một dung môi phân cực được dùng để hòa tan mẫu thử trên một

trộn lẫn vào nhau Do đó, để hạn chế sự lan tròn của các vệt mẫu, dung môi được sửdụng để hòa tan mẫu thử phải không phân cực, hoặc phân cực một phần, nếu pha tĩnhphân cực, và ngược lại

2 Tại sao khi triển khai sắc ký bản mỏng, phải cho hệ dung môi vào bình, đậy nắp bình lại và để yên cho dung môi thấm ướt hết giấy lọc?

Khi triển khai sắc ký bản mỏng, phải cho hệ dung môi vào bình, đậy nắp bình lại và đểyên cho dung môi thấm ướt hết giấy lọc vì để tránh dung môi bay hơi và coi hệ dungmôi có đồng nhất hay không Nếu hệ dung môi thấm ướt giấy lọc thì hệ dung môi đãđồng nhất

3 Hệ dung môi và tỉ lệ dung môi ảnh hưởng như thế nào đến tỉ lệ R f ?

Các hợp chất được tách ra dựa trên sự cạnh tranh của chất tan và pha động để có đượcchỗ liên kết với pha tĩnh Thí dụ, nếu silicagel được dùng như pha tĩnh, nó được xem làphân cực Cho trước 2 hợp chất có tính phân cực khác nhau, chất nào có tính phân cựclớn hơn sẽ có sự liên kết với silicagel lớn hơn và vì thế sẽ có khả năng đẩy pha động rakhỏi các chỗ liên kết Do đó, hợp chất có tính phân cực nhỏ hơn sẽ di chuyển lên cao

Trang 13

một dung môi phân cực hơn hoặc là một hỗn hợp các dung môi, nó sẽ có khả năng đểđẩy các chất tan ra khỏi chỗ liên kết với silica gel, và tất cả các hợp chất trên bản sắc kí

sẽ dịch chuyển lên cao hơn

kí Thay đổi độ phân cực của pha động sẽ không làm các hợp chất có thứ tự di chuyểnngược lại trên bản sắc kí Nếu muốn có một thứ tự ngược lại trên bản sắc kí, một pha

Trang 14

Bài 2:

PHÂN TÁCH SẮC TỐ CAROTEN VÀ LICOPEN

BẰNG SẮC KÍ BẢN MỎNG

I Cơ sở lý thuyết

1 Giới thiệu về đu đủ

Là loại cây cao 6 – 7 m, thân đứng thẳng có phân nhánh hoặc không phânnhánh, vỏ mang nhiều sẹo của cuống lá Lá chỉ có nhiều ở ngọn, lá chia 6 – 7 thùy,hình trứng, mép có răng cưa không đều Lá to, cuống rỗng dài 30 – 50 cm, gân lá hìnhchân vịt

Hoa màu trắng nhạt hay xanh, mọc ở kẻ lá Hoa cái có tràng nhiều hơn tràngcủa hoa đực mọc thành chùm ở kẻ lá Cụm hoa ñực phân nhánh nhiều, cụm hoa cái chỉ

có 2 đến 3 hoa Sau 1 tháng hoa thụ phấn Lá mang hoa rụng sẽ để lại sẹo trên cây.Quả thịt dầy mọng, ở giữa rỗng có nhiều hạt hình trứng

Đu đủ không chịu được xứ lạnh, thích hợp với đất khô xốp, nhiều mùn, pháttriển rất tốt ở vùng nhiệt đới

a Thành phần hóa học:

Trong đu đủ chín có 19 loại carotenoit chủ yếu cryptoxanthin (48%), caroten(30%),cryptoflavine (13%)

Trang 15

Có thể tóm tắt thành phần hóa học của 100g đu đủ chín:

2 Sơ lược về licopen và β-caroten

rộng rãi trong giới động vật và thực vật

Trang 16

 Oxi hóa với axit cromic các nhóm metyl mạch nhánh thành các nhómcacbonyl

n- hexan, heptan

cho cơ thể

các bệnh mãn tính liên quan ñến các gốc tự do như bệnh ung thư, bệnh tim mạch

chín, thực ra ñiều này chỉ ñúng với các vitamin tan trong nước, còn đối với caroten là chất tan trong dầu và được bao bọc bởi các bao sợi cơ của tế bào rau quả

Trang 17

nên việc nấu chín sẽ giúp giải phóng nhiều β-caroten hơn Kể từ năm 1980 các nhàdinh dưỡng nhận thấy β-caroten không chỉ đơn thuần là tiền vitamin A mà β-caroten còn được biết là một chất chống oxi hóa tế bào và chức năng này hoàn toànñộc lập với cơ thể cung cấp vitamin A.

kém phân cực như ete dầu hỏa, heptan, n – hexan

lycopen được kiểm nghiệm là rất hữu hiệu trong việc ngăn chặn các oxygen đơntrong cơ thể của con người một cách rất hiệu quả

ung thư phổi, dạ dày, trực tràng

Trang 18

- Trong quả cà chua màu đỏ licopen thường được tập trung ở vỏ, khi nấu chín càchua mới giải phóng được licopen Vì vậy khi ăn cà chua chín không nên ăn sống

mà phải nấu chín và ăn cả vỏ

và bảo vệ gan khỏi bị tổn thương Licopen là một caroten cơ thể con người khôngthể tự tổng hợp được mà phải lấy từ thức ăn

II Tiến hành thí nghiệm

1 Chuẩn bị dịch các chất màu ( dịch đu đủ chín)

- Đu đủ chín bổ ra bỏ vỏ và hạt, nghiền nhỏ thu được dịch đu đủ chín Lấy 30gdịch đu đủ chín thêm 45ml etanol 96% - -Khuấy mạnh trong 4-5 phút

- Lọc lấy bã đu đủ chín trên giấy lọc cho vào cốc them 30ml ete dầu hỏa khuấymạnh trong 2-3 phút cho sắc tố tan vào ete dầu hỏa

- Lọc lấy dung dịch bằng bình lọc chân không

- Chuyển dịch lọc sang cốc cho bay hơi dung môi ete dầu hỏa 12 giờ được chấtmàu carotene của đu đủ chín

2 Chạy sắc kí bản mỏng với dịch chất màu của đu đủ chín

a Chuẩn bị bản mỏng

- Cắt bản mỏng ra thành những bản nhỏ có kích thước 2 x 8 cm từ bản mỏng muatrên thi trường đã được tráng silicagel có kích thước 20 x 29 cm để phân tíchnhanh

- Dùng bút chì vót nhọn vạch mức xuất phát cách mép dưới bản mỏng 1,5cm mứctiền tuyến dung môi cách mép trên bản mỏng 1cm

Trang 19

b Lựa chọn dung môi

- Một số hệ dung môi chạy bản mỏng với dịch đu đủ chín, cà chua chín, cà rốt( dịch chưa tinh khiết)

mỏng

Tỉ lệ

Ete dầu hỏa

c Chuẩn bị mao quản

- Mao quản có chiều dài 7cm, đường kính 1,5-1,6 mm, mao quả dung để hút dungdịch chấm lên bản mỏng yêu cầu mao quản phải có đường kính bé hơn, với kíchthước này quá lớn để lấy mẫu đu đủ chạy bản mỏng các vết mẫu sẽ rất to làmcho kết quả không chính xác

- Để có đầu mao quản nhỏ cần phải vuốt nhọn mao quản bằng cách: Hai tay cầmhai đầu ống, đặt phần giữa ống lên ngọn lửa đèn cồn, vừa hơ vừa xoay tròn đềuống đến khi đoạn giữa mao quản trở nên mềm dẻo, đưa ống ra khỏi ngọn lửa,dùng hai tay kéo hai đầu ống dang ra hai phía

- Khi đó phần ống mao quản ở giữa trở nên nhỏ và hẹp hơn Ống mao quản cứnglại, bẻ ống ra làm đôi ở chỗ đã được kéo nhỏ

d Đưa mẫu lên bản mỏng

- Hòa tan hết lượng dịch chất màu của đu đủ bằng 1 ml ete dầu hỏa Dùng maoquản đã vuốt nhọn nhúng nhẹ phần đầu nhọ vào dung dịch mẫu đu đủ chín, lực

Trang 20

mao quản sẽ hút dung dịch đủ đủ chín vào mao quản, khi dung dich lên khoảng

6 mm thì lấy ra

- Cẩn thận nhẹ nhàng chấm phần đầu nhọn có chứa mẫu đu đủ chín lên bản mỏngtại vạch xuất phát Chạm vào và lấy mao quản ra khỏi bề mặt bản mỏng thậtnhanh để dung dịch mẫu đu đủ chín thấm vào bản mỏng tạo thành một điểm trònnhỏ vì nếu chậm lâu điểm này sẽ lan to

- Để khô dung môi ete dầu hỏa ngoài không khí khoảng 5 phút Lặp lại 3 lần nhưtrên được một bản mỏng có chấm mẫu đu đủ chín dùng để chạy sắc ký

e Chuẩn bị bình

- Cho dung môi giải li vào cốc 250ml, dung môi ete dầu hỏa: toluene : axeton trộntheo tỉ lệ 45:1:5, sau đó dùng pipet hút 30ml vào cốc, để yên 5-10 phút để bãohòa dung môi trong bình

- Bản mỏng được cầm thẳng đứng và được nhúng vào cốc chứa dung môi trongbình, khi nhúng phải cẩn thận để hai cạnh của bản mỏng không chạm vào thànhcốc, sau đó nhẹ nhàng để bản mỏng tựa vào thành cốc nghiêng khoảng 1 góc 15

độ Vị trí vết chấm dịch đu đủ nằm trên cao cách mặt thoáng của dung môikhoảng 0,5cm

- Đậy nắp cốc thật kín bằng parafine để đảm bảo không cho không khí lọt vào,theo dõi quá trình chạy sắc kí, khi dung môi lên cách tuyến dung môi 1 cm thìlấy bản mỏng ra, để bay hơi dung môi ngoài không khí 10 phút

f Hiện hình các vết chấm sau khi triển khai

Trang 21

- Các vết hiện trên bản mỏng, lấy bản mỏng ra, đậy cốc dung môi lại, dung bút chì

IV Kết quả thí nghiệm

Dịch màu của đu đủ chín thu được cũng được chạy sắc kí bản mỏng Kết quả về màusắc, hình dạng vệt

 Tiến hành thí nghiệm

Ta có: Rf

=

0.9cm

 Rf = = 0.5625 cm

 Nhận xét và thảo luận:

Tiến hành sắc kí bản mỏng đối với dịch đu đủ chín chúng tôi quan sát vệt có màu da

tinh khiết vì nếu mẫu tinh khiết sẽ cho vệt tròn sắc nét

Trang 22

Bài 3:

GIỚI THIỆU HỆ THỐNG SẮC KÝ LỎNG

HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

I Trả lời câu hỏi

1 Mô tả cấu tạo của bộ phân chính trong HPLC

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao gồm có các bộ phận cơ bản như sau:

Trang 23

Sơ đồ hệ

thống

HPLC

Trong đó:

1: Bình chứa pha động 2: Bộ phận khử khí 3: Bơm cao áp

4: Bộ phận tiêm mẫu 5: Cột sắc ký (pha tĩnh) 6: Đầu dò

7: Hệ thống máy tính có phần mềm ghi nhận tín hiệu, xử lý dữ liệu và điều khiển hệ thống.

8: In dữ liệu.

Trang 24

Cấu tạo máy HPLC trong phòng thí nghiệm

Lưu ý:

Trang 25

 Tất cả dung môi dùng cho HPLC đều phải là dung môi tinh khiết sử dùng cho HPLC Tất cả các hóa chất dùng để chuẩn bị mẫu và pha hệ đệm đều phải là hóa chất tích khiết dùng cho phân tích.

 Việc sử dụng hóa chất tinh khiết nhằm tránh hỏng cột sắc ký hay nhiễu đường nền, tạo nên các peak tạp trong quá trình phân tích.

 Trong các trường hợp trên đều dẫn đến sai kết quả phân tích.

1.3. Bơm cao áp

Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện quá trình chia tách sắc ký Bơm phải tạt được áp suất cao khoảng 250-600 bar và tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến 10ml/phút.

Trang 26

 Tiến hành kiểm tra bơm cao áp (Bơm HPLC 1525)

 Quá trình này để súc rửa hệ thống

1 Để khởi động bơm, nhấn vào nút Purge trong khung Acquisition

Trang 27

2 Purge Wizard sẽ hỏi bạn chọn những thành phần mà bạn muốn chạy Đối với thủ tục chọn Purge này bơm Nhấn Next để tiếp tục.

Trang 28

3 Màn hình chính hiển thị hướng dẫn bạn thủ bơm với một ống tiêm mồi trước tiếp tục Để làm điều này, chèn ống tiêm mồi vào van hòa-off, mở van, thu hồi một số dung môi Lặp lại quá trình này và nhấn Next để tiếp

 Nếu trong bơm có bọt khí thì ta dùng bơm tiêm để hút hệ dung môi trong

hệ thống ra

Trang 29

4 Màn hình Purge Bơm hướng dẫn bạn:

• Mở các tài liệu tham khảo hoặc (lỗ thông hơi) van

• Chọn máy bơm bạn muốn tẩy

• Lựa chọn một tốc độ dòng chảy ban đầu cho máy bơm

Thiết lập tốc độ dòng chảy đến 3 ml / phút cho mỗi bơm Nhấn Next để tiếp tục

Trang 30

5 Tùy chọn để dừng lại và tiếp tục bằng cách nhấn vào nút Stop hoặc Tiếp tục thanh Khi bơm hoàn tất, nhấn nút Next.

Trang 31

6 Đóng van và nhấn Finish để kết thúc kiểm tra bơm

Trang 32

1.4. Bộ phận tiêm mẫu

 Để đưa mẫu vào cột phân tích theo với thể tích bơm có thể thay đổi.

 Có 2 cách đưa mẫu vào cột: bằng tiêm mẫu thủ công và tiêm mẫu tự động (autosamper).

1.5. Cột sắc ký

Cột chứa pha tĩnh được coi là trái tim của của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao Cột pha tĩnh thông thường làm bằng thép không rỉ, chiều dài cột thay đổi từ 5-25cm đường kính trong 1-10mm, hạt nhồi cỡ 0.3-5µm,…

Trang 33

Chất nhồi cột phụ thuộc vào lọai cột và kiểu sắc ký.

của các chất phân tích mà người ta lựa chọn lọai đầu dò phù hợp Tín hiệu đầu dò thu được có thể là:

độ hấp thụ quang, cường độ phát xạ, cường độ điện thế, độ dẫn điện, độ dẫn nhiệt, chiết suất,…Trên

cơ sở đó, người ta sản xuất các lọai đầu dò sau:

 Đầu dò quang phổ tử ngọai 190-360nm để phát hiện UV Đầu dò quang phổ tử ngoại khả kiến (UV-VIS) (190-900nm) để phát hiện các chất hấp thụ quang Đây là lọai đầu dò thông dụng nhất

 Đầu dò huỳnh quang (RF) để phát hiện các chất hữu cơ chứa huỳnh quang tự nhiên và các dẫn suất có huỳnh quang Đầu dò DAD (Detector Diod Array) có khả năng quét chồng phổ để định tính các chất theo độ hấp thụ cực đại của các chất.

Định dạng
Số trang	55
Dung lượng	3,51 MB